原核微生物基因重组
原核生物基因重组的特点
原核生物基因重组的特点原核生物基因重组的特点：（一）重组DNA的特点1、构建性：原核生物基因重组是一种以DNA作为原料、利用多种准确、可控的分子生物学技术，从而实现精确编织出大量高度接合的新型DNA片段的技术。
2、通用性：原核生物基因重组的技术可以改造植物和动物的基因，以获得期望的产物，这是一种多应用的技术。
3、可遗传性：原核生物基因重组的最大优点在于，所改造的基因可以遗传至其后代，在一定程度上实现了持久性。
（二）实现原核生物基因重组的手段1、重组PCR：通过PCR技术，让原始DNA片段复制و再结合，从而实现重组。
2、体外基因构建：利用各种DNA和RNA酶，以及载体DNA等，在实验环境中重组DNA。
3、定向连接：定向的将一种不受控的多个DNA片段连接起来，从而实现重组。
（三）原核生物基因重组的用途1、功能机器人：利用基因重组技术，可以构建出机器人，来在生物体内发生特定的功能活动，如基因疗法等。
2、基因表达：基因重组技术可以改变基因的表达强度，从而实现基因的表达。
3、抗逆性：基因重组技术也可以改造基因的结构，以增加对环境逆境的耐受性。
（四）原核生物基因重组的限制1、难以探测：由于改变的基因较少，因此难以通过细胞的形态学来识别这类基因的变异。
2、实验操作：成功重组基因需要精确操作，经常需要一系列复杂的实验，以及专业知识。
3、成本及时间：重组DNA技术需要大量的时间费用和实验室设备，一次重组DNA的价格也非常昂贵。
总之，原核生物基因重组是一种具有构建性、通用性和可遗传性的技术，可以用于改变原核生物的基因，制造出功能机器人、改变基因表达、增强对外界环境的抗逆性等，但也存在难以探测、复杂操作、以及高昂成本的问题。
第五章细菌基因重组及遗传分析
第一节 转化（Transformation）
转化：是指受体细胞在特定生理条件下吸收外源DNA分子或 片段，并能表达外源DNA性状的过程。转化现象的发现和转 化因子的证实对促进现代分子生物学的诞生和发展产生了巨 大的推动作用。 转化是导致细菌基因重组的主要途径之一，转化现象在自然 环境中普遍存在于许多细菌中，包括一些革兰氏阳性菌和阴 性菌，只是转化频率很低。
转化的两个例子： ①.用两个带有不同抗性的肺炎双球菌群体混合, 可以发现带有双抗性的细菌。 细菌裂解 DNA残留 其它细菌摄取转化
②.枯草杆菌活细胞表面分泌DNA，可被其它细 胞摄取。
通过化学和非常规培养等方法处理受体细胞，不仅可以提高 转化频率，也可使遗传转化发生在自然条件难以转化或不能 转化的微生物中。 在实验室条件下，通常用CaCl2 、cAMP、低温培养、PEG 介导及电脉冲等方法转化细菌或其它微生物。细菌转化的过 程大体可分为三个阶段： 感受态的出现 DNA的吸附和进入 DNA的整合
如果a和b是连锁的，当DNA浓度降低时，ab共转化频率 的下降和a或b的转化频率的下降相同。假如a和b不连锁， ab共转化频率的下降将远远超过a或b的转化频率。
因为在较低浓度范围内，转化频率和转化DNA的浓度成 正比关系，如果两个基因在同一DNA分子上，那么浓度降 低10倍时，两个基因同时转化的概率也将减少10倍。 如果两个基因不在同一DNA分子上，DNA浓度下降时， 两个基因同时转化的概率将减少100倍，而不是10倍。
例外---流感嗜血菌（G-）
转化小体
转化的双链DNA （30-50kb）结 合到膜受体上
双链DNA被转 化小体摄取
然而，不同的细菌摄取DNA 的方式也不尽相同。在流感 嗜血菌中，其感受态细胞形成 一种结合双链DNA的膜结构， 称为转化小体 （transformasome）。该 小体吸附DNA后，与细胞的 内外膜相融合而转入细胞内 侧。进入细胞质前，再将双 链变成单链DNA。
食品微生物 第5章 微生物遗传变异与菌种选育第二节
携带供体部分遗传物质（DNA片段）的噬菌体称为 转导噬菌体。
普遍性转导
细菌转导的二种类型：
特异性转导
1、普遍性转导（generalized transduction）
通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段 DNA进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称普遍 性转导。 (1) 意外的发现
保藏期 3-6 月
1-2 年 1-10 年 5-15 年
菌种保藏机构
ATCC采用的菌种保藏法：
（ American Type Culture Collection ，美国典型菌种保藏中心）
冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 CCCCM采用的菌种保藏法：
（ China Committee for Culture Collections of Microorganism， 中国微生物菌种保藏委员会）
转化（transformation）
转化：受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段, 并与其染色 体同源片段进行遗传物质交换，使受体细胞获得新的遗传性 状的现象。
转化因子
吸附吸收
受体细胞 高1000倍 感受态
整合
转化子
(2) 转化过程
供体(strR)
ds DNA
感受态受体(strS) 酶解与吸收单链
将遗传性状不同的两种菌（种内、间、属间）融合 为一个新细胞的技术。
五、基因工程技术用于工业菌种改良
基因工程技术：基因操作、基因克隆、DNA重组。将含 目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，转入一个受 体细胞并使之扩增、表达的过程。
•目的基因 •载体选择 •体外重组 •导入细胞 •筛选 •鉴定
分离、合成、逆转为cDNA、PCR扩增等 质粒、噬菌体、病毒
食品微生物学---第五章_微生物的遗传变异
1.经典转化实验（肺炎双球菌）
S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜 R型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜
（1）动物实验 对小鼠注射活R菌或死S菌 ————小鼠存活 对小鼠注射活S菌————————小鼠死亡 对小鼠注射活R菌和热死S菌 ———小鼠死亡
（二）微生物的诱变育种
1.出发菌株选择：对诱变剂敏感、变异幅度广、产量高 的菌株。
2.同步培养：使菌悬液中细胞达到同步生长状态 3.单细胞悬液制备：先收集菌体并洗涤，然后用生理盐
水或缓冲液配制，振荡使分散度90％以上。 4.诱变处理：物理诱变、化学诱变 5.中间培养 ：使细胞内原有酶量稀释，以得到纯的变
h
36
普遍性转导过程： 噬菌体侵染供体细胞 供体染色体断裂，
噬菌体蛋白质衣壳和DNA合成 衣壳包裹供体 DNA片段 侵染受体菌株
供体DNA片段整合到受体DNA上——完全转导
供体DNA片段不能整合到受体 DNA上，也不能复制，但能表达 ——流产转导
特异性转导过程： 噬菌体侵染供体细胞 供体细胞溶源化 噬菌体和供体菌染色体间发生交换 转导型 噬菌体（转导颗粒） 侵染受体菌
R菌＋S菌 只有R菌
只有S型细菌的DNA才能将R型转化为S型。且 DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转 移给R型菌株的，是遗传因子。
2.噬菌体感染实验
h
8
85
3.植物病毒的拆开与重建实验
将TMV拆成蛋白质外壳与RNA，分别对 烟草进行感染试验，结果只有RNA能感染 烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还 能分离出正常病毒粒子。
（2）细菌培养实验 热死S菌———不生长 活R 菌———长出R菌
基因重组
（一）转化（transformation）
具体转化过程如下： 进入受体细胞的DNA单链与受体菌染色体组上同源区 段配对，而受体菌染色体组的相应单链片段被切除， 并被进入受体细胞的单链DNA所取代，随后修复合成， 连接成部分杂合双链； 然后受体菌染色体进行复制，其中杂合区段被分离成2 个，一个类似供体菌，另一个类似受体菌； 当细胞分裂时，此染色体发生分离，形成一个转化子；
1、普遍性转导 普遍性转导又可分为完全普遍转导和流产普遍转导。 （1）完全普遍转导 通过重组，供体基因整合到受体细胞的染色体上，从而 使受体细胞获得供体菌的遗传性状，产生变异，形成稳 定的转导子，这种转导称为完全普遍转导。 （2）流产普遍转导 在普遍性转导中，有时转导来的供体DNA不一定都能整 合到受体染色体上，产生稳定转导子，更多的则是转导 来的供体染色体不能整合到受体染色体，也不能复制， 但可以表达，这种转导称为流产转导。
第三节 基因重组
凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移的一起，经过 遗传分子间的重新组合，形成新遗传个体的方式，称为 遗传重组。
一、原核微生物的基因重组
在原核微生物中，基因重组的方式主要有转化、转导、 接合和原生质体融合几种形式。
（一）转化（transformation）
受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换， 把它整合到自己的基因组中，再经复制就使自己变成一 个转化子。这种受体菌接受供体菌的DNA片段而获得部 分新的遗传性状的现象，就称转化。 能进行转化的受体细胞必须处于感受态，即受体细胞最 易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。
（四）原生质体融合
原生质体融合的主要步骤： （2 ）在高渗溶液中，用适当的脱壁酶去除细胞壁； （3）将形成的原生质体进行离心聚集，并加入促融合剂 PEG或过电脉冲等促进融合； （4）然后在高渗液中稀释，再涂在能使其再生细胞壁和 进行分裂的培养基上，使其形成菌落； （5）通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上， 鉴定它们是否为融合子，最后测定其他生物学性状或产 能性状；
基因重组育种
• 1998 年陈五岭等又报道了激光诱导动物细胞融合。此外， 其融合率还受其它诸因素的影响。
毒性小，仪器昂贵，操作难度高，很难推广。
原生质体融合技术的步骤
• 离心分离，洗涤菌体 • 酶解脱壁 • 原生质体再生及剩余菌数的测定 • 制备的原生质体去除酶液 • 促融 • 融合子再生 • 融合子筛选
参与融合的亲株数并不限于一个，可以多至三个、 四个，这是一般常规杂交所达不到的。
（3）重组频率特别高，因为有聚乙二醇作助融剂。
（4）可以和其他育种方法相结合，把由其它方法得到 的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。
（5）可以用温度、药物、紫外线等处理、钝化亲株的 一方或双方，然后使之融合，再在再生菌落中筛选重组 子。这样往往可以提高筛选效率。
• 应用灭活原生质体作为遗传标记选择融合子
原生质体经紫外线照射、加热或经某些化学药剂的 处理，可使其丧失在再生培养基上再生的能力，而只能 作为遗传物质的供体。从而只根据另一亲株特性设计选 择条件而选择融合子。周东坡等通过紫外线照射灭活原 生质体融合选育了啤酒酵母新菌株。用0.11 %碘乙酸， 30 ℃处理产阮假丝酵母( Candida utilis ) 原生质体40min 后，与啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae) 的原生质体融 合，利用形态差异选择融合子。
选定几种有特定整合 位点的 Hfr 菌株，使 之与F–菌株进行接合，
并在不同时间使其中 断，最后，根据F–中 出现Hfr菌株中各种形
状的时间顺序（分
钟），可以绘出较为
完整的环状染色体图 （chromosome map）。
中 断 杂 交 试 验
位点特异性重组
第八章-微生物的遗传变异与育种答案
第七章习题答案一、名词解释1.转座因子:具有转座作用得一段DNA序列、2.普遍转导:通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行“误包”,而将其遗传性状传递给受体菌得现象称为普遍转导。
3.准性生殖:就是一种类似于有性生殖,但比它更为原始得两性生殖方式,这就是一种在同种而不同菌株得体细胞间发生得融合,它可不借减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子、4.艾姆氏试验:就是一种利用细菌营养缺陷型得回复突变来检测环境或食品中就是否存在化学致癌剂得简便有效方法5.局限转导:通过部分缺陷得温与噬菌体把供体得少数特定基因携带到受体菌中,并与后者得基因整合,重合,形成转导子得现象、6.移码突变:诱变剂使DNA序列中得一个或几个核苷酸发生增添或缺失,从而使该处后面得全部遗传密码得阅读框架发生改变、7、感受态:受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化得一种生理状态、8、高频重组菌株:该细胞得F质粒已从游离态转变为整合态,当与F菌株相接合时,发生基因重组得频率非常高、9、基因工程:通过人工方法将目得基因与载体DNA分子连接起来,然后导入受体细胞,从而使受体细胞获得新得遗传性状得一种育种措施称基因工程。
10、限制性内切酶:就是一类能够识别双链DNA分子得特定序列,并能在识别位点内部或附近进行切割得内切酶。
11.基因治疗:就是指向靶细胞中引入具有正常功能得基因,以纠正或补偿基因得缺陷,从而达到治疗得目得。
12.克隆:作为名词,也称为克隆子,它就是指带有相同DNA序列得一个群体可以就是质粒,也可以就是基因组相同得细菌细胞群体。
作为动词,克隆就是指利用DNA体外重组技术,将一个特定得基因或DNA序列插入一个载体DNA分子上,进行扩增。
二、填空1.微生物修复因UV而受损DNA得作用有光复活作用与切除修复、2.基因组就是指一种生物得全套基因。
3.基因工程中取得目得基因得途径有 _____3_____条。
4.基因突变可分为点突变与染色体突变两种类型。
上海交通大学-环境微生物-微生物的基因重组
转导的遗传物质
供体菌染色体DNA 任何部位或质粒
完全转导或流产转导
噬菌体DNA及供体菌 DNA的特定部位
受体菌获得供体菌DNA 特定部位的遗传特性 转导频率较普遍转导增 加1000倍(10-4)
转导的后果
转导频率
受体菌的10-7
普遍性转导
转化过程
TRANSFORMATION direct uptake of biologically active DNA fragments
细菌转化
以反向遗传学 的角度来确定 未知基因的功 能。
基因变异使基 因功能的丧失， 应用于重组 DNA技术和细 胞内同源重组。
反向遗传学
反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。 经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究 生命的发生与发展规律。 反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础 上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、 基因插入/缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物 体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的 个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰 可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。
Genetic Recombination
一、原核微生物的基因重组
1. 转化 (Transformation)
2. 转导 (Transduction)
3. 接合 (Conjugation)
4. 原生质体融合 (Cytoplasmic fusion )
5. 溶源性转换 (Lysogenic conversion)
细菌的多重营养缺陷型杂交
实验
接合现象的发现和证实
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
知识点：原核微生物基因重组
情境：诱变育种
任务：微生物的基因重组
课程：食品微生物技术
原核微生物基因重组
微生物基因重组类型比较
转化：游离DNA分子+ 感受态细胞
转导：由缺陷型噬菌体介导
接合：细胞与细胞的直接接触(由F因子介导)原生质体融合：人工破壁后强制融合
1.转化
同源或异源的游离DNA 分子（质粒和染色体DNA ）被自然或人工感受态细胞摄取,并得到表达的基因转移过程。
自然遗传转化
人工转化
感受态细胞:具有摄取外源DNA
能力的细胞。
自然感受态与人工感受态的不同？
自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；
人工感受态则是通过人为诱导的方法,使细胞具有摄取DNA的能力或人为地将DNA导入细胞内。
(该过程与细菌自身的遗传控制无关！)
2.转导
由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式:一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。
能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体。
细菌转导的二种类型:普遍性转导：噬菌体可以转导
供体染色体的任何部分到受体细胞中局限性转导：温和噬菌体在整合态不正常
切割特定基因
3.接合
通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。
接合作用是由一种被称为F因子的质粒介
导。
F因子为附加体质粒，既可以脱离染色体
在细胞内独立存在，也可插入(整合)到染
色体上。
含有F因子的细胞:“雄性”菌株(F+),其细
胞表面有性菌毛;不含F因子的细胞:“雌
性”菌株(F-),细胞表面没有性菌毛。
F因子的四种细胞形式
a)F-菌株，不含F因子,没有性菌毛,可通过接
合作用接收F因子而变成雄性菌株(F+)。
b)F+菌株，F因子独立存在,细胞表面有性菌毛。
c)Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。
d)F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。
细胞表面同样有性菌毛。
4.原生质体融合
通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子的过程，称为原生质体融合。
原生质体融合的优点：
可以提高重组率
双亲可以少带标记或不带标记
可进行多亲本融合
有利于不同种间、属间微生物的杂交
通过原生质体融合提高产量。