α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
氨基相连处
第九页，编辑于星期五：十点 五十八分。
酶的固定化方法
酶
物理吸附法
交联法
包埋法
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固定化酶的性质
• 稳定性增加： 对热、蛋白酶及各种试剂的稳定性。
• pH活性曲线和最适pH的变化：
可能向酸性或碱性方向移动。需实验确定 • 底物的专一性变化：
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用脲酶固定化酶测定血液或尿中的尿素含量。
在医药上的应用：
将苯丙氨酸羟化酶及其辅酶制成不溶酶，注射到患者 体内，可有效治疗苯丙酮尿症。
缺少乳糖酶，不能水解牛乳中的乳糖，引起腹痛腹 泻，可用乳糖酶固相酶在体内或体外水解乳糖。
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讨论
1、试验中为什么要待固定化酶柱中流出5ml液体后再接 收流出液用于鉴定？
三、α-淀粉酶的固定化及 淀粉水解作用检测的实验
1、实验目的：
（1）制备固定化α-淀枯粉草酶杆；菌的α-淀粉酶：
（2）进行淀粉水解的测最适定p。H5.5～7.5
最适温度55～75℃ 2、实验原理：
用吸附法将α-淀粉酶固定在石英砂上。一定浓度的
淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。用淀
粉指示剂溶液（KI－I2）测试，流出物呈红色，表明水解
寻找耐高温的淀粉酶的目的是在高温下使淀粉水解快， 而且酶不会因高温而在短时间内变Байду номын сангаас。在发酵生产中使 用的往往是植物淀粉，如青霉素发酵、乙醇发酵等都要 水解淀粉，所以耐高温淀粉酶用途广泛。
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2.影响酶在载体（吸附剂）上吸附程度
的因素:
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选修1《生物技术实践》知识点归纳实验1 大肠杆菌的培养和分离 1.微生物是指结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生生物和某些真菌。
细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核,只有一环状DMA分子(拟核)。
以分裂(二分裂)的方式繁殖,分裂速度很快。
用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌(革兰氏染液染色后,再脱色处理,细菌仍保留染色液的颜色)和革兰氏阴性菌两大类,区别在细胞壁的成分不同。
大肠杆菌是革兰氏阴性(细胞壁薄,有荚膜)、兼性厌氧的肠道杆菌。
2.细菌的分离方法有两种:划线分离法和涂布分离法。
是消除污染杂菌的通用方法,也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。
划线分离就是用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线,在划线的过程中菌液逐渐减少,细菌也逐渐减少,。
划线最后,可使细菌间的距离加大。
将接种后的固体培养基培养10~20小时后,一个细菌细胞就会繁殖成许多细菌细胞,形成菌落,不会重叠。
在斜面上划线,则每个斜面的菌群就是有一个细菌产生的后代。
用于基因工程的大肠杆菌的工程菌,可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。
由于工程菌的质粒中通常有抗性基因(如抗氨苄青霉素基因),如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素,由于非工程菌的其他杂菌都没有抗性基因,所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。
涂布分离时,需要先将培养的菌液稀释,通常稀释10-5~10-7倍之间,然后取0.1mL不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养,在适当的稀释度下,可产生相互分开的菌落，每个培养基里有20个以内的单菌落为最合适。
优点：划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂。
在培养微生物时,必须进行无菌操作。
其首要条件是各种器皿必须是无菌的,各种培养基也必须是无菌的,转移培养基、倒平板、接种、平板划线、平板稀释涂布等操作中的每一步都要做到无菌(防止杂菌污染)。
a-淀粉酶的固定化与淀粉溶液的检测.
淀 粉
α-淀粉酶ຫໍສະໝຸດ 糊 精β-淀粉酶麦 芽 糖
糖化淀粉酶
葡 萄 糖
运用吸附法将 α - 淀粉酶的固定在石英砂上。一定浓度的 淀粉溶液经过固定化的 α - 淀粉酶催化后，生成糊精，使流 出液加入KI-I2指示液后呈红色，表明水解产物糊精生产。
固定化装置—层析柱
实验材料制备
a-淀粉酶的固定化
在烧杯中将5mg a-淀粉酶溶于4ml蒸馏水中。再加入
5g石英砂，不时搅拌，30分钟后装入层析柱中。
用10倍体积的蒸馏水洗涤此层析柱以除去未吸附的游
可溶性淀粉溶液
离淀粉酶，流速控制为1ml/min。
取50mg可溶性淀粉溶于100ml热水中，搅拌均匀。
5mmol/L KI-I2溶液
称取0.127g碘和0.83g碘化钾。加蒸馏水100ml。
实验步骤
知识结构
一、固定化技术基础知识 二、a-淀粉酶的固定化与淀粉水解 作用的检测
一、固定化技术基础知识
固定化技术：利用物理或化学方法将酶或细
胞固定在一定空间内的技术，包括吸附法、 包埋法、化学结合法（将酶分子或细胞相互 结合，或将其结合到载体上）。
物理吸附法
包埋法
化学结合法
酶更适合采用化学结合和物理吸附法
1.将灌注了固定化酶的层析柱放在铁架台
上，用滴管滴加淀粉溶液，使淀粉溶液已 0.3mL /min的流速过柱。在流出5mL后接 收0.5mL流出液，加入1-2滴KI-I2 溶液，观 察颜色。用水稀释1倍后再观察颜色。
2.试验后，用10倍体积的蒸馏水洗涤此层析
柱，放置在4℃冰箱里，几天后再重复上述 实验，看是否有相同结果。
固定化 细胞多采用包埋法固定
α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测精品课件(一)
α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测精品课件(一)α淀粉酶是一种催化淀粉分解的酶，具有广泛的应用价值，在食品工业、饲料工业、医药工业和纺织工业都有重要的应用。
对于α淀粉酶的固定化和淀粉水解作用的检测具有重要的研究价值。
本文将介绍α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测精品课件。
一、α淀粉酶的固定化1. 研究目的α淀粉酶固定化的目的是利用固定化技术提高酶的稳定性和活性，使其在工业应用中更加优越。
2. 固定化方法（1）吸附法：将酶直接吸附在固体载体表面上，如硅胶、纤维素等。
（2）共价结合法：通过化学反应将酶共价结合在载体上，如聚酰胺凝胶。
（3）交联法：利用交联剂将酶与载体交联，形成固定化酶。
3. 固定化效果α淀粉酶经过固定化后，具有更好的稳定性和活性，可以提高酶的使用寿命和效率。
二、淀粉水解作用的检测1. 研究目的淀粉水解作用的检测旨在测定酶水解淀粉的效率，评价酶的性能和应用价值。
2. 检测方法（1）碘酒法：将淀粉样品与酶一起加入反应体系中，加入碘酒滴定，在淀粉被水解完全后，碘酒滴定出现无色。
（2）比色法：将淀粉样品与酶一起加入反应体系中，加入糖色再经比色，根据测试淀粉的浓度，推算出酶的效率。
（3）电化学法：利用电化学技术测定反应体系中的还原电位，根据反应体系的电化学响应来测定淀粉水解的效率。
3. 检测效果通过淀粉水解作用的检测，可以评估α淀粉酶的性能和应用价值，指导其在工业应用中的使用。
综上所述，α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测是酶学研究领域中的重要课题。
本文介绍了α淀粉酶的固定化方法、效果，以及淀粉水解作用的检测方法和效果，对于淀粉酶及其应用研究人员具有重要的参考价值。
高中生物浙科版选修一知识点归纳
高中生物浙科版选修一知识点归纳选修一生物技术实践知识点总结第一部分微生物的利用一、微生物实验室培养的基本操作程序1、器具的灭菌：P20-21，灭菌前，试管加棉花塞或塑料盖、三角瓶用封口膜或6层纱布封口……最后各种用品均需用牛皮纸或报纸包好，用高压蒸汽灭菌法（121C，1kg/cm2压力）灭菌15min。
值得注意的是，实验中所需的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易引起污染。
灭菌后，通常将实验用具放入60～80℃的烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分。
在进行实验操作前，将需要使用的用具从烘箱中取出，放到超净台上。
在超净台工作之前，应先打开超净台的紫外灯和过滤风，工作时关闭紫外灯。
塞子制作的好坏是控制污染发生的关键。
2、培养基的配制：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
①培养基种类尺度培养基类型固体培养基液体培养基合成培养基天然培养基鉴别培养基配制特点加入琼脂不加入琼脂由已知成分配制而成由天然身分派制而成添加某种唆使剂或化学药剂主要应用菌种分离,鉴定,计数、保存菌种的扩大培养菌种的鉴别菌种的分离按物理性质分按化学组身分按用途分②微生物培养的培养基：LB培养基。
配制培养基时需考虑营养物质的配比外，还需要考虑微生物生长对pH、氧气、渗透压等的要求。
“细菌喜荤，霉菌喜素”，通常细菌培养基要用卵白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定量的氯化钠，以维持一定的渗透压；霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。
此外．细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长，霉菌要求在中性偏酸的环境中生长。
选择培养基添加（或短少）某种化学身分3、培养基的灭菌：通常用高压蒸汽灭菌法灭菌。
但假如培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，要用500g/cm压力（90C以上）灭菌30min。
有些不能加热灭菌的化合物，如尿素（加热会分解）等，只能用G6玻璃砂漏斗过滤，但玻璃砂漏斗使用前也要在121℃下用纸包好灭菌。
a-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用实验方案
实验：α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用背景资料一、酶酶（enzyme）催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。
是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。
绝大多数酶的化学本质是蛋白质。
具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。
1．高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快；2．专一性：一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽；因此在食用酵素当今在功能上，主要有四种：高浓缩SOD酵素如复方天然酵素主要用于乳腺瘤、子宫肌瘤、卵巢囊肿等肿瘤方面；长生酵素直接补脾补肾补气血，全面调理；纤体酵素专门转化脂肪减肥；肠毒清酵素则专门清理肠皱褶的毒素。
3．多样性：酶的种类很多，大约有5000多种，其中可以通过食用补充的酵素达2000多种；形态上主要有三种：专业级酵素为酵素胶囊，其次为酵素粉，而液体酵素含量低、效价低、易腐败而安全性较差一些，食用风险较高。
4．温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的，因此，纯正酵素是中性的，温和的，不存在副作用，或“好转反应”。
对于有刺激性而必然存的“好转反应”，除了本身腐败以外，也有可能有药品的添加。
5．活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。
6.易变性：大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏；7.有些酶的催化性与辅助因子有关。
酶与无机催化剂的比较但酶易受环境影响而失活，包括温度、PH值等，例如一般来说动物体内的酶最适温度在35到40℃之间，植物体内的酶最适温度在40-50℃之间；细菌和真菌体内的酶最适温度差别较大，有的酶最适温度可高达70℃。
动物体内的酶最适PH大多在6.5-8.0之间，但也有例外，如胃蛋白酶的最适PH为1.8，植物体内的酶最适PH大多在4.5-6.5之间。
另外，反应中反应产物和酶的分工和回收困难等缺点限制了酶在工业上的广泛应用。
实验6-α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
固定化原生质体
注意：一般要添加渗透压稳定剂，以防止原生质体破裂。 ①由于去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧气和营养物 质的传递和吸收和胞内产物的分泌。 ②原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的 保护作用，稳定性提高，可反复使用和连续使用较长的 时间，利于连续化生产。 ③易于和发酵产物分开，有利于产物的分离纯化，提高 产品质量。
①溶解淀粉：50 mg 可溶性淀粉溶于100 mL热水 中，搅拌均匀。 ②过柱：使淀粉溶液以0.3 mL/min的流速过柱， 在流出5mL淀粉溶液后接收0.5 mL流出液。 ③检测：加入1-2滴KI-I2溶液，观察颜色变化。 用水稀释1倍后再观察颜色。
固 定 化 酶 柱
淀粉完全水解？
每分钟6滴
控制流速：让淀粉和淀粉酶充分接触反应。
关的问题：
（1）通常从腐烂的水果上分离产果胶酶的微生物，其
原因除水果中果胶含量较高外，还因为
。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（2）为了获得高产果胶酶微生物的单菌落，通常对分
离或诱变后的微生物悬液进行
。
腐烂的水果中含产果胶酶的微生物较多 涂布分离或划线分离
（3）在某种果汁生产中，用果胶酶处理显著增加了产量
，其主要原因是果胶酶水解果胶使
什么是固定化酶
固定化酶：将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某 种非水溶性介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的 制剂。
游离酶
酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。
固定化酶的优点
①能提高酶的稳定性。 ②可以反复多次使用，大大降低生产成本。 ③反应后易于与产物分离，利于提高产品质量。 ④反应条件易于控制，生产可实现连续化和自 动化。
。果汁
生产中的残渣果皮等用于果胶生产，通常将其提取液浓
高考选修考点二：酶的应用和固定化
考点二：酶的应用基础知识一、果汁中的果胶和果胶酶1.果胶(1)果胶的成分与存在:果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一,它由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成。
(2)果胶与果汁加工:果胶不仅影响出汁率,还会使果汁浑浊。
2.果胶酶(1)来源:黑曲霉、苹果青霉等。
(2)组成:果胶酶并不是特指某一种酶,而是分解果胶的一类酶的总称,主要包括果胶酶和果胶甲酯酶。
(3)作用:将果胶分解成可溶性的分子使出汁率提高,也使浑浊的果汁变得澄清。
3.果胶酶的应用(1)水果加工业:水果中的果胶经果胶酶水解后,可降低果汁的粘度,有助于压榨;在葡萄酒酿造中加入果胶酶能起到澄清作用,还可促使葡萄汁中的酒石酸发生沉淀;果胶酶可用于桔子脱囊衣,制造果粉和低糖果冻。
(2)饲料工业:果胶酶与纤维素酶、半纤维素酶等配合,可降解植物细胞壁中的果胶和纤维,促使淀粉、脂类、维生素和蛋白质等释放出来,从而提高饲料的营养价值;果胶酶可降低饲料的粘度,促进饲料在动物消化道内的消化吸收。
二、α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测1.固定化酶(1)形成:将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种⑨介质上,使之成为⑩不溶于水而又有 酶活性的制剂。
(2)特性:与游离酶相比较, 稳定性好,与底物和产物容易分离,易于控制,能反复多次使用;便于 运输和贮存,有利于自动化生产。
2.固定化酶的制作方法:由酶的性质和载体特性所决定,主要包括吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。
3.α-淀粉酶水解作用的检测重点难点一、果汁中的果胶和果胶酶1.探究利用苹果或山楂匀浆制作果汁的最佳条件的实验(1)实验原理果胶 半乳糖醛酸+半乳糖醛酸甲酯。
果胶酶的活性受温度(或pH)的影响,处于最适温度(或pH)时活性最高。
果肉的出汁率、果汁的澄清度与果胶酶的活性大小呈正相关。
果胶不溶于乙醇。
(2)实验流程第一步制匀浆第二步烧杯A 烧杯B5 g匀浆 5 g匀浆10 mL黑曲霉提取液10 mL水间歇搅拌20~30 min第三步试管1 试管2 试管3 试管4A烧杯混合物4 mL A烧杯混合物4 mL B烧杯混合物4 mL B烧杯混合物4 mL 沸水浴不加热沸水浴不加热第四步加入95%酒精4 mL2.影响果汁产量的物质及处理方法(1)影响果汁产量的物质:纤维素和果胶是组成水果的重要物质,这两种物质的存在使制作果汁时存在两个问题:一是果肉的出汁率低,制作耗时长;二是榨取的果汁浑浊、粘度高、容易发生沉淀。
2024届黑龙江省部分重点高中高三第二次联考生物试卷含解析
2024届黑龙江省部分重点高中高三第二次联考生物试卷注意事项：1．答卷前，考生务必将自己的姓名、准考证号、考场号和座位号填写在试题卷和答题卡上。
用2B铅笔将试卷类型（B）填涂在答题卡相应位置上。
将条形码粘贴在答题卡右上角"条形码粘贴处"。
2．作答选择题时，选出每小题答案后，用2B铅笔把答题卡上对应题目选项的答案信息点涂黑；如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其他答案。
答案不能答在试题卷上。
3．非选择题必须用黑色字迹的钢笔或签字笔作答，答案必须写在答题卡各题目指定区域内相应位置上；如需改动，先划掉原来的答案，然后再写上新答案；不准使用铅笔和涂改液。
不按以上要求作答无效。
4．考生必须保证答题卡的整洁。
考试结束后，请将本试卷和答题卡一并交回。
一、选择题(本大题共7小题,每小题6分,共42分。
)1．生物膜上常附着某物质或结构以适应其功能。
下列相关叙述正确的是（）A．内质网和核膜的外膜上附着核糖体，有利于对多肽链的加工B．颤藻类囊体薄膜上附着光合色素，有利于吸收、传递和转换光能C．叶绿体基粒上含少量DNA，有利于携带遗传信息D．蛙的成熟红细胞的线粒体内膜上附着与细胞呼吸有关的酶，有利于[H]的氧化2．TATA框是多数真核生物基因启动子中的一段DNA序列，位于转录起始点上游，其碱基序列为TATAATAAT。
在转录mRNA前，先由转录因子TFII-D蛋白和TATA框结合，形成稳定的复合物，然后由RNA聚合酶依据模板链进行转录。
下列相关叙述正确的是（）A．TATA框的DNA片段中共含有2种脱氧核苷酸和8个氢键B．TATA框经RNA聚合酶催化转录形成的片段中含有起始密码子C．转录开始时，TFII-D蛋白首先与TATA框结合打开碱基对之间的氢键D．RNA聚合酶催化形成磷酸二酯键将游离的核糖核苷酸依次连接成mRNA3．与静坐状态相比，人体剧烈运动时，通常情况下会出现的是（）A．细胞呼吸产生的CO2与消耗的O2比值更大B．ATP分解速率更大，合成速率更小C．糖原分解速率更大，合成速率更小D．产热速率更大，散热速率更小4．下图甲、乙表示两种蛋白质分子，其中“△○◇口”各代表一种氨基酸，“-S-S-”代表二硫键。
_淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测_实验改进_徐平珍
2014年第49卷第3期生物学通报51生物技术是一门既古老又现代的技术，而且涉及的范围极为广泛。
如酿造工业的产品———酱油、醋、酒等，是人们日常生活中的必需品。
由于生物技术的迅猛发展，每年都需要消耗大量的生物酶制剂，淀粉酶作为一类重要的生物催化剂，在医药、化工、食品及饲料添加剂等领域都有广泛的应用，其产量几乎占据整个酶制剂总产量的50%，且需求量越来越大［1］。
但是，酶在水溶液中很不稳定，容易受到酸、碱和有机溶剂的影响，而且溶液中的酶很难回收，不能再利用，反应后酶混在产品中又可能影响产品质量。
这些因素影响了酶工业化的应用，而固定化酶技术能很好地解决这些问题。
“α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测”是浙科版生物学选修1“生物技术实践”模块中第2部分“酶的应用”实验6的内容，也是《浙江省生物教学指导意见》中提出的学生需要掌握的7个实验之一。
选修课“生物技术实践”，是一门以自己动手做实验为主的课程。
而本实验按照原实验步骤需要2h左右，在高中教学安排中很难满足此要求。
另外按照教材中的实验步骤进行实验，得不到理想的实验结果，本校教师和前几届学生在实验中观察到流出液加碘液混匀后溶液显黄色而非红色。
《生物课程标准》的基本理念之一是倡导探究性学习，实验是学习生物技术的有效途径之一。
教师应尽可能为学生提供或创造动手操作的机会，通过亲手操作，学生在实践中学习新知识，并使知识得到延伸，同时也能学习相关实验操作的技能。
笔者对本实验进行了适当改进，使学生能在课堂时间内完成相关实验，此外对以往实验中遇到的一些疑问进行了探讨。
1实验材料α-淀粉酶、可溶性淀粉、石英砂、碘、碘化钾、5mL一次性注射器、铁架台、烧杯、天平、滴瓶、玻璃棒、绳子、量筒、试管、试管架和冰箱。
2实验方法2.1试剂的配制①0.5%淀粉溶液：称取0.5g可溶性淀粉溶于100mL热水中，搅拌均匀。
②5mmol/L KI-I2溶液：称取0.127g碘和0.83g碘化钾，加蒸馏水100mL，完全溶解后装入滴瓶中。
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三、α-淀粉酶的固定化及 淀粉水解作用检测的实验
遇碘显蓝色
遇碘显红色
遇碘不显色
3、设备及用品： 5ml塑料注射器、50ml烧杯、滴管、自行车用气 门芯及夹子、注射器架、试管或微量离心管3支 4、实验材料及其制备 （1） α-淀粉酶的固定化： 5mgα-淀粉酶+4ml蒸馏水+5g石英砂，搅拌，30min →装入层析柱→10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器，流 速为1ml/min（约20滴） （2）可溶性淀粉溶液： 50mg可溶性淀粉溶于100ml热水中，搅拌均匀。 （3）5mmol/L KI-I2溶液 0.127g碘+0.83g碘化钾+蒸馏水100ml,完全溶解后 装入滴瓶中。
1、根据吸附剂的特点分为两种：
物理吸附法
通过氢键、疏水键等作用 力将酶吸附于固体吸附剂 的方法.如有机硅胶、活性 炭和石英砂等 利用酶的两性基团和离子 交换剂的相互作用（离子 键）。吸附量大
离子结合法
（二）、包埋法
将酶包埋在多孔的载体中，包埋成格子型 或包埋成微胶囊型
（三）共价偶联法
是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是 酶蛋白的一些基团，在温和的条件下与载体 共价结合，形成共价键，从而被固定化。
1、实验目的： （1）制备固定化α淀粉酶； α -淀粉酶： 枯草杆菌的 最适pH5.5～7.5 （2）进行淀粉水解的测定。 最适温度55～75℃ 2、实验原理： 用吸附法将α-淀粉酶固定在石英砂上。一定浓 度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成 糊精。用淀粉指示剂溶液（KI－I2）测试，流出物 呈红色，表明水解产物糊精生成。
实验6 α-淀粉酶的固定化及 淀粉水解作用的检测
酶作为生物催化剂,具有专一性和高效性. 现在被大量使用在食品、化工、医药等领域。 然而，在应用酶的过程中，人们也发现了一些 实际问题： （1）不稳定：酶通常对强酸、强碱、高温和 有机溶剂等条件非常敏感，容易失活； （2）不利于工业化使用：溶液中的酶很难回 收，提高了生产成本，也可能影响产品质量。
怎样解决这些问题呢？
——固定化酶技术
一、酶与固定化酶
• 酶 活细胞产生的具有生物催化作用的
生物大分子。
• 固定化酶 (固相酶)
将水溶性的酶用物理或化学 的方法固定在某种介质上， 使之成为不溶于水而又有酶 活性的制剂点 （1）使酶固定化后有一定的机械强度，催化反 应的过程可管道化、连续化和自动化； （2）酶不溶解在催化反应的溶液中，产物更易 纯化； （3）固定化酶可反复使用，更经济，更利于工 厂化生产； （4）固定化酶提高了酶的稳定性，可较长时间 贮存和使用；
（四）、交联法
是酶分子和多功能试剂之间形成共价键及酶蛋 白的氨基相连得到三维的交联网状结构
氨基相连处
酶的固定化方法
酶 物理吸附法
交联法
包埋法
固定化酶的性质
• 稳定性增加： 对热、蛋白酶及各种试剂的稳定性。
• pH活性曲线和最适pH的变化： 可能向酸性或碱性方向移动。需实验确定 • 底物的专一性变化：
5、实验步骤：
将注射器固定在注射器架上 用滴管滴加淀粉溶液，流速0.3ml/min，（尽量慢）
流出5ml后接收0.5ml（约10滴）流出液 加入1~2滴KI-I2溶液，观察颜色 用水稀释1倍后再观察颜色（与对照组比较） 实验后，10倍柱体积蒸馏水洗涤此柱，放置在4℃冰箱中 几天后重复实验，观察结果
3、耐高温的淀粉酶有哪些可能的用途？
答案：在实际生产中，总希望反应的时间越短越 好，这就要提高反应温度。通常生产上淀粉酶是 一次性使用的，加温虽在短时间内会使酶变性失 活，但只要使淀粉在短时间内水解即可。 寻找耐高温的淀粉酶的目的是在高温下使淀 粉水解快，而且酶不会因高温而在短时间内变性。 在发酵生产中使用的往往是植物淀粉，如青霉素 发酵、乙醇发酵等都要水解淀粉，所以耐高温淀 粉酶用途广泛。
2.影响酶在载体（吸附剂）上吸附程度
的因素:
1、pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。 2、离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。 3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度 增加，吸附量也增加，直至饱和。 4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比 小分子慢得多。 6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越 强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附 面积的大小。
固定化酶的不足之处 不能催化一系列反应
二、酶的固定化
• 方法： 吸附法 包埋法 共价偶联法 交联法
•目的： 水溶性酶 物理、化学方法 不溶于水且有酶活性 • 机理： 将固定化酶装柱，当底物经过该柱时， 在酶的作用下转变为产物。
(一)、吸附法
吸附法是将酶与吸附剂接触，再经洗涤 除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简 单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。
讨论
1、试验中为什么要待固定化酶柱中流出5ml液体后 再接收流出液用于鉴定？
答案：因为固定化酶柱中的酶与流经柱子的淀粉 反应需要一定的时间，刚开始流出的液体中由于 反应时间过短，糊精未生成或生成的量太少，所 以不利于后面的颜色鉴定。
2、如何证明洗涤固定化淀粉酶柱的流出液中没有淀 粉酶？ 答案：可在试管中加入1ml可溶性淀粉溶液，再加 入几滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住试管 增加温度，几分钟后加入1～２滴KI-I2指示剂， 如仍显蓝色，即流出液中没有淀粉酶了。 用固定在石英砂的淀粉酶柱再作用于淀粉溶 液，使其自柱中流出，作用的结果才能表明是淀 粉酶的固相酶作用的结果。
6、实验结果： • 淀粉溶液+指示剂： 呈蓝色 • 亲和层析洗脱液+指 示剂： 呈红色 • 贮于冰箱几天后重 复实验： 呈红色
固定化酶的用途
在工业上的应用： 柚苷酶固定化酶用于果汁脱苦； 木瓜蛋白酶固定化酶用于啤酒澄清； 葡萄糖异构酶固定化酶用于制造果糖，提高甜度。
在化学分析和临床诊断上的应用： 用脲酶固定化酶测定血液或尿中的尿素含量。 在医药上的应用： 将苯丙氨酸羟化酶及其辅酶制成不溶酶，注射到 患者体内，可有效治疗苯丙酮尿症。 缺少乳糖酶，不能水解牛乳中的乳糖，引起腹痛 腹泻，可用乳糖酶固相酶在体内或体外水解乳糖。