NCBI基本功能与引物设计
引物设计和NCBI使用指导
NCBI收录了诸多物种的基因组DNA、编码序列mRNA以及其他相关核酸序列的数据。使用Primer-Blast进行比 对，首先要输入一对引物序列，并选择序列所属数据库。此时系统将在该数据库中对序列进行查找和对比，并将 引物可能结合的位置进行记录，一旦结合位置处于两条链并且产物大小符合要求，系统就会将这种情况列举到结 果中。需要注意的是，结合模板的引物不仅是一条正向一条反向，也有可能是两条正向或者两条反向引物。
Primer-BLAST-01
Primer-BLAST-02
Primer-BLAST-03
引物设计
Primer-BLAST-引物特异性及比对原理
引物的特异性 引物是一段短的单链寡核苷酸，在PCR过程的退火阶段，引物与单链模板结合，DNA聚合酶沿着引物的3末端
向后进行DNA的合成。引物与模板的结合遵循碱基互补配对的原则，因此，当退火温度不合适或引物设计不合理 时，引物会结合到模板的非目标区域，从而导致其他片段的ห้องสมุดไป่ตู้增。
ncbi设计引物的方法步骤
ncbi设计引物的方法步骤
设计引物的方法步骤可以参考以下步骤：
1. 确定目标序列：确定要设计引物的目标序列，例如基因、启动子或其他特定的DNA或RNA片段。
2. 取得目标序列：从NCBI等数据库或其他来源获取目标序列
的序列信息。
3. 序列分析：对目标序列进行生物信息学分析，包括序列比对、保守区域分析、开放阅读框分析等，以确定适合的引物区域。
4. 引物设计原则：根据引物设计的特定要求，确定引物设计的原则，如引物长度、GC含量、端序列等。
5. 引物设计工具：选择合适的引物设计工具，如Primer3、Primer-BLAST等，在线工具或软件可以帮助自动化设计引物。
6. 引物评估和校验：对设计出的引物进行评估和校验，包括引物间的相互比对、检查引物的互补性、检查引物的组合是否会产生二聚体等。
7. 合成和验证：将设计出的引物进行合成，并通过PCR实验
验证引物的特异性和效果。
上述步骤可以根据具体的需求和实验要求进行调整和修改，以获得最佳的引物设计结果。
【设计】NCBI引物设计方法
【关键字】设计Primer-Blast介绍Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。
Primer-BLAST 可以直接从Blast主页（/）找到，或是直接用下面的链接进入：/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。
Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。
并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物–an important feature for PCR protocols measuring tissue specific expression （注：没办法准确的翻译，只好作罢，汗！）。
Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。
Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。
提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）。
跟其它的BLAST一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。
模板（Template）在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。
如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。
Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。
引物（Primers）如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。
可以在Primer Parameters区填入你的一条或一对引物。
基于NCBI-primer blast的引物设计及验证
基于NCBI-primer blast的引物
设计及验证
流程
01 02引物的设计（已知模板设计引物）
引物的验证（已知引物查找模板/验证参数）
1-primer blast中引物的设计——模板
可以放序列：
如
也可以放NM号：
如NM_001289746.2
预期引物Tm 值：最适60，无特殊要求无需更改
预期产物大小：如80-150bp
数据库来源：根据模板设置，模板是
cDNA 就选mRNA
跨外显子设置：
RT-qPCR 定量引物为避免gDNA 干扰需设置跨外显子
物种种属设置：根据模板的种属设置
1-primer blast 中引物的设计——生成引物
生成引物：点击生成10对引物，可进行选择
最大扩增子设置：可不做更改，引物设计时前面已设置过产物大小
2-primer blast中已知引物的验证——只需放入引物序列
引物序列：
待验证引物序列放
于此处，注意引物
方向
2-primer blast中已知引物的验证——设置来源和种属
待验证引物来源数据库：
即是基于cDNA（mRNA反转）
的扩增引物，还是基于
gDNA的扩增引物；如定量
则肯定选mRNA
待验证引物来源种属：
即该引物扩增的模板的种属
注：如这两项未知，可先不做选择进行验证；如得不到完全匹配的结果，再进
行更改。
2-primer blast中已知引物的验证——进行验证
验证引物：
点击即可对上述输
入的引物进行验证，
可看到包括Tm值，
扩增子大小等引物
参数。
NCBI使用教程--qPCR引物设计
NCBI使⽤教程--qPCR引物设计NCBI设计qPCR引物主要⽤到Primer designing tool⼀/打开基因序列页⾯⼆/点击Pick Primers，跳转到到Primer designing tool的页⾯到Primer designing tool的页⾯。
*如果已经有了基因的序列，可以不通过基因查找页⾯，直接进⼊Primer designing tool。
具体的⼊⼝是NCBI——BLAST——Primer-Blast。
三/根据公式对将设计出的引物进⾏参数设计① PCR Template通过查找序列转到Primer designing tool的，那么在PCR Template栏中则会⾃动出现您的基因的编号，⽐如对于human β-actin来讲，其mRNA的页⾯点击Pick Primer之后，PCR Template 栏中会出现其对应编号：NM_001101.3。
如果是直接进⼊Primer designing tool界⾯，则需要将⽬的基因的编号或者序列粘贴进该框中。
在右侧的Range栏中，可以设定正反向引物的结合范围。
② Primer Parameters引物参数栏中，前两⾏是引物的序列栏，⽤于对已有的引物进⾏特异性分析，在设计引物的过程中并不会⽤到，因此留空即可。
在PCR product size⼀⾏中，可以设定PCR引物的扩增产物长度范围，对于qPCR来讲，范围设为50~250时结果⽐较精确，可以先设定⼀个较⼩的范围，如80~150，如果该范围内没有设计出⽐较好的引物，则可以返回扩⼤产物⼤⼩范围。
# of primers to return是指软件设计引物的数量(如果有的话)，默认为10对。
引物的Tm值⼀⾏中，可以设定引物的最⼤、最⼩和最佳Tm值，以及正反向引物Tm的最⼤差值。
对于qPCR来讲，默认的即为最佳Tm值60°C，不需做任何修改。
③ Exon/intron selection在抽提RNA的过程中，样本中的基因组DNA污染会显著影响最终的结果，虽然可以使⽤DNase I进⾏处理将RNA样本中的中DNA降解掉，但是很难保证DNA降解完全。
一步一步教你使用 NCBI 查找DNAmRNAcDNAProteinpromoter引物设计BLAST 序列比对等
一步一步教你使用NCBI 查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST 序列最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST 进行序列比对……，这些问题在 NCBI 上都可以方便的找到答案。
现在我就结合我自己使用 NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下 BCBI 的使用。
希望大家都能发表自己的使用心得，让我们共同进步！我分以下几个部分说一下 NCBI 的使用：Part one 如何查找基因序列、mRNA、PromoterPart two 如何查找连续的 mRNA、cDNA、蛋白序列Part three 运用 STS 查找已经公布的引物序列Part four 如何运用 BLAST 进行序列比对、检验引物特异性特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。
关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充First of all，还是让我们从查找基因序列开始。
第一部分利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子（Promoter）下面以人的 IL6（白细胞介素 6）为例讲述一下具体的操作步骤1．打开Map viewer 页面，网址为：/mapview/index.html在 search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。
操作完毕如图所示：2．点击“GO”出现如下页面：3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene 前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。
2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。
ncbi使用指导
NCBI使用指导1. 什么是NCBINCBI（National Center for Biotechnology Information）是美国国家生物技术信息中心，是一个提供生物信息学相关服务的综合性数据库和资源平台。
NCBI的目标是收集、存储和分析全球生命科学研究数据，并为科学家和研究人员提供免费的访问和使用。
2. 注册和登录要使用NCBI提供的服务，首先需要注册一个账号。
在NCBI的官方网站上找到注册页面，填写相应的信息并创建账号。
注册成功后，可以使用注册邮箱和密码登录。
3. 常用功能介绍3.1 数据库搜索NCBI提供了多个数据库，包括PubMed、GenBank、BLAST等。
在首页可以看到这些数据库的链接。
通过点击相应的链接，可以进入对应数据库进行搜索。
3.1.1 PubMedPubMed是一个包含生命科学和医学文献的数据库。
在PubMed上可以搜索相关文献，并获取摘要或全文。
使用方法： - 在搜索框中输入关键词，点击搜索按钮。
- 在搜索结果页面中可以按照时间、相关度等进行排序。
- 点击文章标题可以查看详细信息。
- 可以通过邮箱将文章发送给自己或他人。
3.1.2 GenBankGenBank是一个包含DNA序列和相关注释信息的数据库。
研究人员可以在GenBank中搜索并下载DNA序列。
使用方法： - 在搜索框中输入关键词，点击搜索按钮。
- 在搜索结果页面中可以按照时间、相关度等进行排序。
- 点击序列编号可以查看详细信息。
- 可以将序列下载到本地。
3.1.3 BLASTBLAST是一种用于比对DNA、RNA或蛋白质序列的工具，可以找到与输入序列相似的序列。
使用方法： - 在搜索框中输入待比对的序列。
- 选择相应的数据库和参数设置。
- 点击搜索按钮，等待比对结果。
3.2 数据上传与下载NCBI允许用户上传自己的数据，并提供了相应的工具和接口。
同时，用户也可以从NCBI下载他人共享的数据。
一步一步教你使用 NCBI 查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST 序列比对等
一步一步教你使用NCBI 查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST 序列比对等最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST 进行序列比对……，这些问题在NCBI 上都可以方便的找到答案。
现在我就结合我自己使用NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下BCBI 的使用。
希望大家都能发表自己的使用心得，让我们共同进步！我分以下几个部分说一下NCBI 的使用：Part one 如何查找基因序列、mRNA、PromoterPart two 如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列Part three 运用STS 查找已经公布的引物序列Part four 如何运用BLAST 进行序列比对、检验引物特异性特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。
关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充First of all，还是让我们从查找基因序列开始。
第一部分利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子（Promoter）下面以人的IL6（白细胞介素6）为例讲述一下具体的操作步骤1．打开Map viewer 页面，网址为：/mapview/index.html 在search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。
操作完毕如图所示：2．点击“GO”出现如下页面：3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene 前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。
2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。
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RT－PCR原理与技术简介
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2
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常规引物设计
• 引物设计原则
• Primer5和Oligo6进行引物分析
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引物设计原则
1. 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过 长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq 酶的最适温度。 2. 引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引
异亮氨 酸 丝氨酸
Isoleucine Serine
Ile Ser
I S
AUU AUC AUA AUG UCU UCC UCA UCG AGU AGC
色氨酸 苯丙氨酸 酪氨酸 蛋氨酸 胱氨酸
Tryptophan Phenylalanine Tyrosine Methionine Cysteine
Trp Phe Tyr Met Cys
循环数增加至50 cycles
电泳检测至关重要
不用二次扩增重复结果
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后续研究
应用半定量或定量PCR法研究营养物质等对该基因 表达水平的影响 使用RACE法进行基因cDNA全长扩增
进行蛋白质结构预测
1992年10月，NCBI承担起对GenBank DNA序列数据库的责任。 NCBI工作人员通过来自各个实验室递交的序列和同国际核酸序列数 据库（EMBL和DDBJ）交换数据建立起数据库.
Genebank是遗传序列数据库，一个所有可以公开获得的DNA序列 的注释过的收集。 GenBank以指数形式增长，核酸碱基数目大概每 14个月就翻一个倍。最近，GenBank拥有来自47,000个物种的30亿 个碱基。
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应用BLAST进行同源序列搜索
a. 剪切然后粘贴DNA或蛋白序列； b. 使用FASTA格式的序列； FASTA格式的序列以一个单行的说明开始，说明行 以其开始处的一个大于号（>）与序列数据区分开。 说明行以下是序列数据。 c. 简单使用访问编号：RefSeq或Genebank序号。
/
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中 文 甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸
英 文 Glycine Alanine Valine Leucine
缩写 Gly Ala Val Leu G A V L
密码子 GGU GGC GGA GGG GCU GCC GCA GCG GUU GUC GUA GUG CUU CUC CUA CUG UUA UUG
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Sub title
查找核酸/氨基酸序列
NCBI常用功能
序列相似性分析
引物验证
一、查找核酸、氨基酸序列
1.以鸡FAT/CD36为例，search：
2.调整右侧检索目录，tree--list：
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3.浏览信息，下载序列，并以Genebank、FASTA格式保存
Blast 引物验证
最为重要的环节：对自己设计的引物或文献报道的引物进行测试
1.登陆NCBI——Blast——Primer-BLAST: /
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以文献报道鸡的MUC2的引物为例：
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组氨酸
Histidine
His
H
CAU CAC
DNAMAN分析序列保守区
对Gallus、Taeniopygia、Mus、Ruttus的I-FABP的CDS进行分析得 到保守区序列
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CODEHOP
原理
方法：
http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html
2.进入NCBI 3.点击Basic BLAST中的nucleotide blast选项
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4.寻找相近物种，比较相似性
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点击score，获得相似性比较具体信息
NCBI官方说明：/BLAST/tutorial/Altschul-1.html
W F Y M C
UGG UUU UUC UAU UAC AUG UGU UGC
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苏氨酸 赖氨酸 精氨酸
Threonine Lysine Arginine
Thr Lys Arg
T K R
ACU ACC ACA ACG AAA AAG CGU CGC CGA CGG AGA AGG
Blast 序列相似性分析
1.修改测序结果，剔除克隆载体序列
在测序结果中找到上下游引物对应位置，剔除引物外的多余部分
以鸽子的I-FABP片段为例：
上游引物：5‘-AGRAARYTDGSAGCYCAC-3’ 下游引物： 5‘- TCHGTYCCRTCWGCBAGA-3‘
GCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCA AAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTCGCTGACGGAACGGAAATCTCTAGAGGATCC CCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCA TAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAG CTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCG GCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGT… …
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简并引物设计
简并引物：在常规引物的某些位点上 以简并核苷酸代替。
More of an art than a 降低简并度（500以下） 例如：上游 D Y N P V L F D L N G
Symbol Definition B not A D not C H not G I Inosine K G or T/U M A or C science N A,C,G or T/U R A or G S C or G V not T/U A or T L W Y C or T/U
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引物设计与简并PCR
RT－PCR原理与技术简介 引物设计过程
简并PCR技术
后续研究
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RT－PCR原理与技术简介
DNA
mRNA
Northern blot 半定量RTPCR 定量RTPCR
蛋白质
酶活力
Western blot
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主要的Blast程序：
程序名 Blastn Blastp Blastx Tblastn TBlastx 查询序列 核酸 蛋白质 核酸 蛋白质 核酸 数据库 核酸 蛋白质 蛋白质 核酸 核酸 搜索方法 核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列 蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的序列 核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白质数据 库中的序列逐一搜索。 蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序列6框翻译 后的蛋白质序列逐一比对。 核酸序列6框翻译成蛋白质序列，再和核酸数据 库中的核酸序列6框翻译成的蛋白质序列逐 一进行比对。
序列同源性分析：
是将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进 行多序列同时比较，以确定该序列与其它序列间的同源性大小。这 是理论分析方法中最关键的一步。完成这一工作必须使用多序列比 较算法。常用的程序包有DNAMAN、CLUSTAL等
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Blast简介
BLAST ： “局部相似性基本查询工具”(Basic Local Alignment Search Tool) 的 缩写，是由NCBI开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序。
下游
N G
K
Q
1. 根据密码子表建立引物系列
http://www.kazusa.or.jp/codon/
2. 谨慎使用次黄嘌呤
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简并引物设计过 程
传统方法（适用于保守度高序列） • 应用BLAST进行同源序列搜索
• 应用DNAMAN选择保守区域（氨基酸或核苷酸） • 简并引物设计原则 • Primer5和Oligo6进行引物分析 CODEHOP法（适用于保守度低序列）
发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也
可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR 影响不大。 3. 引物的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引
发反应。PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT
比。 4. ΔG值(自由能)反映引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值 最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且 不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值）。 引物二聚体及发夹结构的能量 一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带。