课题3 血红蛋白的提取与分离

讨论：如何测定蛋白质的分子量？ 讨论：如何测定蛋白质的分子量？ 使用SDS 使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的 SDS— 分子量时， 分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白 同时进行电泳， 同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的 电泳区带位置， 电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数 作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。 作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。 市场上有高分子量、 市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的 标准蛋白试剂出售
(2)红细胞的洗涤 (2)红细胞的洗涤 ①洗涤红细胞目的 除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 除去其中的杂蛋白， 分离纯化， 分离纯化，不可洗涤次数过少 ②洗涤操作 A、采集血样 低速短时间离心（ B、低速短时间离心（速度越高和时间越长会 使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的 效果） 效果）
(二）蛋白质的提取 1、分离生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同 一定的物理或化学的方法分离具有 物理或化学性质的生物大分子 物理或化学性质的生物大分子 2、 蛋白质分离和提取的原理 根据蛋白质各种特性的差异， 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状 和大小、所带电荷的性质和多少、 和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和 等等 吸附的性质和对其他分子的亲和力等等， 吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可 以用来分离不同蛋白质
（五）电泳： 电泳： 1、概念 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 2、原理 ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都 许多重要的生物大分子，如多肽、 具有可解离的基团，在一定的PH PH下 具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基 团会带上正电或负电 ②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 在电场的作用下， 所带电荷相反的电极移动
②试管中溶液层次 第1层（最上层）：甲苯层（无色透明） ）：甲苯层 最上层）：甲苯层（无色透明） 第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色 ）：脂溶性物质沉淀层 中上层）：脂溶性物质沉淀层（ 薄层固体） 薄层固体） 第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红 中下层）：血红蛋白的水溶液层（ ）：血红蛋白的水溶液层 色透明液体） 色透明液体） 第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色） ）：杂质沉淀层 最下层）：杂质沉淀层（暗红色）
二、实验操作 （一）蛋白质提取和分离步骤 样品处理——粗分离 样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定 粗分离——纯化 纯化——纯度鉴定 （二）操作过程 1、样品处理 (1)血液组成 (1)血液组成
①成分 血浆 血 液 血细胞 水分 固体物质 白细胞 血小板 血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等 两个a 两个a－肽链
3、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种 作用，作用结果是什么被破坏？ 作用，作用结果是什么被破坏？ 变性、变性、 变性、变性、空间结构 4、人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细 人们用鸡的红细胞提取DNA DNA， 胞提取血红蛋白的原因是什么？ 胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA DNA， 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进 DNA的提取 人的红细胞无细胞核， 的提取， 行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构 简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白 简单，
③分离 用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗 滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层， 中静置片刻后， 中静置片刻后，分出下层的红色透明液体
9、蛋白质结构的多样性 氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺 氨基酸的种类不同；数目成百上千； 序变化多端； 序变化多端；多肽链的空间结构千差万别 10、 10、生理功能 细胞和生物体的结构物质， 细胞和生物体的结构物质 ， 是人体发育和组 织更新的主要原料， 具有运输、 调节、 免疫、 织更新的主要原料 ， 具有运输 、 调节 、 免疫 、 催化等作用， 催化等作用，是一切生命活动的主要承担者
3、缓冲溶液的配制 通常由1 通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调 种缓冲剂溶解于水中配制而成。 溶解于水中配制而成 节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH 使用比例就可以制得在不同PH范围 节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围 内使用的缓冲液 4、缓冲溶液的组分分类 ①弱酸和弱酸盐组合 H2CO3 CH3COOH NaHCO3 CH3COONa
③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的 差异以及分子本身的大小， 差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分 子产生不同的迁移速度， 子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分 子的分离
3、类型 琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳 4、实例 ①应用 十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝 十二烷基磺酸钠（SDS） 胶电泳测定蛋白质分子量 ②聚丙稀酰胺凝胶 由单体丙烯酰胺和交联剂N,N 由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺 N,N引发剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网 在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网 状结构的凝胶
11、 11、相关计算 ①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不 氨基酸间脱水缩合时， 存在了， 存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨 另一端只有一个羧基（不计R 基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和 羧基）。所以对于一条多肽链说， ）。所以对于一条多肽链说 羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨 基和羧基都是一个 ②若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链,则可形成 若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链, 个肽键,脱去个n 个水分子， n - m个肽键,脱去个n - m个水分子，至有氨基 羧基各m 和 羧基各m个
③原理 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它 所带静电荷的多少以及分子的大小 静电荷的多少以及分子的大小等因素 所带静电荷的多少以及分子的大小等因素 ④ SDS作用 SDS作用 为了消除静电荷对迁移率的影响 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶 静电荷对迁移率的影响可以在凝胶 中加入SDS 中加入SDS
（三） 凝胶色谱法 1、别名：分配色谱法 别名： 2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子 概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子 质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子 质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子 筛作用， 筛作用，来进行分离 3、凝胶 ①性质：一些微小多孔的球体，内含许多贯穿 性质：一些微小多孔的球体，内含许多贯穿 微小多孔的球体 的通道 ②实例：葡聚糖、琼脂糖 实例：葡聚糖、
2003年 2标志着进入了后基因组 蛋白质组时代 后基因组和 这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代
人类基因组： DNA分子所携带的全部遗传信息 人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息
蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。 蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。 蛋白质分子的总和 主要是对蛋白质功能的研究
⑤ SDS作用机理 SDS作用机理 SDS能使蛋白质发生完全变性。 SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组 能使蛋白质发生完全变性 成的蛋白质复合体在SDS SDS的作用下会解聚成单 成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单 条肽链， 条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子 SDS能与各种蛋白质形成蛋白质 能与各种蛋白质形成蛋白质— 量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS 复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白 复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白 质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间 质分子原有电荷量。 的电荷差别， 的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的 大小
(3)血红蛋白的释放 (3)血红蛋白的释放 加蒸馏水到原血液体积 再加40 体积的甲 加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲 原血液体积， 40％ 苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加 置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（ 10分钟 速细胞破裂） 速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白 (4)分离血红蛋白溶液 (4)分离血红蛋白溶液 ①过程 将搅拌好混合液转移到离心管内， 将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min 的速度离心10 的速度离心10 min
4、凝胶色谱法的原理—分子筛效应 凝胶色谱法的原理— ①大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或 大多数凝胶是由多糖类化合物（ 琼脂糖）构成的多孔小球体， 琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿 的通道 ②当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小 当不同的蛋白质通过凝胶时， 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道， 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较 长，移动速度较慢 ③分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通 只能在凝胶外部移动，路程较短， 道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速 度较快。 度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此 得以分离
4、依据的特性 蛋白质分子量的大小 5、具体过程
（四）缓冲溶液 1、概念 在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、 在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或 稍加稀释不引起溶液PH 稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做 PH发生明显变化的作用叫做 缓冲作用， 缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液 2、作用 能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响， 能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响， PH值的影响 维持PH PH基本不变 维持PH基本不变
③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化 蛋白质可以含有一条或n条肽链、 学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结 学键（如二硫键）互相连接， 构 ④关于蛋白质相对分子量的计算： n 个氨基酸形 关于蛋白质相对分子量的计算： 条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a, a,那么 成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,那么 由此形成的蛋白质的相对分子量为n 由此形成的蛋白质的相对分子量为n ·a - (n m) ·18
C、吸取血浆：上层透明的黄色血浆 吸取血浆： D、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9 盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9 ％的氯化钠溶液洗涤 E、低速离心（低速短时间） 低速离心（低速短时间） F、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没 重复4 步骤三次，直至上清液中已没 有黄色， 有黄色，表明洗涤干净