高效液相色谱的使用及氨基酸标样的分析PPT课件

12
PITC
PTC
-
13
• 三、实验仪器和试剂
1、仪器：高效液相色谱仪（带紫外检测器）。
2、材料 氨基酸标样 3、试剂：
衍生液： 异硫氰酸苯：甲醇：三乙胺：水（V/V）=1：7：1：1 正己烷、乙腈、乙酸、乙酸钠 以上试剂中乙腈为色谱醇，水为二次蒸馏水，其它为 分析醇。
-
14
四、实验步骤 1、柱前衍生步骤： （1）将200ul衍生液加入200ul氨基酸标样或样品中，
2、流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到 室温后使用。
3、不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住 而导致泵不进液。
4、每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。
5、气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程 中要尽量避免产生气泡。
6、如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通 常在输液前要进行流动相 的清洗。
高效液相色谱的使用及氨基酸标样的 分析
-
1
高效液相色谱的使用及氨基酸标样 的分析
一、高效液相色谱的基础知识
二、LC-10AVP液相色谱仪键盘操作
三、氨基酸标样的分析
-
2
一、高效液相色谱的基础知识
高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）以前也称为高压（high pressure）液相色谱法、高速（high speed）液 相色谱法。HPLC是在经典的液相色谱法的基础上， 在20世纪70年代后快速发展起来的一项高效、快
速的分离分析技术。它是以经典的液相色谱为基 础，以高压下的液体为流动相的色谱过程，具有 高压、高效、高速和高灵敏度的特点。广泛应用 于医药、生化、石油、化工、环境卫生和食品等 领域。
-
3
➢ 液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方 法
❖ 适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性 差的化合物的分析
❖ 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双 重作用
• 气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方 法
❖ 适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化 合物的分析
❖ 流动相只起运载样品分子的能力
-
4
一、色谱的 起源
色素 玻璃柱
石油醚 碳酸钙颗粒
-
5
二、定义 色谱法：利用组分在两相之间分配系数不同 而进行分离的技术 移动相：携带样品流过整个系统的流体 固定相：静止不动的一相，通常为色谱柱固定
-
8
四、高效液相色谱仪的基本结构
高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离 系统、检测系统、记录系统 等五大部分组成，其 基本结构如下图：高效液相色谱的特点与基本结 构.ppt
-
9
二、LC-10AVP液相色谱仪键盘操作
-
10
三、氨基酸标样的分析
一、实验目的 （1）熟悉高效液相色谱仪的结构、分离原理
（2）流动相：
• A液：0.1M乙酸钠pH6.50（用乙酸调整，500ml 乙酸钠中约加2滴乙酸）。
• B液：乙腈/水=4/1
（3）流量：1ml/min
•
柱温：36℃
•
检测波长：254nm
-
16
（4）梯度洗脱程序：
• TIME(min)
FUNC
• 0．01
BCONC
•3
BCONC
• 21
BCONC
-
19
六、思考题
1、试述反相离子对色谱的分离机理。
2、试述本实验氨基酸分析的基本原理和方法， 除了本方法外，还有那些氨基酸分析方法？
-
20
和操作程序。 （2）掌握氨基酸标样的分析方法、原理。
-
11
二、实验原理
氨基酸与PITC发生反应生成的衍生物，在 254nm处有最大吸光值。氨基酸衍生物进高 效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保 留时间和峰面积可进行定性和定量。该方法 是柱前衍生法中的一种。PITC方法的反应方 程式如下图所示：
-
液
-
6
反相液相色谱 流动相极性大于固定相极性 能溶于水/有机混合物的中性或非离子 化合物 正相液相色谱 流动相极性小于固定相极性 不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异 构体混合物和制备HPLC
-
7
三、流动相的选择
• 采用 “HPLC” 级溶剂 • 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 • 对试样有适宜的溶解度 • 溶剂粘度要小 • 与检测器相匹配
震荡使混合均匀，室温放置1小时。 （2）反应液中加入400ul正己烷，充分震荡后放置使
分层。 （3）取下层溶液用一次性滤膜过滤器（0.45ul）过滤。 （4）取滤液5ul注入HPLC。
-
15
2、分离条件的设定
（1）色谱柱：Shim-pack VP-ODS 4.6mm x 15cm
• 保护柱：Shim-pack GVP-ODS4.6 mm x 1cm
• 21.01
BCONC
• 25
BCONC
• 25.01
BCONC
• 35
STOP
VALUE 10 10 39 80 80 10 STOP
-
17
3、数据采集
打开real-time CS analysis软件采集数据并对数 据进行分析。
-
Leabharlann Baidu
18
五、注意事项
1、流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其 中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜 过滤)。