多克隆抗体的原理及制作方法
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。
多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。
制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。
一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。
抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。
选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。
抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。
二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。
在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。
还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。
三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。
首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。
在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。
免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。
四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。
五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。
之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。
六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。
最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法多克隆抗体的概念：由多个B淋巴细胞克隆所产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可与多种抗原表位结合的抗体。
多克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：免疫动物、佐剂、免疫原、免疫、取血等。
多克隆抗体的制备步骤一、器材剪刀(剪兔毛用)一把、弯头眼科手术镊子(游离血管用)一把、直头眼科手术剪(剪血管用)一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿(直径18cm)、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。
二、试剂生理盐水(或PBS)弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA)二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3三、免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。
每次免疫100-200μg免疫原。
四、兔子的选择兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。
五、免疫用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/4的免疫原。
这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
注：抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。
待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。
取血量约5ml足矣。
免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。
抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。
将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。
首次免疫用FCA，以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多点注射法。
即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好)。
多克隆抗体
多克隆抗体多克隆抗体: 原理、应用和优势摘要：多克隆抗体是一种可以广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗的重要工具。
本文将介绍多克隆抗体的原理、应用和优势，帮助读者更好地了解和使用多克隆抗体。
1. 引言多克隆抗体是由多个不同的B细胞克隆所产生的抗体群体。
相比于单克隆抗体，多克隆抗体具有多种来源细胞、多样性抗体特异性和高抗原亲和力的优势。
2. 多克隆抗体的原理多克隆抗体的制备需要经历免疫原注射、免疫细胞制备、抗体筛选和克隆扩增等步骤。
通过注射抗原刺激机体免疫系统，激发B细胞产生特异性抗体。
然后通过细胞融合技术或酶消化法获得抗体产生的细胞系，最后经过筛选和扩增获得多克隆抗体。
3. 多克隆抗体的应用多克隆抗体在生物医学研究、生物工程和医学诊断等领域具有重要应用价值。
在科研中，多克隆抗体可用于蛋白质表达分析、免疫组化染色、免疫印迹、酶联免疫吸附测定等实验技术。
在临床诊断中，多克隆抗体可用于检测病原体感染、肿瘤标志物和药物浓度。
此外，多克隆抗体还可应用于治疗，如癌症免疫治疗和抗体药物研发。
4. 多克隆抗体的优势相比于单克隆抗体，多克隆抗体具有以下几个优势：4.1 多源性：多克隆抗体通过多个细胞克隆产生，能够识别抗原上的多个不同部位，从而提高抗体的特异性和亲和力。
4.2 可灵敏性：多克隆抗体可以通过融合多个细胞系来增加抗体的生产量，提高实验的灵敏性和可靠性。
4.3 高特异性：多克隆抗体可识别抗原上多个不同的表位，在检测复杂样本中具有更高的特异性。
4.4 宽适应性：多克隆抗体对于不同类型的抗原具有较强的适应性，可以应用于多种研究领域和技术平台。
5. 多克隆抗体的挑战与优势相对应的是多克隆抗体也存在一些挑战。
制备多克隆抗体需要免疫动物，然后通过脾细胞和骨髓细胞等制备免疫细胞，这个过程较为复杂且不易实施。
此外，多克隆抗体的批次间差异性较大，因此需要进行一定的筛选和验证工作。
6. 结论多克隆抗体作为一种重要的实验工具，在生物医学研究、生物工程和医学诊断等领域发挥着重要作用。
多克隆抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
实验十四大肠杆菌多克隆抗体的制备与检测
四、实验内容与步骤
• 1、抗原的制备 • 大肠杆菌菌悬液→60℃水浴1h →稀释达9 亿个/毫升→无菌检查 • 2、免疫血清的制备 • 家兔耳缘静脉注射免疫 • 采血制备血清 • 3、凝集反应
实验十四 大肠杆菌多克隆抗体的制备与检测
一、实验目的
• 1、学习掌握多克隆抗体制备原理与方法 • 2、学习掌握凝集反应原理与方法
二、实验原理
• 1、多克隆抗体 • 由多个克隆细胞产生的多种抗体的混合物 即多克隆抗体，也称第一代人工抗体 天然抗原(多个抗原表位)机体诱发多个B细 胞克隆活化
产生多种针对不同表位的 相应抗体—多克隆抗体
2、凝集反应
• 颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞 等）与相应抗体结合，在有电介质存在的 条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的 凝集小块。 • 参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称 为凝集素。可分为直接凝集反应和间接凝 集反应两类。
三、实验器材
• 恒温培养箱、高速离心机 • 大肠杆菌、生理盐水、载玻片、家兔等
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体是一种由多个不同的B细胞克隆所产生的抗体，能够识别并结合多个抗原表位。
其制备过程主要包括以下几个步骤：
1. 免疫原的选择：选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面蛋白等。
2. 免疫动物的选择：根据抗原的物种来源，选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子、山羊等。
3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，激发免疫反应。
通常采用多次免疫，间隔一定时间进行。
4. 细胞融合：从免疫动物体内提取免疫细胞，通常采用脾细胞或骨髓细胞。
与骨髓或脾细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
5. 杂交瘤细胞筛选：采用筛选培养基，筛选出杂交瘤细胞，一般是通过对杂交瘤细胞进行限稀稀释培养，进行单克隆细胞的筛选。
6. 克隆抗体的生产：将单克隆细胞进行扩增，并进行细胞培养，使其产生大量的抗体。
多克隆抗体制备的原理是利用免疫动物的免疫系统产生多个克隆的抗体。
当免疫
原进入免疫动物体内时，会激发免疫细胞产生对应的免疫反应，形成多个不同的克隆细胞。
这些克隆细胞会产生具有不同的抗体结构的抗体分子。
通过细胞融合和杂交瘤筛选的步骤，可以筛选出产生目标抗原特异性抗体的单克隆细胞，并进行大规模生产。
这样就获得了能够结合多个抗原表位的多克隆抗体。
多克隆抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
多克隆抗体的制备
50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白； 8%～12%PEG6000可沉淀IgG。
超滤法： 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原 物质进行滤筛。
电泳
层析法： 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 疏水层析 反相层析
精分离
蛋白鉴定
抗体亲合常数测定
亲合常数测定采用非竞争酶免疫试验法：
先确定在某一抗原浓度时抗体可以达到饱和；
以该抗原浓度为实验条件，饱和时的OD值作为OD-100， 找出OD-50时的抗体浓度和相应的抗原浓度；
根据公式Ka= n-1
计算抗体的Ka值。
2(n[Ab’]t-[Ab ]t)
t代表测定时的温度； n=[Ab]t/[Ab’]t； [Ab]t 表示抗原浓度较高的Amax的一半； [Ab’]t表示抗原浓度较低的Amax的一半。
免疫原的制备
免疫原（immunogen）： 指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞 的抗原最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）.
免疫原种类： 天然抗原、人工合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原。
细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清）。
白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。
（2）多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一类良 好的载体，常用的有多聚赖氨酸。
（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素 (CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐剂可诱导动物 产生良好的抗体。
连接方法：
物理法：是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原 理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有 PVP和CMC等；
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多克隆抗体的原理及制作方法
一、原理
多克隆抗体是由针对多种不同抗原表位的抗体组成的混合物。
外源性抗原初次进入动物体内后，可引发机体初次免疫应答，即在抗原呈递细胞（antigenpresenting cell，APC）和T细胞的作用下，未
成熟B细胞被激活分化为产生抗体的浆细胞，对于大多数可溶性蛋白抗原而言，动物注射后5～7天，血清中开始出现抗体，并在12天左右达到顶峰，然后逐渐下降。
初次免疫应答产生的抗体持续时间较短，亲和力也较低。
但是受抗原刺激的B细胞除了分化为抗体产生细胞外，还增殖形成大量记忆性B细胞，它们在实施加强免疫时被快速激活，加强免疫后抗体滴度迅速上升，并持续更长时间，抗体合成率也比初次反应增加几倍到几十倍，加强免疫后7～14天出现抗体的峰值。
由于记忆B细胞的存在，需要更少的抗原刺激即可引起再次免疫应答。
记忆B细胞是长寿细胞，因此，特异性抗体应答在最后一次加强免疫之后6个月到一年都会存在。
本节介绍用佐剂乳化的抗原免疫动物获得多克隆抗血清的方法。
该法可用于免疫家兔，小鼠、大鼠或地鼠，也可用于更大的动物如绵羊、山羊或马。
二、材料
（一）动物选择
根据需要可选择适当品系的家兔，小鼠，大鼠或地鼠等动物进行免疫获得抗体。
动物的选择取决于所需的抗血清量以及特异性抗原的
物种来源和免疫动物物种之间进化上的差异。
家兔常被选作免疫动物，因为兔与人、兔与小鼠之间的遗传学差异大，而人和小鼠来源的蛋白是最经常被研究的对象。
每次获取25ml血清的采血量，对兔本身没
有明显的损伤。
（二）抗原
制备优质抗血清很大程度上取决于抗原的质量、纯度和数量。
常用纯化的抗原或部分纯化的抗原免疫动物，所用抗原往往是蛋白质或肽。
一般而言，细菌或病毒蛋白如血凝素或细菌包膜蛋白有很强的免疫原性，而哺乳动物蛋白如多肽类激素或细胞膜受体则免疫原性较弱。
有时也会用到与适当的蛋白质载体、细胞或细胞与组织提取物相交联的半抗原（多糖、核酸、脂类和小分子化学物质等）以增强半抗原的免疫原性，通过化学方法将半抗原连接到已知的免疫原性强的载体蛋白上，常用的载体蛋白有匙孔戚血蓝素（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）等。
对于蛋白质抗原，可以是天然蛋白或变性构
象的蛋白，这主要决定于抗体的用途。
比如用于筛选细菌cDNA表达
文库或免疫印迹的抗体，最好用变性蛋白制备抗血清；而筛选真核生物转染系统表达的cDNA产物、或对天然细胞合成的蛋白进行免疫印
迹检测时，最好用天然蛋白质制备的抗血清。
需要注意的是，少量的非目标污染物往往比目标免疫原的抗原性更强，所得抗血清对非目标蛋白的活性比对目标蛋白的结合能力更强。
（三）佐剂
佐剂是能非特异性增强抗原免疫原性，也可改变免疫应答类型的物质。
它通过改变抗原物理性状，延长抗原在体内存留时间，增强APC对抗原的呈递和处理能力，刺激淋巴细胞增殖从而扩大免疫应答反应。
目前常用的佐剂有以下几种：①福氏佐剂（Freund adjuvant，FA），是一种最常用的油包水（water-in-oil）佐剂。
根据加或不加灭活分枝杆菌而分为完全福氏佐剂（complete Freunds adjuvant，CFA）和不完全福氏佐剂（incomplete Freunds adjuvant，IFA）。
CFA 含有羊毛脂、矿物质油和灭活分枝杆菌，不但能增强免疫原性，也能改变免疫应答的类型；IFA中仅含羊毛脂和矿物质油，可增强抗原免疫原性。
值得注意的是，CFA是极强的炎性物质，尤其是注射到皮内或眼睛可能引起严重皮肤腐烂或视力丧失。
因此处理CFA时需使用手套和保护性眼罩。
②生物来源的佐剂如卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、细菌内毒素、大肠埃希菌脂多糖、植物血凝素等。
③无机化合物佐剂如氢氧化铝、钾明矾等。
④人工合成佐剂如多聚肌苷酸-多聚胞苷酸［poly（IC）］、多聚腺苷酸-多聚尿苷酸［poly（A-U）］、脂质体和CpG寡核苷酸佐剂等。
免疫佐剂常与抗原同时注入动物体内。
选择安全有效的佐剂用于动物免疫是备受关注的问题。
福氏佐剂因其免疫效果可靠能获得较高的抗体滴度而广泛地使用了50余年。
然而，由于这种佐剂的使用常给动物带来一定程度的痛苦和不适，研究者在积极寻找相应替代品。
本节主要介绍福氏佐剂免疫法（CFA/IFA免疫法）。
三、免疫步骤（CFA/IFA免疫法）
1.佐剂的制备福氏完全佐剂和不完全佐剂可以选择市售品，也可以自制。
自制福氏佐剂时，将液状石蜡与羊毛脂按5∶3比例混合（也有研究者使用的比例为3∶5，佐剂中羊毛脂含量高，与抗原混合后研磨时，较易达到油包水状态），煮沸或高压灭菌，趁热混匀，即成不完全佐剂。
在油相中加入卡介苗，使其终浓度为0.25mg/ml，即为福氏完全佐剂。
自制佐剂在室温保存过程中，福氏佐剂会变得浓稠，卡介苗常沉淀于容器底部，使用前需要水浴加热，充分混匀。
2.免疫前动物采血，分离血清作为对照。
3.免疫抗原的准备充分混匀CFA。
用PBS（不要使用含Tris的缓冲液）溶解蛋白抗原至0.25～0.5mg/ml，加2ml CFA至2ml蛋白抗原中，制备的免疫原足够免疫4只家兔和80只小鼠。
4.用3ml玻璃注射器（19-G针头）吸取CFA/抗原混合物。
移去针头，尽可能排除空气，将注射器连上接合器或三通旋塞，在另一头连上一个空的3ml玻璃注射器。
推动注射器栓，使混合物从一个注射器进入另一个注射器，如此反复来回推动。
直到混合物颜色变白成为“油包水”状的乳化悬液。
去掉接合器或旋塞，接上21-G针头，将一小滴乳液滴在50ml冷水的表面，检测乳状物是否稳定。
乳化好的油包水乳状液应该在水面上结合很紧，形成乳滴；如果乳滴很快分散，则需重复上述操作来混匀抗原以形成乳状物。
另一种做法：将抗原与佐剂混合物置于乳钵中研磨，使其成为油包水状态。
我们的经验是在冰浴中研磨，或将其保持在低温状态，易于得到抗原/佐剂油包水乳
液免疫抗原的准备。
5.将全部抗原佐剂乳液移到一个注射器中，接上22-G针头到注射器并去除气泡。
6.固定动物将佐剂/抗原乳液注射到动物体内。
常用的免疫途径有：皮内、皮下、肌肉、淋巴结、腹腔、足垫等。
初次免疫一般选择吸收缓慢的途径，以延长抗原刺激时间。
免疫家兔时，多选择背部多点皮下注射（10～20个点），免疫小鼠多用腹腔注射。
7.初次免疫10～14天后抽取少量静脉血，分离血清。
8.按以上步骤2～4准备抗原进行加强免疫，加强免疫用IFA为佐剂。
9.初次免疫2～8周后开始加强免疫，7～14天后抽取血样，分离血清。
10.加强免疫间隔时间为1～2周，连续加强数次。
初次免疫前后、每次加强免疫后，均需采集动物血样并分离血清检测抗体滴度。
四、分离血清
免疫完成后即可给动物放血，放血前动物应禁食24小时。
采血方法参见第四十三章“免疫细胞分离纯化技术”。
1.将血样装在离心管或平皿中于室温放置4小时或4℃过夜，直到形成血凝块。
2.用一根木棒从离心管或平皿侧面轻轻拨动血凝块，然后用木棒
除去血凝块。
3.将血清转移到50ml离心管中。
4℃，4000r/min离心10分钟，沉淀血细胞和碎片，立即吸出血清。
4.通过免疫印迹法、免疫沉淀、ELISA、双向免疫扩散等方法测定抗体滴度和特异性。
5.血清分装，保存于-20℃。
合格的抗血清经56℃30分钟加热处理，加入适当的防腐剂后分装保存于-20℃，数月至数年内效价无明显变化。
防腐剂可用0.8g/L硫柳汞、1.0g/L酚、1.0g/L三甲酚、0.5g/L 氯仿、1.0g/L叠氮钠（均为终浓度）。
也可采用中性甘油保存，抗血清加入等容积中性甘油（每100ml甘油中加Na2HPO4•12H2O 2～3g，沸水浴中使溶），充分混匀后分装小份，置-20℃保存。
抗体效价2～3年内可保持不变。