多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体制备
多克隆抗体制备多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。
【晶莱生物】具体实验步骤如下：1.兔子的准备挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.预采血（作阴性参照用）1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。
2. 兔子的免疫2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。
2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。
2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。
3.效价检测3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。
3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。
3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。
多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。
制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。
一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。
抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。
选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。
抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。
二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。
在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。
还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。
三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。
首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。
在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。
免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。
四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。
五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。
之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。
六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。
最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。
多克隆抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体是一种由多个不同的B细胞克隆所产生的抗体，能够识别并结合多个抗原表位。
其制备过程主要包括以下几个步骤：
1. 免疫原的选择：选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面蛋白等。
2. 免疫动物的选择：根据抗原的物种来源，选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子、山羊等。
3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，激发免疫反应。
通常采用多次免疫，间隔一定时间进行。
4. 细胞融合：从免疫动物体内提取免疫细胞，通常采用脾细胞或骨髓细胞。
与骨髓或脾细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
5. 杂交瘤细胞筛选：采用筛选培养基，筛选出杂交瘤细胞，一般是通过对杂交瘤细胞进行限稀稀释培养，进行单克隆细胞的筛选。
6. 克隆抗体的生产：将单克隆细胞进行扩增，并进行细胞培养，使其产生大量的抗体。
多克隆抗体制备的原理是利用免疫动物的免疫系统产生多个克隆的抗体。
当免疫
原进入免疫动物体内时，会激发免疫细胞产生对应的免疫反应，形成多个不同的克隆细胞。
这些克隆细胞会产生具有不同的抗体结构的抗体分子。
通过细胞融合和杂交瘤筛选的步骤，可以筛选出产生目标抗原特异性抗体的单克隆细胞，并进行大规模生产。
这样就获得了能够结合多个抗原表位的多克隆抗体。
9、多克隆抗体的制备
（二）血清的分离
采血时一般不加抗凝剂，全血在室温中自然凝固， 在灭菌容器中使之与空气有较大的接触面。 先置于37℃ 1～2h，然后置于4℃冰箱过夜，次 日离心收集血清。 采血量大时，用自然凝固加压法 无菌的血清，组批分装，保存于之-15℃半成品 库，待抽检合格后交成品库保存。
多克隆抗体 （高免血清）制备技术
一般是指利用微生物及其代谢产物等作为免疫原，
经反复多次注射同一动物体，所生产的一类高效
价抗体，主要包括高度免疫血清、卵黄抗体和牛 奶抗体等
高度免疫血清简称高免血清（hyperimmune serum），又称免疫血清（immune serum）或抗 血清（antiserum） 分为抗病血清和抗毒素
产蛋鸡（鸭和鹅）感染某些病原后，其血清和蛋 黄内均可产生相应的抗体。
蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预 防和治疗，称为卵黄抗体（yak antibody）。 卵黄抗体可以在一定程度上克服血清抗体成本较 高、生产周期较长的弱点，并且具有用同批动物 连续生产的优点。 有潜伏野毒的危险，对生产用鸡应严格检疫。
七、血液采集与血清提取
按照免疫程序完成免疫的动物，经采血检验 （试血），血清效价达到合格标准时，即可 采血。
不合格者，再度免疫，多次免疫仍不合格者 淘汰。
（一）采血次数和方法
效价高峰在最后一次免疫后的7～10d。
采血可以全放血或部分采血。
放血前，动物应禁食24h，但需饮水以防止血 脂过高。
多克隆抗体制备课件
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免疫方式
• 注射途径: 免疫注射的途径也很重要。一般 采用多点注射，一只动物注射总数约为8～ 10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部 两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮内 易引起细胞免疫反应，对提高抗体效价有 利
多克隆抗体制备
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多克隆抗体的制备方法
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动物选择
一、选择制备多克隆抗体(抗血清)的动物种类 应考虑的要点: •需要制备的抗血清的质量; •供给蛋白质抗原的动物与免疫动物之间的种 系关系; •免疫动物产生的抗体特性（针对不同性质的 免疫原选用相应的动物）。 二、动物的年龄、性别和数量对抗体制备的 影响
血液采集
采血量
少量
采血部位
尾静脉，耳静脉，眼 底静脉
中量
耳中央动脉，颈动/静 脉，心脏
大量
股动脉，颈动脉，心 脏，摘眼球
血清的分离：采取4℃静置过夜，3000-4000 转离心10-15min钟。
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多克隆抗体纯化
•蛋白A亲和层析 •蛋白A可与多种哺乳动物的IgG重链的Fc片段 相结合也可与某些IgM和IgA相结合 •抗原亲和纯化 •多抗的亲和层析是基于抗原与抗体结合的一 种层析方式。基本思路是将抗原固定在一种 基质上, 然后与抗血清孵育以捕获相应的抗体, 然后从基质上洗掉非特异性结合的抗体, 最后 再将抗体洗脱下来
.鸡Biblioteka 鸡的种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白 质的抗体具有独特的优点。
鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体 成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物的 Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡 IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内可保 持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏条件 下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和单价 的Fab或Fab′等片段。 鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中, 从鸡蛋中收获抗体 可避免采用损伤性的收集手段。
实验一多克隆抗体的制备(颗粒性抗原)
上海师范大学实验报告专业、年级生物科学班级姓名学号课程名称免疫学实验名称多克隆抗体的制备（颗粒性抗原）实验日期2011年9月至10月基本原理免疫动物是通过给待免疫的动物注射抗原，使其获得相应的抗体的过程。
抗原给予的方法不仅对免疫应答的起始有较大影响，而且决定着对新注射抗原的免疫吞噬和吞噬后加工处理的细胞类型，并影响对其发生免疫应答的外周淋巴器官。
材料(一)动物：健康雄性家兔2只(二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。
(三)试剂1.灭菌生理盐水；2.单克隆过夜培养的坂崎肠杆菌，用灭菌生理盐水洗涤后，反复冻融3~5次，-20℃保存；3.消毒酒精及碘酒。
免疫方法1.第一次免疫: 用1ml注射器吸取1ml已升温至室温的1×107/mL坂崎肠杆菌混悬液，每侧臀部皮下各注射0.5ml。
2.第二次免疫: 间隔14天后再用1ml注射器吸取1ml已升温至室温的1×107/mL坂崎肠杆菌混悬液，每侧臀部皮下各注射0.5ml。
3.间隔14天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以凝集反应试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。
效价至少应达到1∶16以上时才能放血。
4若效价未达到要求，可再次进行加强注射，隔14天后再试血。
放血颈动脉放血将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。
放血过程中要严格按无菌要求进行。
分离血清将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。
待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。
于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，最终浓度)，分装后置4℃冰箱中保存备用。
多克隆抗体的名词解释
多克隆抗体的名词解释多克隆抗体（Polyclonal Antibodies）指的是由多个免疫细胞分泌的抗体所组成的混合群集。
它们的产生源于免疫系统对外来抗原的免疫应答过程。
多克隆抗体的形成包括多个B细胞克隆繁殖和分化，每个克隆细胞产生的抗体略有不同，因此呈现多样性。
多克隆抗体的制备可通过动物免疫或体外方法获得。
动物免疫法是最常用的制备多克隆抗体的方法之一。
在此方法中，动物（如小鼠、兔子等）被注射具有抗原性的物质，刺激免疫系统产生抗体。
随着时间的推移，免疫系统会生成多个B细胞克隆，每个克隆都会产生特定的抗体。
继而，从动物体内采集血清以获得多克隆抗体。
体外方法也能制备多克隆抗体，它通过将抗原添加到体外培养的免疫细胞中，例如淋巴细胞或骨髓细胞。
这些免疫细胞与抗原接触后，会分泌出一系列具有不同特异性的抗体。
多克隆抗体在科学研究和诊断应用中具有广泛的用途。
首先，多克隆抗体能够同时识别多个抗原表位，因为通过免疫原处理产生的抗体是由多个克隆细胞所分泌，因此对目标抗原具有多个抗体的覆盖，增加了检测的灵敏性和特异性。
此外，多克隆抗体还具有在不同实验条件下鲁棒的可重复性，使其成为许多实验室中常用的工具。
在疾病诊断中，多克隆抗体也发挥着重要的作用。
通过制备针对特定疾病标记物的多克隆抗体，可以进行准确、敏感的疾病检测。
例如，在癌症早期筛查中，通过使用针对特定癌细胞标志物的多克隆抗体，可以帮助识别早期癌症病例。
多克隆抗体还广泛应用于生物医药研究中，在药物研发、蛋白质识别和定量分析等领域发挥着重要角色。
然而，多克隆抗体也存在一些局限性。
由于多克隆抗体是由免疫细胞分泌的抗体混合物，其中可能存在非特异性抗体，这些抗体无法区分目标抗原。
此外，多克隆抗体的制备涉及动物实验，存在动物福利和伦理问题，因此在科研界推动开发替代方法以避免或减少动物免疫的使用。
总的来说，多克隆抗体是一类由多个克隆B细胞分泌的抗体所组成的抗体混合物。
多克隆抗体广泛应用于科学研究和诊断应用中，具有多样性和灵敏性优势，为疾病检测和药物研发提供了有力的工具。
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多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的概念：由多个B淋巴细胞克隆所产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可与多种抗原表位结合的抗体。
多克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：免疫动物、佐剂、免疫原、免疫、取血等。
多克隆抗体的制备步骤
一、器材
剪刀(剪兔毛用)一把、弯头眼科手术镊子(游离血管用)一把、直头眼科手术剪(剪血管用)一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿(直径18cm)、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。
二、试剂
生理盐水(或PBS)
弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)
弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA)
二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3
三、免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。
每次免疫100-200μg免疫原。
四、兔子的选择
兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。
五、免疫
用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/4的免疫原。
这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
注：
抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。
待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。
取血量约5ml足矣。
免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。
抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。
将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。
首次免疫用FCA，以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多点注射法。
即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好)。
每次免疫的抗原量约100μg。
免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。
六、取血：
免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。
因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低，头两次取血，够检测用即可。
在三次免疫后，可以获得较高效价的抗体，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否则会造成兔子贫血。
前几次取血用19号针头对兔子进行耳动脉取血，室温过夜析出血清。
最后一次取血可以采用颈动脉放血，具体操作如下：
1、家兔仰卧于兔架上固定头部，用纱布固定四肢。
头部略放低以暴露颈部。
剃毛并消毒皮肤。
2、沿颈部中线用手术刀切开皮肤约10cm，分离皮下结缔组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌(小心操作，如碰到小血管出血，可用止血钳止血)。
3、用直头止血钳分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后用弯头眼科镊使之游离，剥离神经和结缔组织。
4、于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。
结扎远心端的丝线。
近心端的动脉用血管夹夹住。
5、用小拇指垫在血管下，用尖头眼科手术剪在两根丝线间的动脉璧上剪一小口(勿剪断)，插入塑料放血管。
再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱。
6、松开止血钳，使血液流入容器中。
一般一只家兔可放血100-120ml。
七、血清的分离
如果用三角瓶或平皿盛血，将器皿倾斜放置于37oC烘箱2hr，转移到4oC沉淀过夜，第二天早上用吸管吸取血清。
如果用离心管收集，37oC烘箱放置2hr，转移到4oC沉淀过夜，第二天早上离心，10000RCF，10分钟。
在血清中加入NaN3 至终浓度0.02%，分装后-20oC保存。
小结：抗血清获得之前要件的抗体的效价、抗体的特异性以及抗体的亲和力；获得抗血清之后，要分装保存抗血清，一般情况下，-20度可保存数月至数年抗体的效价都不会发
生变化。
抗体的效价可以通过琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验进行鉴定。
来源：生物帮
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