发光细菌法急性毒性实验课件PPT
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天津市地表水水体污染发光细菌的急性毒性表征研究
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发光 菌 在 进行 新 陈 代 谢 时会 发 光 ， 当某 种 因素 影 响 其 正常 新 陈 代谢
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线 （ 范围），作为水质突变和 毒性应急的指 导依据 。 关键 词： 地表水 ：发光 细菌；急性毒性 中图分类号 ：Ｘ 文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：Ｉ ７ 一７ ９ ２ １ ）０ １ １ ２ ９ ６ ｜ ５ ７（ ０ ０ ４ ０ ３ —０ Ｔ
０曹畜
２ ）测 定条件 。室 温要 求： １—０Ｃ ５ ３＂
４结 累厦 讨论 我 们在 ４ ｉ月期 间 通过 对地 表 水发 光 细菌 的 急性 毒性 试验 发 光损 失 ～ １
率 测定 结果见 表 ｉ ，通 过计 算初 始算术 平均值 Ａｏ ｃ及标 准偏 差值 Ｓｏ ｃ ，得 控制
范 围Ａ ｏ Ｓ ｏ ｃ ±３ｃ 。建 立综合 毒性 基准线 ，作 为应 急 （ 发地控 制 ： 培养 块 １＋． ℃， ５０ ５ 读数井 １＋ Ｙ 。 ５ Ｉ ￣
３ ）步骤 。① 将Ｍ ｃｏ ｏ ｉｒ ｔｘ Ａ ｏ ｏ ０ ｏ ｏ №ｄ ｌ ５ ０ 析仪 模 式钮 调置 “ ｅ ０ 分
Ａｕｅ 模 式 ， 使 用 ８．％ ｃｔ” １９ ＳｒｅｉｇＴｓ实验检测方式 。 ｃｅｎｎ ｅｔ
尔弧 菌为 弧菌 属发光 细菌 。 细菌 发光 可概 括 为细菌 体 内合成 的 细菌发 光 酶催化 还 原型 的黄 素单核 苷 酸 （ＭＩ ）和 长链 脂肪 醛 （Ｃ Ｏ 至少含 ８ ｃ ＦＮ１ ２ ＲＨ ， 个 ）并 在０的参 与下 发生氧 ２ 化 还原 反应 而放 出光 子 。细 菌 的发光 涉 及 多种物 质 的参 与 。而且 这些 物质 的合 成 或产 生是 细菌 的 生理代 谢 的一 个 组成 部分 ， 因此 ，只 有在 外界 条件 适 宜时 。发 光才 比较 理想 。 所 以发光 细 菌 的发光 状况 对外 界 条件 的变 化极 为 敏感 ，并 可通 过发 光 强度 的 改变很 快 反映 出来 ，这就 是为 什么 可 以利用 发 光细 菌来 检测 环境 中 有毒 、有 害物 质 的基 本原 理 ，也 是发 光细 菌 能应用 于 快速 的环 境污 染监 测 的根 本 原因 。此 方法 利用 灵 敏的 光 电测量 系 统测 定 毒 物对 发光 细菌 发 光强 度 的影 响 。毒 物 的毒 性可 以用发 光损 失率 表 示 ，也
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发光 菌 在 进行 新 陈 代 谢 时会 发 光 ， 当某 种 因素 影 响 其 正常 新 陈 代谢
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线 （ 范围），作为水质突变和 毒性应急的指 导依据 。 关键 词： 地表水 ：发光 细菌；急性毒性 中图分类号 ：Ｘ 文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：Ｉ ７ 一７ ９ ２ １ ）０ １ １ ２ ９ ６ ｜ ５ ７（ ０ ０ ４ ０ ３ —０ Ｔ
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２ ）测 定条件 。室 温要 求： １—０Ｃ ５ ３＂
４结 累厦 讨论 我 们在 ４ ｉ月期 间 通过 对地 表 水发 光 细菌 的 急性 毒性 试验 发 光损 失 ～ １
率 测定 结果见 表 ｉ ，通 过计 算初 始算术 平均值 Ａｏ ｃ及标 准偏 差值 Ｓｏ ｃ ，得 控制
范 围Ａ ｏ Ｓ ｏ ｃ ±３ｃ 。建 立综合 毒性 基准线 ，作 为应 急 （ 发地控 制 ： 培养 块 １＋． ℃， ５０ ５ 读数井 １＋ Ｙ 。 ５ Ｉ ￣
３ ）步骤 。① 将Ｍ ｃｏ ｏ ｉｒ ｔｘ Ａ ｏ ｏ ０ ｏ ｏ №ｄ ｌ ５ ０ 析仪 模 式钮 调置 “ ｅ ０ 分
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尔弧 菌为 弧菌 属发光 细菌 。 细菌 发光 可概 括 为细菌 体 内合成 的 细菌发 光 酶催化 还 原型 的黄 素单核 苷 酸 （ＭＩ ）和 长链 脂肪 醛 （Ｃ Ｏ 至少含 ８ ｃ ＦＮ１ ２ ＲＨ ， 个 ）并 在０的参 与下 发生氧 ２ 化 还原 反应 而放 出光 子 。细 菌 的发光 涉 及 多种物 质 的参 与 。而且 这些 物质 的合 成 或产 生是 细菌 的 生理代 谢 的一 个 组成 部分 ， 因此 ，只 有在 外界 条件 适 宜时 。发 光才 比较 理想 。 所 以发光 细 菌 的发光 状况 对外 界 条件 的变 化极 为 敏感 ，并 可通 过发 光 强度 的 改变很 快 反映 出来 ，这就 是为 什么 可 以利用 发 光细 菌来 检测 环境 中 有毒 、有 害物 质 的基 本原 理 ，也 是发 光细 菌 能应用 于 快速 的环 境污 染监 测 的根 本 原因 。此 方法 利用 灵 敏的 光 电测量 系 统测 定 毒 物对 发光 细菌 发 光强 度 的影 响 。毒 物 的毒 性可 以用发 光损 失率 表 示 ，也
毒性试验整理
实验一发光细菌的急性毒性评价试验一、实验器材1.菌株明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）2.培养基酵母膏0.5%，胰蛋白胨或多聚蛋白胨（Polypetone）0.5%，甘油0.3%，NaCl 3%，Na2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.1%，pH6.5。
固体培养基再加琼脂2%。
3.溶液、试剂及待测物质酵母粉，蛋白胨，NaCl（AR），Na2HPO4（AR），KH2PO4（AR），甘油（AR），二甲基亚砜（AR），乙酸乙酯（AR），HCl（1M），去离子水。
4.仪器及其他用品生物毒性测试仪；电热恒温鼓风干燥箱；振荡培养箱；DELTA 320pH计；氮吹仪；镊子，移液枪，三角锥形瓶等。
二、目的要求1.学习了解发光细菌的急性毒性评价试验的基本原理。
2.掌握发光细菌的急性毒性评价试验的操作要领和评价方法。
三、基本原理发光细菌是指在正常的生理条件下能够发射肉眼可见的蓝绿色荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490 nm之间，在黑暗处肉眼可见。
不同种类发光细菌的发光机理是相同的，都是由特异性的荧光酶(LE)，还原性的黄素(FMNH2)，八碳以上长链脂肪醛(RCHO)，氧分子(O2)所参与的复杂反应，大致历程如下：FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCH→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+ H2O+RCOOH+光具体来说，生物发光反应由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为407-409 nm处的蓝绿光。
发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。
发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。
当细胞活性升高，处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强。
发光细菌法急性毒性实验课件PPT
图 (1) 发光细菌的发光反应模式。E1: 细菌荧光素酶，由α、β 2个亚基组 成，α为40000~42000D，β为37000~39000D。单独α、β亚基均无发光活性， 只有α、β共存时才有活性。E2: NADH：FMN氧化还原酶，分子量为 3000D，对FMN有高度特异性。E3: 脂肪酸还原酶。
发光细菌的培养：
(1)培养液：酵母浸出汁5.0g，胰蛋白胨5.0g，NaCl 30.0g， NaHPO4 5.0g，KH2PO4 1.0g，甘油3.0g，加蒸馏水至 1000ml,pH调至7±0.5，趁热分装于150ml三角瓶中，每瓶约
50ml，塞上棉球，用牛皮纸包扎好，经115℃、20-30min高
实验目的与内容
一、实验目的
1. 掌握发光细菌毒性测试的标准方法；
2. 根据发光细菌发光强度的变化判断
受试化合物的毒性；
3. 初步了解发光细菌毒性测试的影响因素。
二、实验内容
1. 发光细菌的复苏；
2. 发光细菌发光强度的测定；
3. 受试化合物毒性的计算。
实验目的与内容
发光细菌是一种非致病性的普通细菌，具有发光能力，在正 常条件下经培养后能发出肉眼可见的兰绿色光，这种发光过程 是细菌体内一种新陈代谢反应，是氧化呼吸链上的一个侧支。 发光细菌的发光反应模式图(1)所示。发光细菌发光反应途径可 简单概述为： FMNH2＋O2＋RCHO→荧光＋FMN＋H2O+RCOOH （1） 这个发光现象是呼吸代谢耦合，作为光能被散发。当细菌体 内合成萤光酶、萤光素、长链脂肪醛时，在氧的参与下发生生 化反应，反应的结果便产生光。
实验原理
发光菌的发光现象是其正常的代谢活动, 在一定条件下发 光强度是恒定的, 与外来受试物(无机、有机毒物, 抑菌、杀菌物 等) 接触后, 其发光强度即有所改变。变化的大小与受试物的浓 度呈相关关系, 同时与该物质的毒性大小有关。通常认为外来 受试物通过下面两个途径抑制细菌发光: (1) 直接抑制参与发光 反应的酶类活性; (2) 抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程(如 细胞呼吸等)。 毒物的毒性可以用EC50表示, 即发光菌发光强度降低50% 时毒物的浓度。实验结果显示, 毒物浓度与菌体发光强度呈线 性负相关关系。因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大 小, 用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。
北方某制药废水对发光细菌的急性毒性研究
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《急性毒性试验》课件
食品安全性评价
急性毒性试验：评 估食品中化学物质 的急性毒性
应用：用于食品添 加剂、农药残留、 食品包装材料等安 全性评价
意义：保障食品安 全，降低食品安全 风险
法规要求：各国食 品安全法规对急性 毒性试验有明确要 求
Part Six
急性毒性试验的局 限性
实验动物和人体的差异
物种差异：实验动物与人类在生理、 生化、遗传等方面存在差异
急性毒性与其他毒性试验的整合
整合目的：提高毒性试验的准确性和效率 整合方法：采用多学科、多领域的交叉研究 整合优势：降低试验成本，提高试验质量 整合挑战：需要解决不同毒性试验之间的差异和矛盾
急性毒性试验在特殊领域的应用
药物研发：评估药物的毒 性和副作用
环境监测：评估化学物质 对环境的影响
食品安全：评估食品添加 剂的安全性
代谢差异：不同物种对同一种物质的代谢能力可能不同 生理差异：不同物种的生理结构、功能可能不同，对同一种物质的反应可 能不同
实验条件和实际条件的差异
单击添加项标题
实验条件：实验室环境，可控因素较多
单击添加项标题
实验条件：单一剂量，单一时间
单击添加项标题
实验条件：单一物种，单一环境
单击添加项标题
实验条件：短期观察，短期影响
毒性反应的机制分析
毒性反应的类型：急性、亚急性、慢性 毒性反应的机制：细胞毒性、组织毒性、器官毒性 毒性反应的影响因素：剂量、时间、个体差异 毒性反应的检测方法：生物标志物、病理学检查、生理学检查
Part Five
急性毒性试验的应 用和意义
药物研发和安全性评价
药物研发：急性 毒性试验是药物 研发过程中的重 要环节，用于评 估药物的安全性 和有效性
发光细菌
优点： 由于发光细菌具有生长迅速、周 期短、测试费用低、同高等动物有着类似 的理化特性和酶作用过程，使其具有因快 速、简便、费用低廉、灵敏度高的特点， 能在短时间内得到可靠的毒性资料的优点， 因此被较多地用于毒性检测 。
发光细菌的发光原理
• 在这些特殊的氧化反应过程中能够产生自由能，这些自由能能够 使最后的产物处于激发态，从而能够产生光子。 • 发光细菌生长初期发光很弱，对数生长中期发光强度达到高峰， 稳定期时发光强度下降。
发光细菌法简介
发光细菌检测原理
• 发光细菌法是利用灵敏 的光电测量系统测定毒 物对发光细菌发光强度 的影响。 • 发光细菌含有荧光素、 荧光酶、ATP等发光要 素，在有氧条件下通过 细胞内生化反应而产生微弱荧光。当细胞活性升高， 处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增 强。
发光细菌的分类
• 明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）可在牛马的死尸和肉中繁 殖；它侵入人体则会产 生发光尿。
发光细菌的发光原理
• 一般来讲，在所有的生物发光细菌系统中，分子态的氧是直接或间接地 参与其生物化学反应的。 • 在细菌发光体中，分子态的氧氧化FMNH (还原态的黄素单核苷酸)和长 链脂肪醛，在这些反应中生成的能量不是用来质子梯度的建立、渗透反 应以及ATP的合成，而是直接以光的形式释放出来。 • 在这个反应模式中共有3种酶参与，分别为FMN还原酶，荧光素酶和脂肪 酸还原酶。
发光细菌法
• 一、发光细菌简介
1.发光细菌的分类 2.发光细菌的发光原理
• 二、发光细菌法简介
1.发光细菌检测原理 2.发光细菌检测方法 仪器与材料 测定步骤 3.发光细菌法的应用
测定工业废水的毒性 测定水域(水体)的毒性
发光菌的生物毒性测试方法
结果与数据处理
Байду номын сангаас1 相对发光度的平均值
相对发光度（%）=Hgcl2管或样品管发光量/CK管发光量 再求相对发光度平均值 2 建立并检验HgCl2浓度与其相对发光度均值的相关关系 先求出线性回归方程，再在一定的P值条件下查表进行r检测， 验证相关方程成立，然后做出两者的关系曲线，按照同样的方 法检测样品浓度与其相对发光度均值的相关性。
发光菌的生物毒性测试 方法
实验原理
1 发光菌的发光机理 细菌生物发光反应是由分子氧作用，胞内荧光酶催化， 将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为 FMN 及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长 为450-490nm处的蓝绿光。 2 实验原理 当发光细菌接触有毒污染物时,细菌新陈代谢则受到影 响,发光强度减弱或熄灭,发光细菌发光强度变化可用发 光检测仪测定出来。在一定浓度范围内,有毒物浓度大 小与发光细菌光强度变化成一定比例关系,因此可通过 发光细菌来监测环境中的有毒污染物。发光细菌应用最 多的是明亮发光杆菌,可以监测各种水体,对气体中可溶 性有毒物质,可先通过吸收、溶解在溶液中,再来观察其 对发光细菌的影响。
仪器介绍
DXY-2型生物毒性测试仪是基于毒性物质对 特殊的发光细菌的发光度的抑制作用而设 计的，它通过测定发光细菌发光度的变化， 量度被测环境样品中由重金属和其它有机 污染物所造成的急性生物毒性。
实验步骤
1 仪器的预热15min和调零 2 试管排列和滴加3%Nacl及样液
取出含有0.5g发光细菌冻干粉的安瓿瓶和 Nacl溶液，将安瓿瓶置于含有冰块的保温 3 细菌冻干菌剂复苏 瓶中，注入Nacl溶液混匀，2min后菌即复 取2ml测试管加2mlNacl3%溶液，10μ L复苏 苏发光 发光菌液，颠倒摇匀，测试发光量，倍率 4仪器检验复苏发光细菌冻干粉质量 调至X2，发光量高于600mv，此冻干粉可 用 发光菌液复苏满15min，用10μ L微量注射 器准确吸取10μ L复苏菌液，逐一加入各管 5 给各测试液加复苏菌液 摇匀（精确计时，记录到秒） 拔出样品室的盖子（红指示灯亮），将待 测样品液比色管放入，盖好盖子，抓住盖 子顺时针旋转（此时只绿指示灯亮）约16 读数 2s读数，抓住盖子顺时针旋转至原处（只 红指示灯亮）向上拔出盖子，取出样品。
化学发光法检测传染病优秀课件优选ppt资料
第十一页，共48页。
AutolumiS2000微粒子化学发光仪
第十二页，共48页。
第十三页，共48页。
全自动化学发光免疫分析(fēnxī)系统开发及其产业化，在2021 年12月通过国家科学技术委员会的鉴定，鉴定委员会认为：
该项目具有创新 性和自主(zìzhǔ)知识 产权，整体达到国际 先进水平。
❖ 批内、批间的分析重现性。
第二十二页，共48页。
微粒子化学发光试剂(shìjì)的精密度
HCV
1
2
3
4
5
…… Mean SD CV
批内 86.11 86.36 88.40 87.90 86.43 …… 86.27 1.55 1.79%
批间 74.59 73.63 69.64 71.90 71.96 …… 71.01 3.20 4.50%
S1, S2阴性, S3,S4,S5,S6阳性
L1、L2阳性， L3阴性，L4阴性
传统酶免法 特异性
(-/-)20/20 (+/+)3/3
(-/-)20/20 (-/-)15/15 (+/+)9/10
(-/-)15/15 (+/+)9/10
(-/-)15/15 (+/+)14/15
(-/-)29/30 (+/+)29/30 (-/-)18/20 (+/+)20/20 (-/-)20/20 (+/+)10/10
4.91% 2.14%
HBsAg
试剂(shìjì)性能多中心临床评估
HIV
HCV
相关性 显著相关 显著相关
相关系数 0.99 0.93
线性系数 0.98 0.99
AutolumiS2000微粒子化学发光仪
第十二页，共48页。
第十三页，共48页。
全自动化学发光免疫分析(fēnxī)系统开发及其产业化，在2021 年12月通过国家科学技术委员会的鉴定，鉴定委员会认为：
该项目具有创新 性和自主(zìzhǔ)知识 产权，整体达到国际 先进水平。
❖ 批内、批间的分析重现性。
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微粒子化学发光试剂(shìjì)的精密度
HCV
1
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…… Mean SD CV
批内 86.11 86.36 88.40 87.90 86.43 …… 86.27 1.55 1.79%
批间 74.59 73.63 69.64 71.90 71.96 …… 71.01 3.20 4.50%
S1, S2阴性, S3,S4,S5,S6阳性
L1、L2阳性， L3阴性，L4阴性
传统酶免法 特异性
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HBsAg
试剂(shìjì)性能多中心临床评估
HIV
HCV
相关性 显著相关 显著相关
相关系数 0.99 0.93
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发光细菌法急性毒性的测定
主要内容
一、 简 介 二、实验目的与内容 三、实验原理 四、实验材料与方法 五、实验步骤
六、注意事项
七、习题与思考
简 介
发光菌毒性测试是20世纪70年代后兴起
的一种微生物监测环境污染及检测污染物毒 性的新方法。 1978年美国 Beckman 公司即推出功能完备的生物发光 光度计“Microtox”，自此，这一急性毒性测试技术在世界 范围内迅速推广。因此人们也将发光菌毒性测试称为 Microtox测试。
实验材料与方法
1. 试剂：氯化汞（分析纯）；氯化钠（化学纯）；蒸馏水。 氯化钠溶液，2.0 g/100 ml (3.0 g/100 ml)，称取2.0 g (3.0 g)
氯化钠溶于100ml蒸馏水中，置于2-5℃冰箱备用。
氯化汞母液，2 000 mg/L，万分之一分析天平精称密封保存 良好的无结晶水氯化汞0.1000 g于50 ml容量瓶中，用3.0
发光细菌的培养：
(1)培养液：酵母浸出汁5.0g，胰蛋白胨5.0g，NaCl 30.0g， NaHPO4 5.0g，KH2PO4 1.0g，甘油3.0g，加蒸馏水至 1000ml,pH调至7±0.5，趁热分装于150ml三角瓶中，每瓶约
实验目的与内容
一、实验目的
1. 掌握发光细菌毒性测试的标准方法；
2. 根据发光细菌发光强度的变化判断
受试化合物的毒性；
3. 初步了解发光细菌毒性测试的影响因素。
二、实验内容
1. 发光细菌的复苏；
2. 发光细菌发光强度的测定；
3. 受试化合物毒性的计算。
实验目的与内容
发光细菌是一种非致病性的普通细菌，具有发光能力，在正 常条件下经培养后能发出肉眼可见的兰绿色光，这种发光过程 是细菌体内一种新陈代谢反应，是氧化呼吸链上的一个侧支。 发光细菌的发光反应模式图(1)所示。发光细菌发光反应途径可 简单概述为： FMNH2＋O2＋RCHO→荧光＋FMN＋H2O+RCOOH （1） 这个发光现象是呼吸代谢耦合，作为光能被散发。当细菌体 内合成萤光酶、萤光素、长链脂肪醛时，在氧的参与下发生生 化反应，反应的结果便产生光。
表1 氯化汞工作液稀释配制系列(稀释至50 ml容量瓶中)
氯化 汞工 作液 体积 ，ml
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
配制 氯化 汞浓 度， mg/L
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
0.24
2. 明亮发光杆菌T3小种 (Photobacterium phosphoreum T3 spp.)冻干粉，安培瓶包装，在2-5℃冰箱内有效保存期为6个 月。新制备的发光细菌休眠细胞(冻干粉)密度不低于每克800 万个细胞；冻干粉复苏2 min 后即发光，可在暗室内检验，肉 眼可见微光， 稀释成工作液后，经稀释平板法测定，每毫升菌液不低于 1.6万个细胞(5毫升测试管)或2万个细胞(2毫升测试管)。在 DXY-2型毒性测试仪上测出的初始发光量应在600-1900 mV之 间，低于600 mV允许将倍率调至“X2”档，高于1900 mV允 许将倍率调至“X0.5”档。仍达不到标准者，更换冻干粉。发 光细菌的毒性实验在美国Maxwell（MSI.） LuminMax-C 冷 光仪完成。
g/100ml氯化钠溶液稀释至刻度，置于2-5℃冰箱备用，保存
期6个月。
氯化汞工作液，2.0 mg/L，用移液管吸取氯化汞母液10 ml
入1000 ml容量瓶，用3.0 g/100ml氯化钠溶液定容。再用移液
管吸取氯化汞20 mg/L 液25 ml入250 ml容量瓶，用3.0 g/100 ml氯化钠溶液定容，将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶， 然后，用3.0 g/100 ml氯化钠溶液将氯化汞2.0 mg/L溶液按表1 稀释成系列浓度(稀释至50 ml容量瓶中)。配制的稀释液保存 期不超过24小时。
图 (1) 发光细菌的发光反应模式。E1: 细菌荧光素酶，由α、β 2个亚基组 成，α为40000~42000D，β为37000~39000D。单独α、β亚基均无发光活性， 只有α、β共存时才有活性。E2: NADH：FMN氧化还原酶，分子量为 3000D，对FMN有高度特异性。E3: 脂肪酸还原酶。
简 介
采用现代光电检测手段(生物发光光度计)的发光菌生物 毒性实验是毒理学中生物测定的方法之一。 该方法快速、
简便、灵敏、廉价,在有毒物质的筛选，环境污染生物学评
价等方面有重要的意义，因而备受各国有关研究者的关注。 1995年3月，国家环境保护局、国家技术监督局将发光 菌毒性测试定为水质监测标准方法(GB/T 15441-1995)。
NAD E2 NADH
+
FMNH2 O2 FMN H2O2 E1
E1 FMNH2 RCHO
O2
E1 FMNHOOH NADPH RCHO E3 RCOOH
E1+FMN+H2O2
E1 FMNH2 RCHO NADP+
E1 FMN 呼吸产能 H2O2 E1 FMN HOH hv RCOOH
O2 E1 FMNHOOH RCHO (Lump)
发光细菌的复苏
从冰箱内取出含有0.5 g 发光细菌冻干粉和氯化钠溶液，置 于含有冰块的小号保温瓶，用1 ml注射器吸取0.5 ml冷的氯化 钠2.0 g/100 ml溶液(适用于5ml的测试管)或1 ml 冷的氯化钠2.5
％溶液(适用于2 ml的测试管)注入冻干粉中，充分混匀。2 min
后菌即复苏发光，可在暗室观察，肉眼可见微光。备用。
实验原理
发光菌的发光现象是其正常的代谢活动, 在一定条件下发 光强度是恒定的, 与外来受试物(无机、有机毒物, 抑菌、杀菌物 等) 接触后, 其发光强度即有所改变。变化的大小与受试物的浓 度呈相关关系, 同时与该物质的毒性大小有关。通常认为外来 受试物通过下面两个途径抑制细菌发光: (1) 直接抑制参与发光 反应的酶类活性; (2) 抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程(如 细胞呼吸等)。 毒物的毒性可以用EC50表示, 即发光菌发光强度降低50% 时毒物的浓度。实验结果显示, 毒物浓度与菌体发光强度呈线 性负相关关系。因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大 小, 用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。
主要内容
一、 简 介 二、实验目的与内容 三、实验原理 四、实验材料与方法 五、实验步骤
六、注意事项
七、习题与思考
简 介
发光菌毒性测试是20世纪70年代后兴起
的一种微生物监测环境污染及检测污染物毒 性的新方法。 1978年美国 Beckman 公司即推出功能完备的生物发光 光度计“Microtox”，自此，这一急性毒性测试技术在世界 范围内迅速推广。因此人们也将发光菌毒性测试称为 Microtox测试。
实验材料与方法
1. 试剂：氯化汞（分析纯）；氯化钠（化学纯）；蒸馏水。 氯化钠溶液，2.0 g/100 ml (3.0 g/100 ml)，称取2.0 g (3.0 g)
氯化钠溶于100ml蒸馏水中，置于2-5℃冰箱备用。
氯化汞母液，2 000 mg/L，万分之一分析天平精称密封保存 良好的无结晶水氯化汞0.1000 g于50 ml容量瓶中，用3.0
发光细菌的培养：
(1)培养液：酵母浸出汁5.0g，胰蛋白胨5.0g，NaCl 30.0g， NaHPO4 5.0g，KH2PO4 1.0g，甘油3.0g，加蒸馏水至 1000ml,pH调至7±0.5，趁热分装于150ml三角瓶中，每瓶约
实验目的与内容
一、实验目的
1. 掌握发光细菌毒性测试的标准方法；
2. 根据发光细菌发光强度的变化判断
受试化合物的毒性；
3. 初步了解发光细菌毒性测试的影响因素。
二、实验内容
1. 发光细菌的复苏；
2. 发光细菌发光强度的测定；
3. 受试化合物毒性的计算。
实验目的与内容
发光细菌是一种非致病性的普通细菌，具有发光能力，在正 常条件下经培养后能发出肉眼可见的兰绿色光，这种发光过程 是细菌体内一种新陈代谢反应，是氧化呼吸链上的一个侧支。 发光细菌的发光反应模式图(1)所示。发光细菌发光反应途径可 简单概述为： FMNH2＋O2＋RCHO→荧光＋FMN＋H2O+RCOOH （1） 这个发光现象是呼吸代谢耦合，作为光能被散发。当细菌体 内合成萤光酶、萤光素、长链脂肪醛时，在氧的参与下发生生 化反应，反应的结果便产生光。
表1 氯化汞工作液稀释配制系列(稀释至50 ml容量瓶中)
氯化 汞工 作液 体积 ，ml
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
配制 氯化 汞浓 度， mg/L
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
0.24
2. 明亮发光杆菌T3小种 (Photobacterium phosphoreum T3 spp.)冻干粉，安培瓶包装，在2-5℃冰箱内有效保存期为6个 月。新制备的发光细菌休眠细胞(冻干粉)密度不低于每克800 万个细胞；冻干粉复苏2 min 后即发光，可在暗室内检验，肉 眼可见微光， 稀释成工作液后，经稀释平板法测定，每毫升菌液不低于 1.6万个细胞(5毫升测试管)或2万个细胞(2毫升测试管)。在 DXY-2型毒性测试仪上测出的初始发光量应在600-1900 mV之 间，低于600 mV允许将倍率调至“X2”档，高于1900 mV允 许将倍率调至“X0.5”档。仍达不到标准者，更换冻干粉。发 光细菌的毒性实验在美国Maxwell（MSI.） LuminMax-C 冷 光仪完成。
g/100ml氯化钠溶液稀释至刻度，置于2-5℃冰箱备用，保存
期6个月。
氯化汞工作液，2.0 mg/L，用移液管吸取氯化汞母液10 ml
入1000 ml容量瓶，用3.0 g/100ml氯化钠溶液定容。再用移液
管吸取氯化汞20 mg/L 液25 ml入250 ml容量瓶，用3.0 g/100 ml氯化钠溶液定容，将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶， 然后，用3.0 g/100 ml氯化钠溶液将氯化汞2.0 mg/L溶液按表1 稀释成系列浓度(稀释至50 ml容量瓶中)。配制的稀释液保存 期不超过24小时。
图 (1) 发光细菌的发光反应模式。E1: 细菌荧光素酶，由α、β 2个亚基组 成，α为40000~42000D，β为37000~39000D。单独α、β亚基均无发光活性， 只有α、β共存时才有活性。E2: NADH：FMN氧化还原酶，分子量为 3000D，对FMN有高度特异性。E3: 脂肪酸还原酶。
简 介
采用现代光电检测手段(生物发光光度计)的发光菌生物 毒性实验是毒理学中生物测定的方法之一。 该方法快速、
简便、灵敏、廉价,在有毒物质的筛选，环境污染生物学评
价等方面有重要的意义，因而备受各国有关研究者的关注。 1995年3月，国家环境保护局、国家技术监督局将发光 菌毒性测试定为水质监测标准方法(GB/T 15441-1995)。
NAD E2 NADH
+
FMNH2 O2 FMN H2O2 E1
E1 FMNH2 RCHO
O2
E1 FMNHOOH NADPH RCHO E3 RCOOH
E1+FMN+H2O2
E1 FMNH2 RCHO NADP+
E1 FMN 呼吸产能 H2O2 E1 FMN HOH hv RCOOH
O2 E1 FMNHOOH RCHO (Lump)
发光细菌的复苏
从冰箱内取出含有0.5 g 发光细菌冻干粉和氯化钠溶液，置 于含有冰块的小号保温瓶，用1 ml注射器吸取0.5 ml冷的氯化 钠2.0 g/100 ml溶液(适用于5ml的测试管)或1 ml 冷的氯化钠2.5
％溶液(适用于2 ml的测试管)注入冻干粉中，充分混匀。2 min
后菌即复苏发光，可在暗室观察，肉眼可见微光。备用。
实验原理
发光菌的发光现象是其正常的代谢活动, 在一定条件下发 光强度是恒定的, 与外来受试物(无机、有机毒物, 抑菌、杀菌物 等) 接触后, 其发光强度即有所改变。变化的大小与受试物的浓 度呈相关关系, 同时与该物质的毒性大小有关。通常认为外来 受试物通过下面两个途径抑制细菌发光: (1) 直接抑制参与发光 反应的酶类活性; (2) 抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程(如 细胞呼吸等)。 毒物的毒性可以用EC50表示, 即发光菌发光强度降低50% 时毒物的浓度。实验结果显示, 毒物浓度与菌体发光强度呈线 性负相关关系。因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大 小, 用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。