多克隆抗体制备
多克隆抗体制备
多克隆抗体制备多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。
【晶莱生物】具体实验步骤如下：1.兔子的准备挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.预采血（作阴性参照用）1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。
2. 兔子的免疫2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。
2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。
2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。
3.效价检测3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。
3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。
3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。
多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。
制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。
一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。
抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。
选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。
抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。
二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。
在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。
还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。
三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。
首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。
在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。
免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。
四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。
五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。
之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。
六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。
最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。
多克隆抗体单克隆抗体的制备流程
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多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体是一种由多个不同的B细胞克隆所产生的抗体，能够识别并结合多个抗原表位。
其制备过程主要包括以下几个步骤：
1. 免疫原的选择：选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面蛋白等。
2. 免疫动物的选择：根据抗原的物种来源，选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子、山羊等。
3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，激发免疫反应。
通常采用多次免疫，间隔一定时间进行。
4. 细胞融合：从免疫动物体内提取免疫细胞，通常采用脾细胞或骨髓细胞。
与骨髓或脾细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
5. 杂交瘤细胞筛选：采用筛选培养基，筛选出杂交瘤细胞，一般是通过对杂交瘤细胞进行限稀稀释培养，进行单克隆细胞的筛选。
6. 克隆抗体的生产：将单克隆细胞进行扩增，并进行细胞培养，使其产生大量的抗体。
多克隆抗体制备的原理是利用免疫动物的免疫系统产生多个克隆的抗体。
当免疫
原进入免疫动物体内时，会激发免疫细胞产生对应的免疫反应，形成多个不同的克隆细胞。
这些克隆细胞会产生具有不同的抗体结构的抗体分子。
通过细胞融合和杂交瘤筛选的步骤，可以筛选出产生目标抗原特异性抗体的单克隆细胞，并进行大规模生产。
这样就获得了能够结合多个抗原表位的多克隆抗体。
9、多克隆抗体的制备
（二）血清的分离
采血时一般不加抗凝剂，全血在室温中自然凝固， 在灭菌容器中使之与空气有较大的接触面。 先置于37℃ 1～2h，然后置于4℃冰箱过夜，次 日离心收集血清。 采血量大时，用自然凝固加压法 无菌的血清，组批分装，保存于之-15℃半成品 库，待抽检合格后交成品库保存。
多克隆抗体 （高免血清）制备技术
一般是指利用微生物及其代谢产物等作为免疫原，
经反复多次注射同一动物体，所生产的一类高效
价抗体，主要包括高度免疫血清、卵黄抗体和牛 奶抗体等
高度免疫血清简称高免血清（hyperimmune serum），又称免疫血清（immune serum）或抗 血清（antiserum） 分为抗病血清和抗毒素
产蛋鸡（鸭和鹅）感染某些病原后，其血清和蛋 黄内均可产生相应的抗体。
蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预 防和治疗，称为卵黄抗体（yak antibody）。 卵黄抗体可以在一定程度上克服血清抗体成本较 高、生产周期较长的弱点，并且具有用同批动物 连续生产的优点。 有潜伏野毒的危险，对生产用鸡应严格检疫。
七、血液采集与血清提取
按照免疫程序完成免疫的动物，经采血检验 （试血），血清效价达到合格标准时，即可 采血。
不合格者，再度免疫，多次免疫仍不合格者 淘汰。
（一）采血次数和方法
效价高峰在最后一次免疫后的7～10d。
采血可以全放血或部分采血。
放血前，动物应禁食24h，但需饮水以防止血 脂过高。
多克隆抗体制备课件
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免疫方式
• 注射途径: 免疫注射的途径也很重要。一般 采用多点注射，一只动物注射总数约为8～ 10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部 两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮内 易引起细胞免疫反应，对提高抗体效价有 利
多克隆抗体制备
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多克隆抗体的制备方法
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动物选择
一、选择制备多克隆抗体(抗血清)的动物种类 应考虑的要点: •需要制备的抗血清的质量; •供给蛋白质抗原的动物与免疫动物之间的种 系关系; •免疫动物产生的抗体特性（针对不同性质的 免疫原选用相应的动物）。 二、动物的年龄、性别和数量对抗体制备的 影响
血液采集
采血量
少量
采血部位
尾静脉，耳静脉，眼 底静脉
中量
耳中央动脉，颈动/静 脉，心脏
大量
股动脉，颈动脉，心 脏，摘眼球
血清的分离：采取4℃静置过夜，3000-4000 转离心10-15min钟。
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多克隆抗体纯化
•蛋白A亲和层析 •蛋白A可与多种哺乳动物的IgG重链的Fc片段 相结合也可与某些IgM和IgA相结合 •抗原亲和纯化 •多抗的亲和层析是基于抗原与抗体结合的一 种层析方式。基本思路是将抗原固定在一种 基质上, 然后与抗血清孵育以捕获相应的抗体, 然后从基质上洗掉非特异性结合的抗体, 最后 再将抗体洗脱下来
.鸡Biblioteka 鸡的种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白 质的抗体具有独特的优点。
鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体 成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物的 Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡 IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内可保 持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏条件 下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和单价 的Fab或Fab′等片段。 鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中, 从鸡蛋中收获抗体 可避免采用损伤性的收集手段。
多克隆抗体的制备流程及原理
多克隆抗体的制备流程及原理
多克隆抗体的制备流程及原理可以参考以下步骤：
1. 抗原免疫：使用目标抗原免疫动物，例如小鼠，在一定时间间隔内多次免疫。
抗原可以是纯化的蛋白质、多肽片段或者细胞/组织提取物。
2. 细胞融合：将免疫小鼠脾脏与骨髓中的浆细胞混合，然后使用聚乙二醇等方法促使细胞融合，获得杂交瘤细胞。
3. 杂交瘤筛选：将杂交瘤细胞悬浮液分别分装于多个培养皿中，含有杀死未融合细胞的培养基中，通过限制性稀释法或离子交换法，筛选出高产、单克隆抗体的杂交瘤细胞。
4. 单克隆抗体培养与提取：将筛选出的单克隆杂交瘤细胞进行扩增培养，获取大量的细胞。
然后通过细胞培养上清液、腹水或腹水灌洗法获得单克隆抗体。
多克隆抗体制备的原理如下：
多克隆抗体是指由多个不同的抗体产生细胞(即多克隆细胞)产生的一类抗体。
其制备的原理是通过免疫动物多次免疫，激发机体产生大量的抗原特异性抗体。
不同的抗原特异性抗体由不同的抗体产生细胞产生，并经过体内的嫁接与筛选，获
得了多个具有抗原特异性的抗体。
多克隆抗体具有较广泛的抗原特异性，可以识别目标抗原的不同位点，因此可以广泛应用于免疫学、分子生物学、生物医学等领域。
制备多克隆抗体
制备多克隆抗体的佐剂如用可溶性蛋白质抗原免疫家兔或山羊，•在加用佐剂时一次注入量一般为0.5～1mg/kg。
如不加佐剂，则抗原剂量应加大10～20倍。
佐剂有福氏(Freund’s)佐剂、脂质体佐剂、氢氧化铝佐剂、明矾佐剂以及免疫刺激复合物(immune stimulating complex，ICOM)等。
其中最常用的是福氏佐剂，•根据其组成分为完全福氏佐剂（CFA）•和不完全福氏佐剂（IFA）两种。
IFA 通常由羊毛脂1份、石腊油5份组成，每毫升IFA中加入1～20mg卡介苗即为CFA。
制备多克隆抗体免疫动物的选择由于抗原分子具有多种抗原决定簇，•每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体，这些由不同B细胞克隆产生的抗体称之为多克隆抗体。
多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高，是其独特的优点。
多克隆抗体的制备是一复杂的过程,为了制备高效价和高特异性的抗体，必须有理想的免疫原，挑选合适的动物和制定切实可行的免疫方案。
能作为免疫动物用的主要是哺乳类和禽类，其中常用的有家兔、绵羊、豚鼠和鸡，有时根据需要也可选用鼠、山羊和马等。
选择动物时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体的选择等因素。
如甾体激素多用家兔；对于难以获得的抗原，且抗体需要量少，可用纯系小鼠制备。
免疫用动物应选适龄、健壮，最好为雄性。
体重为25g左右Balb/c小鼠。
制备多克隆抗体抗原的准备和免疫原的注射剂量抗原的种类繁多，包括天然的蛋白质抗原和细胞性抗原、合成肽抗原以及基因工程抗原等，不同的抗原免疫动物动物具有不同的特殊性。
一般的完全抗原免疫动物需加用佐剂，合成肽抗原和基因工程抗原等半抗原物质需先通过人工的方法与蛋白质载体连接后再与佐剂混合免疫动物，方可获得理想的免疫效果。
•免疫原的注射剂量应考虑其抗原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。
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Elisa
免疫学实验
❖酶联免疫吸附（ enzyme-linked immunosorbent assay ， Elisa ）
❖ 利用抗原抗体反应的高度特异性和酶对底物高效 催化性，将抗原或抗体吸附于固相载体表面，通 过底物的显色反应鉴定抗原抗体结合的反应
·6·
ELISA的应用
免疫学实验
❖ ELISA是目前应用最广泛的免疫学检测技术之 一，常用来测量机体的可溶性的抗原或抗体。
Excess antibodies or non-binding components are washed away after incubation phase
3. Antibodies labeled with enzyme(conjµgate) directed against the particµLar species in which the original antibodies were produced(antispecies).
500µL 抗体稀释液
(PBS)
·20·
加板方法
免疫学实验
加A 佐B 剂 组CD1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
不E
加F 佐 剂G 组H
每组一块96孔板，每个样三个复孔，纵向排列。加样如下： 1- 7: 不同稀释度的抗体，依次为1/200，1/400，1/800，1/1600，1/3200， 1/6400， 1/12800； 8：阴性对照孔。
·21·
结果判定
免疫学实验
❖抗体效价: 1. 出现颜色变化的抗体最高稀释倍数 （目测） 2. 二倍于阴性对照OD值(酶标仪）
·19·
抗体的倍比稀释
免疫学实验
5µL 抗体(血清)
500µL 500µL 500µL 500µL 500µL 500µL
995µL
抗体稀释液 （PBS）
1
2345 6 7
1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800
加佐剂组和不加佐剂组血清 各做一套上述稀释度
❖ 由于它敏感性高，可测微量的的抗体或激素、 细胞因子及粘附分子等抗原性物质。
❖ 成品的试剂盒，已广泛用于临床某些疾病的诊 断。
·13·
ELISA分类
免疫学实验
❖直接法——一抗带酶 检测抗体
❖间接法——二抗带酶 ❖双抗夹心法——检测抗原
▪ 直接夹心法 ▪ 间接夹心法
·14·
免疫学实验
直 接 法
·15·
用。
❖拉颈处死小鼠。
·4·
免疫小鼠血清抗体效价测定
免疫学实验
❖酶联免疫吸附（ enzyme-linked immunosorbent assay ， Elisa ）
❖ 利用抗原抗体反应的高度特异性和酶对底物高效 催化性，将抗原或抗体吸附于固相载体表面，通 过底物的显色反应鉴定抗原抗体结合的反应
·5·
4.These bind to any antibodies which are attached to antigen. Excess conjµgante is washed away after a period of incubation
间 接 法
5. Substrate/chromophore is added and color develops as a resµLt of enzyme present.
After a period of incubation of the colour development is ptopped and read by spectrophotometer
·16·
免疫学实验
直 接 夹 心 法
·17·
免疫学实验
间 接 夹 心 法
·18·
实验步骤
免疫学实验
❖ 包 被: OVA抗原(50ug/ml) 100µL/孔, 4 ℃过夜. 封 闭：弃上清, 加入封闭液 150 µL/孔, 37℃，
40min. 洗 涤: 加洗液200ul/孔，洗涤三次, 每次3分钟. 一 抗: 弃上清, 加入不同稀释度的待测血清抗体100
µL/孔 37℃ ，40min. 洗 涤: 加洗液200ul/孔，3分钟,弃上清，再重复两次 酶标抗体: 加入HRP标二抗100 µL/孔37℃ 40min. 洗 涤: 洗涤三次, 每次3分钟 显 色: 加入底物100 µL/孔，避光15min 加终止液: 加2M硫酸 50 µL/孔 测 量: 酶标仪测定OD 490nm值.
实验器材及物品分配
免疫学实验
试剂:
抗原：OVA（卵清蛋白） 抗体： 一级抗体：小鼠血清 二级抗体：HRP-Ab 封闭液：1% BSA 包被缓冲液 抗体稀释液：PBS 洗液：PBST 底物溶液：OPD 终止液：2M 硫酸 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂
器材: 96孔板 加样器(一套） 加样器头（一套） 吸水纸（若干） 酶标仪（一台）
1. Antigen is passively absorbed to solid phase by incubation
免疫学实验
2. Antibodies are added and incubated with solid-phase attached antigen. Those which are specific will bind to antigen
❖ 抗原：OVA 7天免疫一次，共三次 ❖ 免疫佐剂
▪ 弗氏佐剂(Immunoadjuvant )
• 完全弗氏佐剂（石蜡油+羊毛脂+卡介苗） • 不完全弗氏佐剂（石蜡油+羊毛脂）
▪ 细胞因子
• IL-2、IL-1、IFN-γ、IL-12、GM-CSF
·3·
制备血清
免疫学实验
❖摘取小鼠眼球，用1.5ml EP管接血。 ❖ 4000rpm，离心10分钟，吸取上清（血清）待
·1·
主要操作步骤
免疫学实验
一、免疫小鼠 二、制备血清 三、用Elisa法检测血清中抗体的效价
·2·
免疫小鼠
免疫学实验
❖ 免疫方式 ▪ 肌肉注射（intramuscular injection ，i.m.） ▪ 腹腔注射（intraperitoneal injection，i.p. ） ▪ 皮下注射（subcutaneous injection，s.c.） ▪ 静脉注射（intravenous injection ，i.v.）