细胞融合技术的发展过程
第四章细胞融合
2、细胞融合的基本过程
（1）细胞在促融剂或正弦电场 作用下凝集，彼此靠近； （2）两个相邻细胞之间的质膜 相互融合，随后两个亲本细 胞质膜上的受体、糖蛋白、 糖脂等质膜成分也在融合后 的质膜上重新分布； （3）细胞质发生融合； （4）细胞核融合，形成单核融 合细胞。
动植物细胞的融合过程
植物细胞融合过程
生物种类细胞来源成功年代烟草两个种间苷蓝青菜大豆马唐草矮牵牛龙面花大麦花生大麦大豆小麦矮牵牛油菜大豆油菜大豆玉米大豆大豆野豌豆大麦蚕豆大豆草香木犀酵母菌鸡大豆烟草大豆秋水仙人胡萝卜番茄马铃薯人小鼠叶叶叶根愈伤组织叶叶花瓣种子种子叶悬浮细胞叶花瓣叶悬浮细胞叶悬浮细胞叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶根悬浮细胞叶原生质体血红细胞悬浮细胞叶悬浮细胞叶腹水癌细胞原生质体叶根尖纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞1972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972几种细胞融合成功的例子植物融合细胞成长状态对比右瓶为地面融合的细胞左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞动物细胞融合实验使用的小白鼠白化豚鼠hartley豚鼠?4意义和应用?1可以避开生殖细胞的受精过程在亲缘关系较远甚至毫无亲缘关系的物种间实现基因转移创造出自然界中没有的新物种
（1）将两种不同亲本细胞各5×l06混匀； （2）离心沉淀，吸去上清液； （3）加1ml 50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；
（4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液；
（5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养 液至 5ml，37℃的CO2培养箱中培养。
叶——叶 叶——根 愈伤组织——叶 叶——花瓣 种子——种子 叶——悬浮细胞 叶——花瓣 叶——悬浮细胞 叶——悬浮细胞 悬浮细胞——悬浮细胞 叶——根 悬浮细胞——叶 原生质体——血红细胞 悬浮细胞——叶 悬浮细胞——叶 腹水癌细胞——原生质体 叶——根尖 纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞
细胞融合技术及进展
细胞融合技术及进展摘要：细胞工程是四大生物工程之一，细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域不断扩大。
本文综述了关于细胞融合的基本理论并重点综述了细胞融合的基本方法及最新进展。
关键字：细胞融合生物技术方法综述前言细胞工程是生物工程主要组成之一，出现于20世纪70年代末至80年代初，是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。
细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学，特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。
细胞融合使细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合，使远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。
它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，扩大了遗传物质的重组范围。
但融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性，致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等不符合育种要求的性状出现，直接利用杂种细胞作育种材料目前还有许多障碍。
细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂，投资少，有利于广泛开展研究和推广，有着重大的实践意义，正得到科学界的日益重视。
随着细胞融合技术研究的不断深入，细胞融合技术的发展前景及其产生的影响将日益显著。
1关于细胞融合的基本理论及概念所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下，两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization) 。
如取材为体细胞则称体细胞杂交(somatic hybridization)。
使用培育技术进行细胞融合培养的步骤详解
使用培育技术进行细胞融合培养的步骤详解细胞融合培养是一种用于生物研究和实际应用的重要技术，它可以将两个不同种类的细胞融合为一个细胞，从而产生具有新功能和特性的细胞。
本文将详细介绍使用培育技术进行细胞融合培养的步骤。
第一步：准备工作在进行细胞融合培养之前，我们需要准备一些必要的工具和试剂。
首先，需要培养基、胎牛血清和含有抗生素的苏木素液体。
其次，需要从细胞库中获取两种不同种类的细胞，并且保证它们在培养基中的生长状态良好。
最后，需要准备聚乙二醇融合液，用于促进细胞的融合。
第二步：细胞预处理在细胞融合培养之前，我们需要对细胞进行预处理，以增加它们融合的概率。
首先，将两种细胞分别接种在含有胎牛血清的培养基中，并将其培养至密度适当。
然后，对细胞进行酶消化，以去除细胞表面的附着物和黏附物质，使细胞更容易融合。
最后，将细胞重新接种至含有胎牛血清和抗生素的培养基中，并继续培养一段时间，使其恢复生长。
第三步：细胞融合在细胞预处理完成后，我们可以开始进行细胞融合了。
首先，将两种细胞按照一定的比例混合在一起，加入聚乙二醇融合液并轻轻搅拌均匀。
聚乙二醇融合液具有较高的渗透性，可以破坏细胞膜，使细胞间的质膜融合。
然后，将混合后的细胞培养在恒温恒湿的培养箱中，使其进行融合。
在融合过程中，需要注意温度和时间的控制，以确保细胞融合的有效性。
第四步：筛选和分离经过一段时间的培养，我们将进行细胞筛选和分离，以得到融合细胞。
首先，使用苏木素染色剂对细胞进行染色，然后在显微镜下观察细胞的形态和特性，筛选出已经融合的细胞。
随后，使用稀释法将融合细胞进行稀释，使其逐渐分离。
最后，将分离后的细胞重新接种至含有胎牛血清和抗生素的培养基中，并继续培养以增加细胞的生长和增殖。
第五步：鉴定和应用在细胞融合培养的最后一步，我们需要对融合细胞进行鉴定和应用。
首先，使用细胞标记技术对融合细胞进行标记，以确定其细胞类型和特性。
然后，通过细胞功能实验和基因表达分析等方法，对融合细胞的功能和特性进行评估。
细胞生物学实验手册：细胞融合实验原理及步骤
实验十一细胞融合【实验目的】掌握细胞融合原理、应用PEG融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。
【实验用品】一、材料鸡红细胞二、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片三、试剂 50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)【实验内容】一、原理细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。
人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。
由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。
细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和电脉冲。
目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。
PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。
二、方法(1)取新鲜鸡血以0.85％生理盐水制成10％的悬液。
(2)称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml预热的Hanks液混匀制成50％的PEG溶液。
放入37℃水浴中待用。
(3)取上述10％的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，再加入5ml Hanks液混匀，然后以1,000rpm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。
(4)取上述50％PEG溶液0.5ml，在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。
待PEG全部加入后静置1分钟左右。
此全部过程都要求在37℃水浴内进行。
细胞融合实验原理
融合过程
相关实验溶液的配制
Alsever溶液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g， NaCl 0.42g，溶于100ml双蒸水中。 GKN溶液：NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4· 2H2O 1.77g，NaH2PO4· H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚红 0.01g，溶于1000ml水中。 50％PEG溶液：称取一定量的PEG（WM＝4000） 放入烧杯中，沸水浴加热，使之熔化，待冷却至 50℃时，加入等体积预热至50℃的GKN溶液，混 匀，置37备用。
实验操作
5. 取以上细胞悬液0.2ml放入1ml的EP管中，然后放入 37℃水浴中预热，同时将50％PEG液一并预热20min； 6. 20min后将0.2ml的50％PEG溶液逐滴沿离心管壁加 入到0.2ml细胞悬液中，边加边摇匀，然后放入37℃ 水浴中保温20min； 7. 20min后，加入GKN溶液1ml，静止于水浴中20min 左右； 8. 1500r/min离心5min，弃去上清，加GKN溶液再离心 1次； 9. 弃去上清，加入GKN液少许，混匀，取少量悬浮于 载玻片上，加入詹纳斯绿染液，用牙签混匀，3min 盖上盖玻片，观察细胞融合情况。
细 胞 融 合
实 验 原 理
两个或两个以上的细胞合并成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合，也称细 胞杂交，在自然情况下的受精过程即属这种现象。 诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。 1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台 病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多 病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而 就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。 2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离 子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。 PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细 胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形 成一个打的双核或多核融合细胞。 3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用 高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。 细胞融合技术在基因定位、基因表达产物、肿瘤诊断核治疗、生物新品种培育及 单克隆抗体技术等领域有着非常广泛的应用前景。单克隆抗体技术就是通过细胞融合 技术发展起来的，在生命科学研究核应用方面产生了重大影响。
细胞融合(cell fusion)主要方法和操作步骤
细胞融合(cell fusion)主要方法和操作步骤两个或两个以上的细胞合并成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合，也称细胞杂交，在自然情况下的受精过程即属这种现象。
诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。
1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。
病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。
2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。
PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。
3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。
细胞融合技术在基因定位、基因表达产物、肿瘤诊断核治疗、生物新品种培育及单克隆抗体技术等领域有着非常广泛的应用前景。
单克隆抗体技术就是通过细胞融合技术发展起来的，在生命科学研究核应用方面产生了重大影响。
实验操作在公鸡翼下静脉抽取2ml鸡血，加入盛有8ml的Alsever液中，使血液与Alsever液的的比例达1∶4，混匀后可在冰箱中存放一周；取此储存鸡血0.2ml加入0.8ml的0.85％生理盐水，充分混匀，1500r/m in离心5min，弃去上清，加入1ml的0.85％生理盐水，重复上述条件离心两次。
最后弃去上清，加GKN液0.8ml，离心；弃去上清，加入0.3ml的GKN溶液，制成细胞悬液；（也可以用血球计数板计数，用GKN液将其调整为106个/ml）；取以上细胞悬液0.2ml放入1ml的EP管中，然后放入37℃水浴中预热，同时将50％PEG液一并预热20min；20min后将0.2ml的50％PEG溶液逐滴沿离心管壁加入到0.2ml细胞悬液中，边加边摇匀，然后放入37℃水浴中保温20min；20min后，加入GKN溶液1ml，静止于水浴中20min左右；1500r/min离心5min，弃去上清，加GKN溶液再离心1次；弃去上清，加入GKN液少许，混匀，取少量悬浮于载玻片上，加入詹纳斯绿染液，用牙签混匀，3min盖上盖玻片，观察细胞融合情况。
PEG诱导细胞融合
PEG的最适使用条件
• 细胞的融合效果与PEG的相对分子质量及其体积分 数成正比，但PEG的相对分子质量越大、体积分数 越高，对细胞的毒性也就越大。实验时常选用PEG 相对分子质量为4000-6000，体积分数为50%时， 细胞破碎较少，融合率较高。
其他影响细胞融合的因素
• 钙离子可以使带微弱负电荷的PEG与细胞膜表面分 子相互作用，引起细胞膜表面电子分布的改变，从 而使接触处的质膜形成局部融合，出现凹陷，构成 原生质桥，成为细胞间通道并逐渐扩大，直到两个 细胞全部融合。当钙离子浓度为50mmol/ml时，融 合效果最好。
• ①电脉冲诱导细胞融合技术
• ②激光融合技术
• ③空间细胞融合技术
• ④离子束细胞融合技术
• ⑤非对称细胞融合技术
• 纵观细胞融合技术的发展历史, 细胞融合技术的不断改进 一方面表现在融合剂上, 另一方面体现在新方法上, 再者 体现在融合对象的不断扩展上。融合剂走过了从活病毒, 灭活病毒生物阶段到PEG 化学物质阶段; 新方法不断涌 现, 从生物学, 化学方法,物理学方法过渡到各种方法的综 合应用乃至应用空间技术。融合对象从动物,植物到微生 物,从种内扩展到种间, 从近缘扩展到远缘。每一次技术 上的更新和改进都会带来应用上的巨大革命和创新, 达到 为人类服务的目的。
2.PEG作为促融剂引起的革命、
由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作 复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,科学家们又尝 试寻找比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备 和控制、活性稳定、使用方便的化学PEG加拿大华 裔科学家高国楠等( 1974 年) 的研究取得重大突破他 发现高分子量的聚乙二醇( PEG) 在Ca2 +存在时能 促使植物原生质体融合显著提高融合率从而迅速推 动了原生质体技术的基础研究和应用研究。至此应 用原生质体和发展操纵它们的方法已引起实验生物 学的“无声革命”。
细胞融合与单克隆抗体
优点： 外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过
程直观； 整合率高
缺点： 设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求 低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性
2、胚胎干细胞（ES细胞）法
ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜 能细胞系。
1．核受体细胞的准备 去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。 卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处理， 从输卵管冲出体内成熟的卵母细胞。二是从屠宰场收集卵巢，吸出 滤泡中的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受 体。
2．核供体细胞的准备 在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍体，
该细胞必须保持有供体动物完整的基因组； 其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细
胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新完成 从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。
供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外，核供 体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。
3．细胞核移植 常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注射。胞质
细胞融合和单克隆抗体 胡丽芳
一、细胞融合
细胞融合，又称体细胞杂交或细胞杂交，是指在离体条件 下用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞 通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。 杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信 息的细胞。 细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生。
广泛应用于单克隆抗体制备、生物的远缘杂交、新品种培 育等。
体外培养 注射到小鼠腹腔
单克隆抗体
单抗的制备过程要点：
1. 动物特异性免疫 2. 分离B淋巴细胞（B）；培养骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞
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细胞融合技术的发展过程
生物方法融合：1957年，冈田善雄意外发现仙台病毒（HVJ），能诱导悬液中小鼠艾氏腹细胞（EAC）融合。
然后Harris、Kada等用于诱导种间细胞融合，获得成功。
化学方法融合:1972年，卡尔森首先用硝酸钠进行烟草两个种的细胞原生质体的融合，1974年K a o等，首先发现聚乙二醇（PEG）能诱导植物细胞原生质体融合产生杂交细胞。
1975年Pentecorvo发现P E G也能帮助哺乳类动物细胞的融合，1976年，Davidson更进一步证实这一结果，并且认为其具有简单快速、高效率等优点。
因而，1975年之后聚乙二醇就逐渐取代了仙台病毒。
电融合法电融合法:70年代未期和80年代初期发展起来的一种新的细
胞融合方法。
1970年，Senda首先应用电脉冲，通过微电极在显微镜下使植物细胞融合，奠定电融合技术基础。
激光诱导卵细胞融合:激光诱导方法是最新的细胞融合方法，该法为张闻迪等人在1988年首先应用，他们利用激光微束的单色性、高功率密度、短脉宽和极小的作用范围等特点。
对泥鳅受精卵进行融合试验，获得成功，且融合后的细胞可存活发育，经卵裂期、囊胚期、原肠期、孵化期、直至幼鱼。
整个过程可通过显微镜观察，还可同时由电视摄象监视器观察和进行照相记录。
典型试题解析
试题：回答下列关于细胞工程的问题。
（1）如图是细胞融合的示意图，
据图回答。
①若A、B是植物细胞，则在细胞融合之前已用处理过。
用
聚乙二醇诱导融合之后，体系中会出现未融合的细胞，原因
是。
②若A是小鼠骨髓瘤细胞，B是受到抗原刺激的B淋巴细胞，用灭活的
仙台病毒诱导融合之后，需要用特定的选择性培养基进行筛选。
在该培
养基上，细胞和的细胞都会
死亡，只有融合的杂种细胞（杂交瘤细胞）能够生长。
杂交瘤细胞不止
一种，原因是。
（2）植物组织培养有一项应用是培育“脱毒苗”，动物细胞培养需要
创造“无菌无毒的环境”，脱毒苗中的“毒”是指，“无菌无毒环境”中的“毒”是指。
（3）制备单克隆抗体有一项重要的应用是作为诊断试剂，例如“早早
孕诊断试剂盒”。
“早早孕诊断试剂盒”通过检测被测试者尿液中人绒
毛膜促性腺激素的含量，从而判断被测试者是否怀孕，其起检测作用的
核心物质是。
（4）动物的培育过程中需要进行细胞核移植，早期的细胞
核移植操作会将供体细胞的细胞核取出，再植入去核的卵母细胞，但取
出细胞核的过程会对细胞核造成一定的损伤。
后期的核移植操作是直接
将供体细胞注射到去核卵母细胞外的透明带位置，再通过电刺激的方法
诱导，从而实现供体细胞核进入去核卵母细胞。
【答案】：（1）①纤维素酶和果胶酶融合的成功率不是百分之
百②未融合的亲本融合的具有同种核小鼠脾脏中分离
的B淋巴细胞是多种
（2）病毒代谢废物
（3）抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体
（4）克隆供体细胞膜与去核卵母细胞膜融合
【解析】：植物体细胞杂交技术：就是将不同种的植物体细胞原生质体
在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术；单克隆抗体的制备过程：首先用特定抗原注射小鼠体内，使其发生免疫，小鼠体内产生具有免疫能力的B淋巴细胞，再利用动物细胞融合技术将
B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，经过两次筛选获得产生特定抗体的杂交
瘤细胞。
据图分析，图示A细胞与B细胞融合，形成的C是正在融合的
细胞，D是杂种细胞。