【VIP专享】双向凝胶电泳

第一向等电聚焦 （IEF）
第一向胶条的平衡（ IPG strip equilibration）
第二向 SDS 电泳（SDS-PAGE）
检测染色（Detection/Staining）
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第一章 样品制备（Sample Preparation）
1.1 一般性原则：
样 品 制 备 是 双 向 电 泳 中 最 为 关 键 的 一 步， 这 一 步 处 理 的 好 坏 将 直 接 影 响 2-DE 结果。目前并没有一个通用的制备方法 ，尽管处理方法是多种多 样， 但都遵循几个基本的原则：1 ）尽可能的提高样品蛋白的溶解度 ，抽 提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3 ） 破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状 态。
目录
第一章 样品制备
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1.1 一般性原则
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1.2 样品制备程序
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1.2.1 培养细胞样品处理方法
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1.2.2 组织样品处理方法
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1.2.3 文献报道较多的裂解液配方
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第二章 第一向等电聚焦（IEF）
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2.1 IPG 胶条的水化和电泳
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2.1.1 仪器
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2.1.2 试剂
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2.1.3 实验步骤
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2.2 IPG 胶条的平衡
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三氯醋酸 －丙酮沉淀法（ TCA/acetone precipitation）提取植物树叶总 蛋白程序：
（1） 在液氮中研碎叶片； （2） 悬浮于含 1 0％三氯醋酸 （ TCA）和 0.07% ß- 巯基乙醇( 可用 D T T
替代)的丙酮溶液在－20 oC 的冰浴； （3） 让蛋白质沉淀过夜然后离心（ 4oC，4 0 , 0 0 0 g , 1 h）， 弃上清 ； （4） 重悬沉淀浮于含 0.07%β-巯基乙醇的 冰预冷丙酮溶液里 ； （5） 离心（4 oC，40,000g, 1 h） 后真空干燥沉淀； （6） 用（A）或 （B）裂解液溶解沉淀 ，离心 （4oC ，40,000g, 1h）。 （7） Brandford 法定量蛋白 ，然后分装至 Eppendof 管里保存在-78oC
温振荡 1 h， 使其充分溶解 ； （5） 4oC，40 ,000g， 离心 1 h； （6） 吸取上清并用 Brandford 法定量蛋白，然后分装至 Eppendof 管里
保存在-78oC 备用。
1.2.2 组织样品处理方法 ：
对大多数 从动物或植物组织里提取总蛋白质而言 ，同样没有一种通用 的程序 。但遵循的原则基本相同 。下面列出一种对植物树叶总蛋白的方法 。
根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂 (chaotropes), 主要包括尿素（ Urea ）和 硫 脲（ thiourea）；表面活性剂 （sufactants）， 也称去垢剂，早期常使用 NP -40 、TritonX -100 等非离子去垢剂，近几年 较多的改用如 CHAPS 与 Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂 （reducing agents ）， 最常用的是二硫苏糖醇 （D T T ）， 也有用二硫赤藓 糖醇（DTE ）以及磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入 Tris-base,蛋 白 酶 抑 制 剂 （ 如 EDTA 、 PMSF or Protease inhibitor cocktails ） 以及核酸酶 。
核酸的去除可采用超声或核酸 酶处理，超声处理应控制好条件，并防 止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的 2D 胶上 。脂类和多 糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以 采取凝胶过滤或沉淀 /重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。
因此， 处理方法必须根据不同的样品 、所处的状态以及实验目的和要 求来进行选择。
其他常用的裂解缓冲液如下： (B) 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3 -10, 1%(w/v) DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor; (C) 加入 0.3 -1% SDS 在 95 oC 煮样品 5mins ，冷却后加入至少 5 倍体积的（A）或（B）裂解液。
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1.2 样品制备程序：
1.2.1 培 养 细 胞（ culture cell） 样品处理方法 ：
培养动物组织细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接 加入裂解缓冲液 （Lysis buffer）抽提总蛋白 。裂解缓冲液有多种配方， 本实验室主要采用如下成份：
(A) 7M Urea，2M Thiourea，4％（ w / v）CHAPS ，40mM Tris- Base ， 40mM DTT，2 ％ Pharmalyte pH 3-10.
总蛋白抽提程序：
（1） 培养细胞的收集； （2） 用磷酸缓冲液（PBS ）洗 细 胞 3 次（室 温，1000g， 各 2 m i n）； （3） 将细胞分装到 1.5ml Eppendof 管中，吸干残留的 PBS； （4） 加入裂解缓冲液 （1.5x106 个细胞大约加入 100µL 裂解液 ）， 在室
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2.2.1 仪器
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2.2.2 试剂
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2.2.3 实验步骤
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第三章 第二向 SDS 电泳
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3.1 垂直 SDS-PAGE
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3.1.1 溶液
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3.1.2 灌胶步骤
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3.1.3 电泳步骤
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第四章 2-DE 胶蛋白质点的检测
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4.1 考马斯亮兰染色
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4.1.1 经典的考马斯亮兰染色程序
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4.1.2 Neuhoff 胶体考染法
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4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法

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4.2 硝酸银染色
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Appendix I Troubleshooting
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Appendix II Solutions
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2DE 分析流程：
样品制备（Sample preparation）
固相 pH 梯度胶条的水化（IPG strip rehydration）
样 品 的 来 源 不 同， 其 裂 解 的 缓 冲 液 也 各 不 相 同 。 通 过 不 同 试 剂 的 合 理 组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。 在对样品蛋白质提取的过程中，必 须考虑到去除影响蛋白质可溶性和 2DE 重复性的物质 ，比如核酸、 脂、 多糖等大分子以及盐类小分子。 大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过 高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏 I P G 胶条 ；这样都会造成 2 -DE 的 失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。