不同时间低氧条件对人胃黏膜上皮细胞凋亡的影响张晓岩

基金项目：青海省科技厅应用基础研究项目（2010-Z-727）。

作者简介：张晓岩，男，38岁，硕士研究生，研究方向为分子免疫及高原生理。

E-mail ：zhxy6123949@yahoo．com．cn 通讯作者：杨生玺，男，49岁，教授，研究方向为高原低氧生理。

E-mail ：yangshenxi2007@yahoo．cn 不同时间低氧条件对人胃黏膜上皮细胞凋亡的影响张晓岩1，杨生玺1，李玉琴2，蒋虹2，侯成荣1，耿排力1（1青海大学医学院基础医学部，西宁810001；2青海大学附属医院）摘要：目的研究低氧条件对体外培养人胃黏膜上皮细胞株GES-1凋亡的影响。

方法建立GES-1细胞体外低氧培养模型。

在低氧处理后不同时间点（24h 、48h 、72h ）MTT 法检测存活率、电镜观察形态变化、TUNEL 染色观察细胞凋亡。

结果低氧条件作用24h 、48h 、72h 后，GES-1细胞存活率均下降（P ＜0．05），细胞凋亡指数均升高（P ＜0．05），透射电镜均观察到部分凋亡细胞。

结论低氧条件可明显抑制GES-1细胞生长并诱导其凋亡。

关键词：低氧；胃黏膜上皮细胞；凋亡中图分类号：R363．1文献标志码：A 文章编号：1002-266X （2012）48-0026-03Effects of apoptosis on human gastric epithelial cell strain-1of hypoxia at different time ZHANG Xiao-yan 1，YANG Sheng-xi ，LI Yu-qin ，JIANG Hong ，HOU Cheng-rong ，GENG Pai-li（1Departmant of Basic Medicine ，Medical College of Qinghai University ，Xining 810001，P．R．China ）Abstract ：ObjectiveTo investigate the effect of hypoxia on apoptosis in human gastric epithelial cell strain-1（GES-1）．Methods Hypoxia culture model in vitro was established to test the apoptosis in GES-1cell line．After GES-1wascultured in hypoxia circumstance for a given period of time （24h ，48h ，72h ）．The survival rate of cell and apoptosis were measured by MTT ，electromicroscope ，TUNEL staining．Results The survival rate of GES-1was decreased （P ＜0．05），but the apoptosis index was increased （P ＜0．05）in hypoxia at 24h ，48h ，72h．The transmission electron mi-croscope showed some apoptosis-like morphologic changes．ConclusionHypoxia has an obvious inhibitory effect on the cell proliferation ，and increases apoptosis of GES-1．Key words ：hypoxia ；gastric epithelial cell ；apoptosis 低氧是高海拔地区主要环境特征，低氧环境可引起机体一系列生理机能的改变，同时低氧条件也成为许多疾病发生发展过程中最基本的病理环节［1］。

本研究用人胃黏膜上皮细胞株GES-1作为离体科学研究的工具细胞，于2012年3 8月进行实验，观察实验室低氧条件对其凋亡的影响。

1材料与方法1．1细胞与试剂正常人胃黏膜上皮细胞系GES-1（北京市肿瘤研究所提供），高糖DMEM 培养液、胎牛血清（Gibco 公司），胰蛋白酶、MTT （Sigma 公司），TUNEL 试剂盒（Promega 公司）。

1．2细胞培养及处理GES-1细胞常规培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM 培养液（含青霉素100U /mL 、链霉素50μg /mL ），细胞放置于Jouan 三气培养箱内，设置缺氧条件为37ħ、5%CO 2、3%O 2、92%N 2，分别培养24h 、48h 和72h 。

1．3MTT 检测取对数生长期细胞，消化，吹打均匀后计数，调整细胞浓度至5ˑ104/mL ，在96孔培养板中加入细胞悬液，贴壁24h 后放置于Jouan 三气培养箱内的缺氧条件下培养，于24h 、48h 和72h 每孔加入MTT 溶液20μL （5mg /mL ），每组设5个复孔，37ħ继续孵育4h ，弃上清，每孔加入100μL DMSO ，振荡10min ，使结晶物完全溶解。

设置空白对照（只有DMSO ，没有细胞）。

选择490nm 波长，酶标仪检测各孔吸光度（A ）值，反复3次取平均值。

存活率=（实验组A 值－空白对照A 值）/（对照组A －空白对照A 值）ˑ100%。

1．4透射电镜观察GES-1细胞的超微结构0．25%胰蛋白酶消化细胞3min ，PBS 洗涤1次，2000r /min 离心10min ，弃上清收集细胞，4ħ、62山东医药2012年第52卷第48期2．5%戊二醛固定，1%锇酸固定，常规乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铅铀双重染色，透射电镜观察并摄片。

1．5TUNEL染色观察细胞凋亡用PBS洗涤细胞3遍。

4%多聚甲醛室温下固定25min。

PBS冲洗2次，0．2%Triton X-100溶液5min，PBS冲洗2次。

滴加标记缓冲液100μL，以保持湿润。

滴加TdT混合反应液100μL置于湿盒中，37ħ孵育60min。

甩去封闭液，2ˑSSC作用15min，PBS冲洗3次，加0．3%H2O2作用3min，PBS冲洗3次，滴加1ʒ500稀释的过氧化物酶—链亲和素复合物100μL室温反应30min，PBS冲洗3次，分别加DAB试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后滴加，显色10min左右，水洗，倒置相差显微镜观察，DAB显色后细胞核染色成棕黄色者为阳性细胞，即凋亡细胞。

光镜下连续计数500个细胞中的阳性细胞数，按以下公式计算凋亡指数（AI）。

AI=阳性细胞数/总细胞数ˑ100%。

1．6统计学方法数据以珋xʃs表示，采用SPSS 11．5软件对数据进行统计学分析，各组比较采用单因素方差分析，以P≤0．05为差异有统计学意义。

2结果2．1MTT结果GES-1细胞在低氧培养箱内24h、48h、72h时细胞存活率分别为95．33%ʃ1．57%、68．80%ʃ0．95%、47．50%ʃ0．91%，组间比较P＜0．05。

2．2电镜结果电镜下凋亡细胞皱缩，胞质致密，线粒体肿胀，细胞器密集，不同程度退变，核染色质致密，大小不一边集核膜处，可见核膜部分破裂，有凋亡小体形成。

见插页Ⅲ图14。

2．3TUNEL染色结果对照组无凋亡细胞，低氧条件作用组可见凋亡细胞的染色质浓缩、细胞核呈棕褐色。

低氧培养箱内24h、48h、72h时细胞AI 分别为8．6ʃ1．8、15．2ʃ1．9、26．0ʃ3．2，组间比较P＜0．05。

见插页Ⅲ图15。

3讨论低氧（细胞外周氧低于正常水平）使机体产生一系列代偿反应。

细胞低氧时其代谢途径改变，严重缺氧时组织、细胞可发生严重损伤，影响细胞器的结构和功能，并触发细胞凋亡机制，诱导细胞凋亡，甚至导致器官发生功能障碍、功能衰竭。

本研究发现，在实验室低氧（3%O2）条件下，随低氧时间延长GES-1细胞存活率逐渐下降。

Zhu等［2］将BM-SCS置于低氧（3%O2）及无血清条件下培养，结果细胞中Caspase-3活性增高，发生依赖Caspase-3的凋亡。

研究还发现，低氧下HIF-1α去磷酸化发挥促凋亡作用［3］。

此外，Bcl-2家族成员Bax可促进低氧诱导的凋亡［4］，Bax能引起线粒体外膜穿孔，导致细胞色素C诱导的凋亡。

研究中还发现凋亡细胞结构发生明显变化，细胞皱缩，胞质结构致密，线粒体肿胀，细胞器密集，不同程度退变，这也说明线粒体结构与功能的稳定性发挥着细胞凋亡“主开关”的作用［5］，同时低氧使细胞线粒体产生的活性氧代谢物（ROS）增加，对应激诱导的凋亡起重要作用，并受Bcl-2家族成员的影响，新近发现的Bcl-2家族成员Nip3也起着促凋亡作用，它是这个家族中目前发现的能被低氧诱导的惟一分子［6］，而且细胞损伤能通过凋亡蛋白引起线粒体外膜穿孔，导致细胞色素C 诱导的凋亡［7］。

但幽门螺杆菌作用GES-1引起XI-AP表达上调而抑制凋亡［8］。

所以特定因素对细胞凋亡的调控直接影响细胞的下一步病理转归。

低氧条件下可产生大量自由基、活性氧（ROS），导致线粒体质膜脂质过氧化、蛋白质硝化、损伤线粒体膜结构和电子链酶复合物，同时造成线粒体DNA （mtDNA）损伤，使氧化磷酸化减弱或不能进行，ATP 产生迅速减少，质膜钙泵失效，钙离子在线粒体大量积聚触发进一步线粒体损伤而诱导凋亡。

同时氧自由基的产生、细胞内钙超载、细胞膜损伤、高能磷酸酯耗竭、线粒体失功、渗透压改变、细胞内pH下降等一系列病理生理改变均可引起细胞凋亡。

本研究我们虽然观察了低氧对GES-1细胞凋亡的影响，但要了解低氧在凋亡通路上的作用还需更深入的研究。

参考文献：［1］Semenza GL，Agani F，Feldser D，et al．Hypoxia，HIF-1，and the pathophysiology of common human diseases［J］．Adv Exp Med Bi-ol，2000，475（2）：123-130．［2］Zhu W，Chen J，Cong X，et al．Hypoxia and serum deprivation-in-duced apoptosisi in mesenchymal stem cell［J］．Stem Cells，2006，24（2）：416-425．［3］Suzuki H，Tomida A，Tsuruo T．Dephosphorylated hypoxia-induc-ible factor1alpha as a mediator of p53-dependent apoptosis during hypoxia［J］．Oncogene，2001，20（41）：5779-5788．［4］Cui LY，Yang S，Zhang J．Protective effects of neutrophil gelati-nase-associated lipocalin on hypoxia/reoxygenation injury of HK-2 cells［J］．Transplant Proc，2011，43（10）：3622-3627．［5］Haddad JJ．The role of Bax/Bcl-2and procaspase peptides in hypox-ia/reperfusion-dependent regulation of MAPK（ERK）：discordant proteomic effect of MAPK（p38）［J］．Protein Pept Lett，2007，14（4）：361-371．［6］Zeng YM，Cai KJ，Chen XY，et al．Effect of chronic intermittent hypoxia on the expression of Nip3，cell apoptosis，beta-amyloid pro-tein deposit in mice brain cortex［J］．Chin Med J（Engl），2009，72山东医药2012年第52卷第48期122（1）：68-73．［7］Clusin WT．Calcium and cardiac arrhythmias：DADs，EADs，an-dalternans［J］．Crit Rev Clin Lab Sci，2003，40（3）：337-375．［8］宗红，李建生，张金平，等．幽门螺杆菌对胃上皮细胞株GES-1凋亡及XIAP表达的影响［J］．山东医药，2005，45（31）：11-12．（收稿日期：2012-09-03）82山东医药2012年第52卷第48期。