条件性敲除小鼠
CDHR2基因条件性敲除小鼠模型的构建及鉴定
CDHR2基因条件性敲除小鼠模型的构建及鉴定夏梓元;蒋华波;王洋;黄美金;陆斌【摘要】目的:构建CDHR2基因条件性敲除小鼠模型,为研究CDHR2基因的生物学功能提供条件.方法:构建CDHR2基因条件打靶载体,电转入小鼠胚胎干细胞(ES 细胞),用G418和GANC筛选阳性细胞克隆.胚胎注射阳性ES细胞入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠.嵌合体小鼠与Cre小鼠交配获得条件性敲除小鼠.分别通过PCR方法和免疫组织化学方法对CDHR2的敲除结果进行验证.结果:成功构建打靶载体,并获得6个正确同源重组的ES细胞阳性克隆.阳性ES细胞克隆注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得5只嵌合鼠.嵌合鼠再与Flp小鼠交配,获得6只阳性F1代去Neo 小鼠.去Neo小鼠与Cre小鼠杂交,获得CDHR2基因肠道特异性敲除小鼠.免疫组织化学检测表明,阳性小鼠肠道组织中的CDHR2基因被特异性敲除,而肾脏组织CDHR2基因的表达没有受到影响.结论:成功构建CDHR2基因肠道特异性敲除小鼠,为进一步研究CDHR2基因的作用奠定了基础.%Objective:To construct a CDHR2 conditional knockout mouse model, and to provide conditions for the study on biological function of CDHR2 gene.Methods:The conditional CDHR2 targeting vector was constructed and transfected into mouse embryonic stem (ES) cells by electroporation.The positive ES cells screened by G418 and GANC were microinjected into the blastocysts of C57BL/6J mice.The chimeric mice were obtained and then mated with Cre mice to obtain conditional CDHR2 knockout mice.The phenotype was analyzed by PCR and immunohistochemistry, respectively.Results:The conditional CDHR2 targeting vector was successfully constructed, with six positive clones of ES cells being obtained.The positive clones of ES cells weremicroinjected into blastocysts of C57BL/6J mice with 5 chimeric mice being obtained.The chimeric mice were mated with Flp mice, and 6 positive F1 generation mice without Neo gene were obtained.Finally, such mice were hybridized with Cre mice to obtain intestine-specific CDHR2 knockout mice.Immunohistochemistry assay showed that the CDHR2 gene in intestinal tracts of the positive mice was specifically knocked out.In contrast, the expression of CDHR2 in kidney tissue was notaffected.Conclusions:The successful construction of intestine-specific CDHR2 knockout mice has laid the foundation for provides a basis for further functional study on CDHR2 gene.【期刊名称】《中国临床医学》【年(卷),期】2017(024)002【总页数】5页(P176-180)【关键词】CDHR2;基因敲除;Cre/loxP系统【作者】夏梓元;蒋华波;王洋;黄美金;陆斌【作者单位】第二军医大学药学院生化药学教研室,上海 200433;第二军医大学药学院生化药学教研室,上海 200433;第二军医大学长海医院病理科,上海 200433;解放军成都军区昆明总医院肿瘤科,昆明 650010;第二军医大学药学院生化药学教研室,上海 200433【正文语种】中文【中图分类】R-33原钙黏蛋白(protocadherin,PCDH)家族是属于钙黏蛋白超家族中的一员，可以根据其基因结构分为集簇型PCDH和非集簇型PCDH两类[1]。
条件性敲除的原理
条件性敲除的原理（图2，3）：利用Cre／LoxP 和来自酵母的FLP—frt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型[7]。
通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“lo xP floxed”小鼠与Cre 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。
在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。
但当它与Cre 转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。
Cre 基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应，结果将一个loxP 和靶基因切除。
这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表达为前提的。
Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。
所以只要控制Cre 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度[9,10]。
在生理学研究中，为了明确某一组织或器官的功能，常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切除部分的功能。
生命科学发展到今天，人们对于生命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想仍然有效。
具体地说，就是在分子水平破坏想要研究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测相应基因的功能。
这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。
条件性基因敲除:骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因小鼠的建立和基因型鉴定
条件性基因敲除：骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因小鼠的建立和基因型鉴定郝海邦;杨承忠;岳碧松【摘要】Ncol2是新发现的参与免疫调节的重要因子,Ncol2基因骨髓细胞特异性敲除小鼠的建立,能够有针对性的研究Ncol2基因缺失后对免疫系统的影响.根据条件性基因敲除的原理,本文利用loxp转基因小鼠和在骨髓细胞特异性表达Cre重组酶的LysMcre小鼠,繁殖建立了骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因的小鼠,并提供了用鼠尾做基因型鉴定的简便方法.【期刊名称】《四川动物》【年(卷),期】2011(030)006【总页数】3页(P961-963)【关键词】条件性基因敲除;骨髓细胞;Ncol2基因;基因型鉴定【作者】郝海邦;杨承忠;岳碧松【作者单位】四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室,四川大学生命科学院,成都610064;四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室,四川大学生命科学院,成都610064;四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室,四川大学生命科学院,成都610064【正文语种】中文【中图分类】Q959.837;Q95-33条件性基因敲除主要是通过Cre/loxp或者Ftp/FRT这两个重组系统来实现(Lee＆Saito，1998;Kühn ＆ Schwenk，2003;Liu et al.，2003)。
这两个系统的应用，可以使目的基因的表达或缺失发生在实验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。
与普通的全身基因敲除相比，条件性基因敲除具有很多优点，如特定组织下的基因敲除可以使基因功能的研究更准确，避免早期胚胎死亡等(Nagy，2000)。
条件性基因敲除的基本原理和方法详见孟凡伟(2008)。
Nocl2(Nucleolar complex associated leukin-homolage 2)是新发现的参与免疫调节的重要因子。
由于体内的免疫细胞如巨噬细胞，粒细胞等多是源自骨髓细胞。
因而骨髓细胞特异性敲除Nocl2基因小鼠的建立，就能够有针对性地研究Ncol2基因缺失后对免疫系统的影响。
条件性敲除小鼠（CKO）原理、构建与应用
条件性敲除小鼠（CKO）原理、构建与应用基因敲除小鼠作为研究基因功能重要工具，应用十分广泛，然而实际操作中大家常常遇到这样问题：①靶基因敲除造成小鼠胚胎致死无法生育；②研究靶基因在某一阶段或者某一个组织的表达情况，那么全敲小鼠并不能满足我们的研究要求。
条件性基因敲除小鼠（CKO）就应运而生了，完美地解决了上面2个棘手问题。
今天，我们就为大家介绍一下条件性基因敲除小鼠的原理、构建、鉴定与应用。
一、条件性敲除小鼠（Conditional knockout mice, CKO）原理条件性基因敲除小鼠：使靶基因缺失仅发生于小鼠生命周期的某一阶段或某一特定的组织，而在其它组织或细胞表达正常，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。
如下为全敲和条件性敲除的对比：1. 技术原理通过染色体位点特异性重组酶系统Cre-LoxP或Flp-FRT来实现的。
在待敲除目的基因一个或多个重要外显子两端各放置一个LoxP （或FRT）序列，得到flox（Flankedby LoxP)小鼠。
将flox小鼠与带有组织特异性表达的Cre(或Flp)的小鼠交配繁殖，以获得在特定组织里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。
鉴于这2种技术基本原理一致，Cre-LoxP系统更多用于动物体内编辑，下面就以Cre-LoxP具体介绍。
2. Cre/LoxP系统组成Cre-LoxP系统源于 P1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两种成分：LoxP位点：一段长34bp的DNA序列，为重组酶识别的位点：含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
Cre重组酶：为一种酶，由343个氨基酸组成的单体蛋白；具有位点特异性，可使LoxP片段间的基因序列被删除或重组。
根据LoxP位点方向分以下三类重组方式：⑴两个LoxP位点方向相同：如果两个LoxP位点位于一条DNA 链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；如图下①所示。
Runx2条件性敲除小鼠釉质缺陷的部分挽救
中国细胞生物学学报Chinese Journal ofCell Biology 2021，43(3): 538-543DOI: 10.11844/cjcb.2021.03.0006条件性敲除小鼠釉质缺陷的部分挽救徐畅高玉光*(滨州医学院附属医院儿童口腔科，滨州256600)摘要 该研究旨在探讨外源性过表达对小鼠成釉细胞穴w^c2敲除导致的釉质缺陷的挽救作用。
采用免疫组化验证尺m/o:2在条件性敲除且人源性穴w«x2过表达小鼠成釉细胞中的表 达。
H E染色观察成熟期成釉细胞形态及釉质基质蛋白残余。
用体视显微镜和扫描电镜观察小鼠 牙齿表面形态和釉柱结构。
结果显示，RUN X2蛋白在出生后10天龄Tg;cKO小鼠成熟早期成釉细 胞中成功表达。
15天龄Tg;cKO小鼠与cKO小鼠相比，成熟晚期成釉细胞形态及排列未见明显改善, 但釉质基质蛋白残余量明显减少。
3月龄Tg;cKO小鼠与cKO小鼠相比，釉质磨耗减轻，釉柱间孔隙 减少，釉柱排列更规则。
该研究结果表明，人源性过表达可部分挽救小鼠成釉细胞肌c2敲除 导致的釉质缺陷。
关键词 挽救;釉质；釉柱Partial Rescue of Enamel Defects in R u n x l Conditional Knockout MiceXU Chang,GAO Yuguang*(Department of P ediatric Dentistry, Binzhou Medical University Hospital, Binzhou 256600, China)Abstract This study aimed to explore the rescue effect of exogenous Runx2overexpression on enamel defects caused by Runx2knockout in mouse ameloblasts.Immunohistochemistry was used to detect the expression of Runx2in ameloblasts o f Tg;cKO mice.HE staining was used to observe the morphology of mature ameloblasts and the residual enamel matrix protein.A stereoscopic microscope and scanning electron microscope were used to observe the tooth surface morphology and enamel rod structure.The results showed that RUNX2 protein was successfully expressed in early maturation stage ameloblasts in Tg;cKO mice on postnatal day pared with cKO mice,Tg;cKO mice showed no significant improvement in the morphology and arrangement of late maturation stage ameloblasts on postnatal day 15, but the residual amount of enamel matrix protein was significantly reduced. Compared with cKO mice,the3-month-old Tg;cKO mice had less enamel abrasion,reduced pores between enamel rods,and more regular enamel rods.This study demonstrated that human-derived Runx2overexpression could partially rescue the enamel defect caused by Runx2knockout in mouse ameloblasts.Keywords Runx2\rescue;enamel;enamel rod釉质发育主要分为釉质基质蛋白分泌期和釉质基质蛋白吸收、矿物质转运的成熟期。
条件性基因敲除的“时空开关”——Cre-loxP系统介绍
条件性基因敲除的“时空开关”——Cre-loxP系统介绍基因敲除小鼠是我们研究基因功能必不可少的利器，主要分为全身性基因敲除和条件性基因敲除。
然而，全身性基因敲除的小鼠存在着无法忽视的缺陷，例如：不能特异性地研究特定基因在特定组织内（及特定的时间）的功能；全身性基因敲除小鼠有时因某些基因对胚胎发育的影响而无法正常分娩；或因出生后严重的生理缺陷而过早死亡；或不能产生后代而不能获得纯合子动物模型。
因此，条件性基因敲除小鼠虽然有周期长、费用高、需要配合特定工具鼠使用等劣势，但仍获得了越来越多的选择与喜爱。
今天，就和大家一起来了解下条件性基因敲除方法必用的Cre-loxP重组系统以及应用Cre-loxP进行条件性基因敲除的原则。
概述Cre-loxP重组系统，即对一段特定的DNA序列进行定位并用Cre 重组酶对其进行剪接，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。
其中Cre蛋白，最初由“导致重组（Cause recombination）”命名，也有文献命名为“环化重组酶（Cyclizationrecombinase）”。
Cre重组酶（CyclizationRecombination Enzyme）由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。
它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够特异性识别loxP位点, 从而重组或删除loxP片段间的基因。
loxP（Locus Of X-over P1）是P1噬菌体基因组中34bp的特殊位点序列，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。
其中，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了loxP位点的方向，间隔区中的“N”代表这个碱基是可变的：发展历史1985年，R H Hoess, K AbremskiCre-Lox首次发表了大肠杆菌噬菌体P1的Cre-lox位点特异性重组系统的断裂和交换机制文章。
1987年，Brian Sauer博士把大肠杆菌噬菌体P1的Cre-lox位点特异性重组系统在酿酒酵母中即真核系统中进行了功能表达，提出了Cre介导的位点特异性重组可能是调节真核生物基因组重排的有用工具的预想。
条件性骨细胞Tsc1基因敲除小鼠的初步研究
广东医学 2019 年 9 月第40 卷第 18 期 Guangdong Medical Journal Sep. 2019, Vol. 40, No. 18・2563・基石出硏究条件性骨细胞Tscl 基因敲除小鼠的初步研究：胡乐，刘文张武镐张月南方医科大学基础医学院（广东广州510515）【摘要】目的 构建骨细胞九cZ 基因条件性敲除小鼠，并进行表型鉴定，为进一步研究TSC1在骨细胞 中飽作用奠定基础。
方法 利用Tscl"和DMP\-Cre *转基因小鼠进行饲养和杂交;对繁殖产生的第1代小鼠进行基因型鉴定,获得Tscl 问-DMPl-Cre * ,待其成年后，同Tsc 严皿小鼠合笼，得到第2代小鼠，通过 PCR 鉴定出基因型为Tscl" DMP1 - Cre * ；此为本实验所需要构建模型小鼠。
应用H-E 染色、光学显微镜观察10周龄小鼠骨细胞的改变。
结果2种转基因小鼠繁殖产生的第2代小鼠基因型符合孟德尔遗传定律，交配后获得Tsc 严皿DMP1 - Cre *小鼠。
TscZ 基因通过Cre/loxP 系统被成功敲除。
结论 该方法成功构建可以在骨细胞条件性敲除九“基因的小鼠，并进行敲除后鉴定。
*国家自然科学基金青年科学基金资助（编号:31600964）△通信作者。
张武镐，E-mail ： smuzhangwj @ qq. com ；刘文，E- mail : 1402241007 @ qq . com【关键词】TSC1； Cre/loxP 系统；条件性敲除；骨细胞【中图分类号】R394.3；Q812【文献标志码】ADOI ： 10.13820/j. cnki. gdyx. 20186808A preliminary study of conditional osteocyte Tscl knockout mice. HU Le , LIU Wen , ZHANG Wu - ju, ZHANGYue. School of Basic Medical Sciences , Southern Medical University , Guangzhou 510515 , Guangdong , ChinaCorresponding author : ZHANG Wu -ju, E - mail : smu^iangivj@ qq. com ； LIU Wen, E - mail : 1402241007@ qq. com[Abstract ] Objective To generate and phenotypic identify osteocyte Tscl conditional knockout mice, and to lay afoundation for further study on the role of TSC1 in osteocyte. Methods心小"°〃处 and DMP1 - Cre * transgenic micewere bred and hybridized. The genotypic identification of the first generation offspring was performed , and Tscl^ox/ ~ DMP1 -Cre + mice were acquired. After crossing with Tscl fl ，＞x/^ox mice, mice with Tscl^7^ DMP1 一 Cre + were identified using PCR. The morphologic changes in osteocyte of Tscl Jlox/flox DM P l - Cre + mice and wild type ( WT) mice aged 10 weekswere observed using H-E staining and optical microscope. Results The genotype of the second generation offspring re produced by two kinds of transgenic mice was in accordance with Mendel's law of inheritance , and Tscl^^ DMP1 一 Cre + mice were generated. Tscl gene was successfully knocked out by using Cre/loxp recombination system. ConclusionHomozygous mice with osteocyte Tscl gene conditional knockout are successfully generated , which serve as ideal model for functional study of TSC1.[Key words ] TSC1 ； Cre/loxP recombination system ； conditional knockout ； osteocyte哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（the mechanistic tar get of rapamycin , mTOR ）是一种至少由2个明显的 多蛋白复合体组成的高度保守的丝氨酸-苏氨酸类激酶，是调节细胞生长、代谢、增殖、凋亡的重要因素⑴。
基因敲除小鼠技术
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
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条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
●CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。
（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
）●CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠●CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。
（参考资料：南方模式生物官网）●交配策略➢将获得的flox杂合子小鼠（geneflox/+）分成两部分：1.flox/+小鼠与Cre小鼠交配，同时获得flox阳性且Cre阳性小鼠（该小鼠简写为：geneflox/+；Cre+），flox阳性且Cre阴性小鼠（geneflox/+）；2.flox小鼠自交，获得flox纯合（该小鼠简写为：geneflox/flox）和flox杂合小鼠（geneflox/+）。
➢为获得flox纯合且Cre阳性的小鼠，可有两种繁育方法选择：1.将获得的flox和Cre双阳性杂合子小鼠（geneflox/+：Cre+）与flox杂合子小鼠（geneflox/+）交配，最终获得flox纯合且Cre阳性的实验组小鼠（该小鼠简写为：geneflox/flox；Cre+，该小鼠所占后代比例为：1/8）和flox纯合且Cre阴性的对照组小鼠（geneflox/flox，该小鼠所占后代比例为：1/8）；2.将获得的flox和Cre双阳性杂合子小鼠（geneflox/+：Cre+）与flox纯合子小鼠（geneflox/flox）交配，最终获得flox纯合且Cre阳性的实验组小鼠（geneflox/flox；Cre+，该小鼠所占后代比例为：1/4）和flox纯合且Cre阴性的对照组小鼠（geneflox/flox，该小鼠所占后代比例为：1/4）。
➢后续实验（实验组：geneflox/flox；Cre+，对照组：实验组：geneflox/flox）为快速获得上述所需小鼠，可将geneflox/flox；Cre+小鼠与geneflox/flox小鼠杂交●小鼠基因型鉴定➢小鼠编号原则➢Flox小鼠基因型鉴定（用于鉴定flox纯合、杂合和野生型）PCR鉴定引物位置示意图（可选择P1,P2引物对，或P3,P4，P1,P4引物对）➢目的基因组织特异性敲除效果验证（1）DNA水平cre活性验证通常是取一小块表达Cre的组织，抽提基因组DNA，通过PCR的方法对flox区域进行扩增，通过flox区域的有无，定性判断Cre是否发挥作用。
（2）RNA水平cre敲除效率验证通常是取一小块表达Cre的组织，抽提RNA，反转录成cDNA后，通过Realtime-PCR的方法，利用Cre作用后的mRNA ，所设计的引物无法扩增出PCR产物的原理，定量判断Cre作用效率。
（3）蛋白水平cre敲除效率验证目的组织western blot或免疫组化检测。
原理：表达cre的组织无法检测到目的蛋白。
➢动物组织DNA抽提1)250ul 裂解液+2.5ul proteinase K(10mg/ml) 直接消化组织，放于55℃恒温热浴过夜2)加入同体积（250ul）苯酚：氯仿：异戊醇混合物（使用前摇晃瓶身混匀），上下剧烈震荡15s，12000rpm,15min常温离心3)转移上清于新的EP管（期间可能会吸起白色絮状物，无妨）4)加入等体积的异丙醇，上下剧烈震荡15s,12000rpm,15min常温离心5)倒掉上清（也可用真空泵吸，小心底部沉淀），用75%乙醇（400ul），7500rpm, 5min（可多清洗2遍）6)将管壁内部及管盖上的残留乙醇吸干，沉淀相对较干，根据不同体积加入ddH2O注：因没加RNA酶，可能会残余RNA，A260/280会居于1.9以上，但PCR 无妨lysis buffer1L小鼠饲养及繁殖期间遇到的问题Q：小鼠合笼后，很久都不怀孕？A：考虑换雌鼠或雄鼠，重新交配Q：小鼠合笼后，雄鼠和雌鼠比例及年龄选择？A：雄：雌一般1：2或1：3，不要太多雌鼠。
雄鼠至少8w，9-10w更为合适；而雌鼠一般选择6w及以上。
Q：什么时候分笼？A：大小鼠的哺乳期是20-22d，3周龄可离乳独立生活，因此出生3周后即可将幼鼠与母鼠分开，独立生活。
视小鼠生长情况，可多哺乳几天。
有时为避免笼盒中同时存在两胎幼鼠，导致新生的幼鼠被上一胎幼鼠踩踏致死的情况，在19d 左右即可将其分笼。
分笼时需要标记新生小鼠，选择减脚趾，或打耳钉（耳钉一定要订的足够好，否则后续会被小鼠抓掉）雌鼠4周龄阴腔开张，雄鼠5周龄睾丸降落至阴囊，开始形成精子。
因此，4周龄前一定要进行分笼，以免发生交配Q：母鼠吃仔怎么办？A：1.雌鼠与雄鼠合笼交配后，雄鼠可以一直与孕鼠一起生活，这样有利于孕鼠整个妊娠过程的稳定以及仔鼠的出生与哺乳。
2.怀孕的雌鼠（一般两只）一起生活，或将怀孕及未怀孕的雌鼠在一起。
然而，绝对不要在雌鼠分娩前几天再在笼舍中加入新的雌鼠，这样会打扰到孕鼠以及新生仔鼠；要等仔鼠断奶（21天）后才能再将雄鼠放入繁殖笼内。
3.第一胎分娩或太过于年轻的新手母鼠育成仔鼠的成功率比有经验或较为年长的雌鼠要低。
仔鼠出生第一天尽量不要打扰母鼠与幼仔，到第二天母鼠就比较能容忍被打扰的状况了。
4.若一直持续吃鼠，选择换孕鼠。
Q：如何准确知道小鼠怀孕天数？A：傍晚5-6点将雌鼠雄鼠合笼，第二天早晨8点检查雌鼠是否有阴道栓（下图所示）。
有阴道栓的当天中午算为胚胎第0.5天。
检栓后，未见到栓的雌雄鼠分开，至下午再进行合笼。
不过，观察到阴道栓只能说明发生了交配行为，并不能完全作为怀孕的标志，见到栓以后仍可能发生未怀孕的情况。
小鼠表型观测参考点：体型差异、毛发、体重、活动能力，最关键还是要结合敲除或敲入基因的具体功能常见的肝癌模型1.诱发性肝癌模型：DEN, DEN+CCl4，HFD+CD+CCl42.移植性肝癌模型：异位移植即皮下成瘤，原位移植（肝脏，经脾脏）3.基因敲除鼠（如HBV-TG, PTEN, APC, miR-122肝特异性敲除, Myc肝特异性过表达）4.高压尾静脉HTVI诱发性肝癌模型●DEN●DEN+CCl420mg/kg DEN, injected at day 12 of C57BL mice.1ul/g of 20% of CCL4 (diluted by Olive), start from week 4 of mice, once a week, for 14-18 weeks (Male-16week, female-17week)移植性肝癌模型●皮下成瘤subcutaneous tumor formation注意点（1）肿瘤细胞系选择（2）小鼠品系选择：Nude, NOD/SCID, NSG（3）接种部位：腋下、腹股沟、侧腹部及颈背部（血管丰富且易操作部位）操作步骤（1）肿瘤细胞的传代扩增确保肿瘤细胞的活力和良好的生长状态（病毒感染可选择再传代扩增；若siRNA或质粒转染处理细胞不建议传代扩增，质粒转染24小时，保证最大效率。
siRNA取决于平时做实验的经验。
）（2）计算细胞接种量结合文献来确定细胞接种量，在找不到相关资料的情况下，最高就用到1000万/0.1ml，不可再高（因为细胞悬液已达饱和状态）。
并且提前计算确定细胞数量，一般注射40只小鼠，至少需要准备50只小鼠的细胞量。
（3）准备裸鼠一般选择5-6W裸鼠，小于4W动物可能不耐受而过早死亡，大于6W免疫力会增强，不易成瘤；雌雄均可（4）操作步骤①预准备：matrigel 4℃过夜融化，若1人操作可选择使用呼吸麻醉仪，去鼠房前可考虑打一盒冰和带上移液器和枪头，用注射器不好重悬细胞②接种时选择好部位进针，建议接种前酒精棉球擦拭消毒进针位置（实验室选择以后腿股）；③向前方穿行，注射前针头稍微动一动，能动说明在皮下，否则可能在皮内或者肌肉内；④针头在皮下走一段再注射，速度不可太快，一般体积为100-200μL（PBS或者无血清培养基稀释细胞，若不易成瘤可添加matrigel促进成瘤），可看见明显的鼓包；⑤接种点离进针点尽量较远，减少漏液和污染的可能；⑥注射完毕后，缓慢旋转退出针头（Z字型扭），尽量避免漏液；⑦细胞需一直置于冰上，使细胞处于比较低的代谢状态，一般2h之内不会有问题。
（5）后续实验安排①分组：一般来说皮下荷瘤主要用于抗肿瘤药物的检测，因此我们一般分为对照组，阳性药物组，低剂量、中剂量及高剂量药物组等；②数量：荷瘤时每组不少于10只，考虑到小鼠成瘤率和死亡原因，最终实验应至少可以获取6个有效数据；③给药时间：一般接种7-10天后便可看到肿瘤长起，便可分组实验（鼠源细胞系会更快）；④人道终点：动物伦理学规定，小鼠肿瘤重量不可超过小鼠体重10%，平均肿瘤直径不超过20mm，并且如果出现溃烂，造成感染或坏死时，应该中止实验且对动物施行安乐死。
（参考资料：/knowinfo/17.html）●经脾脏注射肝癌细胞Intrasplenic inoculation操作步骤：预准备：麻醉剂2%戊巴比妥钠配置(100ml 0.9%的生理盐水中含有2g戊巴比妥钠，用0.22um 过滤器除菌)。