有关物质测定HPLC方法的建立
HPLC-ELSD法测定新霉素的有关物质
HPLC-ELSD法测定新霉素的有关物质摘要】目的建立HPLC-ELSD法测定新霉素的有关物质的方法。
方法流动相：0.2mol?L-1三氟乙酸溶液-甲醇（98：2）；色谱柱：ODS－HYPERSIL（5μ）125mm×4.6mm，Kromasil-100-5C18：150mm×4.6mm；流速：0.4ml?min-1；雾化管温度：30 ℃；漂移管温度：70 ℃；压力：0.4MPa；进样量：20μL。
结论新霉胺在0.02～0.1mg?mL-1范围内线性良好，线性方程为：y= 1.513x+7.629，r=0.9996 (n = 6)。
HPLC-ELSD法法能够快速、准确测定新霉素的有关物质。
【关键词】新霉素 HPLC-ELSD 有关物质1 溶液的配制供试品溶液的制备精密称取硫酸新霉素样品50.17mg，加水溶解并稀释至50ml，作为供试品溶液。
对照溶液浓度的制备精密称取新霉胺对照品适量，加水溶解依次稀释至浓度为0.04 mg?mL-1，0.05 mg?mL-1，0.06 mg?mL-1，0.07 mg?mL-1，0.08 mg?mL-1的系列对照溶液。
系统适用性溶液的制备分别精密称取新霉胺、巴龙霉素、新霉素B和新霉素C对照品，加水制成约各含0.3mg?mL-1的溶液，摇匀，作为系统适用性试验用溶液。
2 系统适用性试验精密量取系统适用性溶液20μL，在上述色谱条件下分析，各杂质峰的分离度不小于1.5，理论塔板数均大于3000，对称因子均小于1.5。
见图1，2。
3 有关物质测定精密量取标准溶液与供试品溶液各20 μL注入液相色谱仪，按上述方法测定并绘制标准曲线，计算新霉胺的含量为0.1%。
见图3。
4 线性范围的考察精密称取新霉胺对照品适量，分别加水制成含新霉胺0.0201、0.0301、0.0401、0.0502、0.0702、0.1003 mg?mL-1的溶液，精密量取20 μL注入液相色谱仪，以上述测定方法绘制随行标准曲线，得线性方程为：y= 1.513x+7.629，r=0.9996 (n = 6) 。
HPLC法测定维生素B2片的含量及有关物质
该方法操作方便 、 准确 ， 灵敏度高 ， 专属性强 ， 可
关键 词 ： 维生素 Ｂ 片 ； 高效液相色谱法 ； 含量测定 ； 有关物质
Ｈ ＰＬＣ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｖ ｉ ｔ ａ ｍｉ ｎ Ｂ． ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｔ ｓ
安 徽 医 药 Ａ ｎ ｈ ｕ ｉ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｎ ｄ Ｐ ｈ ａ ｒ ｍ ａ ｃ ｅ ｕ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ２ ０ １ ３ Ｆ ｅ ｂ ； １ ７ （ ２ ）
Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ法测定维 生素 Ｂ ２片的含量及有关物质
谢 子立
ｔ ｗ ｅ ｅ ｎ ｐ ｅ ａ ｋ ａ ｒ ｅ ａ ａ ｎ ｄ ｖ ｉ ｔ ａ ｍ ｉ ｎ Ｂ ２ ｗ ａ ｓ ａ ｃ ｈ ｉ ｅ ｖ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｒ ａ ｎ ｇ ｅ ｏ ｆ ０ ． １ １ １ ７～０ ． ８ ９ ３ ８ ｘ Ｉ ｇ ， ｗ ｉ ｔ ｈ ｒ ｏ ｆ １ ． ０ ０ ０ ． Ｔ ｈ ｅ ａ ｖ ｅ ｒ ａ ｇ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｖ ｅ ｒ ｙ （ ｎ＝９ ）ｗ ａ ｓ
Ｃ ｌ ８ ｃ ｏ ｌ ｕ ｍ ｎ （ ２ ５ ０ ｍｍ×４ ． ６ ｍｍ， ５ ｍ）ｗ ａ ｓ ａ ｄ ｏ ｐ ｔ ｅ ｄ ｗ ｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｍｏ ｂ ｉ ｌ ｅ ｐ ｈ ａ ｓ ｅ ｏ ｆ ａ ｍｉ ｘ ｔ ｕ ｒ ｅ ｏ ｆ ｍ ｅ ｔ ｈ ａ ｎ ｏ ｌ — ａ ｃ ｅ ｔ ｏ ｎ ｉ ｔ ｒ ｉ ｌ ｅ 一 １ ０ ｍ ｍ ｏ ｌ・ Ｌ ｓ ｏ ｄ ｉ ｕ ｍ ｈ ｅ ｐ ｔ ａ ｎ ｅ ｓ ｕ ｌ ｆ ｏ ｎ ａ ｔ ｅ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ （ ０ ． ５ ％ｇ ｌ ａ ｃ ｉ ａ ｌ ａ ｃ ｅ ｔ ｉ ｃ ａ ｃ ｉ ｄ ） （ ５ ： １ ０ ： ８ ５ ） ． Ｔ ｈ ｅ ｌ ｆ ｏ ｗ ｒ ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｓ １ ． ０ ｍＬ・ ａ ｒ ｉ ｎ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｅ ｎ ｗ ａ ｖ ｅ ｌ ｅ ｎ ｇ ｔ ｈ ｗ ａ ｓ ４ ４ ４
如何建立HPLC法测定有关物质的方法
3。系统适用性试验进行一强破坏试验，以验 证分离度。如中国药典中的氧氟沙星所有品 种，均在HPLC法的色谱条件下拟定了：取 供试品溶液，置紫外灯下（254nm）照射4 小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与 主峰的分离度应符合规定。
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有关物质在质量标准中的制订
4。再如：国家药品标准WS1-(X-350)-
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专属性试验验证图谱
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2 . 检测波长的确定
涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同， 即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被测成分） @ 选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。 @ 选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长 （f>1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。 @ 如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应 必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将得到错误的判断。 @ 目前国外有关该项研究的进展
药品研究及生产过程中有关物 质的控制方法和要求
上海药检所化学室 谢沐风
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• 有关物质的来源
@ 原料药合成过程中带入; @ 制剂过程中产生; @ 或是在贮藏、运输、使用过程中产生。
• 控制的必要性
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有关物质的测定方法
仪器角度： @ 高效液相色谱法（HPLC法）、 @ 薄层色谱法（TLC法）、 @ 紫外分光光度法（UV法）、 @ 气相色谱法（GC法）、 @ 毛细管电泳色谱法（CE）等
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HPLC法测定琥珀酸美托洛尔的有关物质
㊃388 ㊃J o u r n a l o f H e n a n U n i v e r s i t y(M e d i c a l S c i e n c e )2020,39(6)文章编号:1672-7606(2020)06-0388-03H P L C 法测定琥珀酸美托洛尔的有关物质许笑笑1,孙 琳21.邓州市中心医院药械科,河南邓州474150;2.郑州大学第三附属医院,郑州450000摘 要: 目的 建立琥珀酸美托洛尔有关物质的H P L C 测定方法㊂ 方法 色谱柱为C 18(150mmˑ4.6mm ,5μm );流动相:醋酸铵3.9g ,用810m L 水溶解,加三乙胺2m L ㊁冰醋酸10m L ㊁磷酸3m L 和乙腈146m L ,混合均匀;流速:1.0m L ㊃m i n -1;柱温:25ħ;检测波长:280n m ;进样量:20μL ㊂结果 琥珀酸美托洛尔主峰与杂质A 分离度大于8,与其他杂质分离度符合规定;精密度试验结果R S D 为1.35%;最低检出浓度为0.2μg㊃m L -1(供试品溶液浓度的0.01%);供试品溶液在24h 内稳定㊂结论 该方法简便㊁准确㊁可靠,能满足琥珀酸美托洛尔有关物质的限度检测要求㊂关键词:琥珀酸美托洛尔;有关物质;H P L C中图分类号:R 927.2 文献标志码:A收稿日期:2020-06-11作者简介:许笑笑(1989-),女,硕士,主治医师㊂研究方向:天然活性成分研究及药物开发㊂D e t e r m i n a t i o n o f t h e r e l a t e d s u b s t a n c e s o f M e t o p r o l o l S u c c i n a t e b y HP L C X U X i a o x i a o 1 S U N L i n21 D e n g z h o u C e n t r a l H o s p i t a l D e n g z h o u 474150 C h i n a2 T h e T h i r d A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f Z h e n g z h o u U n i v e r s i t y Z h e n gz h o u 45000 C h i n a A b s t r a c t O b je c t i v e T o e s t a b l i s h H P L C m e t h o d t o d e t e r m i n e t h e r e l a t e d s u b s t a n c e s of M e t o p r o l o l S u c c i n a t e M e t h o d s C 18c o l u m n 150mmˑ4 6mm 5μma mm o n i u m a c e t a t eb u f f e r s o l u t i o n 3 9g ac e t i c a mm o n i ad i s s o l ve d i n 810m L w a t e r w i t h a n a d d i t i o n of 2 0m L t r i e t h y l a m i n e 10 0m L a c e t i c a c i d 3 0m L p h o s ph o r i c a c i d a d d e d 146m L a c e t o n i t r i l e a s m o b i l e p h a s e T h e f l o w r a t e w a s 1 0m L m i n -1T h e c o l u m n t e m p e r a t u r e w a s k e pt a t 25ħa n d t h e d e t e c t i o n w a v e l e n g t h w a s 280n m T h e s a m p l e s i z e w a s 20μL R e s u l t s T h e d e g r e e o f s e p a r a t i o n o f M e t o p r o l o l S u c c i n a t e a n d i m p u r i t y A p e a k s w a s g r e a t e r t h a n 8 t h e d e g r e e o f s e p a r a t i o n o f M e t o p r o l o l S u c c i n a t e a n d o t h e r i m p u r i t yp e a k s m e t t h e r e q u i r e m e n t s T h e p r e c i s i o n r e s u l t s R S D w a s 1 35% T h e d e t e c t i o n l i m i t w a s 0 2μgm L -1T h e s o l u t i o n w a s s t a b l e i n 24h C o n c l u s i o n T h e m e t h o d i s s i m pl e a c c u r a t e a n d r e l i a b l e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f r e l a t e d s u b s t a n c e s o f M e t o pr o l o l S u c c i n a t e K e y wo r d s m e t o p r o l o l s u c c i n a t e r e l a t e d s u b s t a n c e s H P L C 琥珀酸美托洛尔为选择性β1受体阻滞剂,用于治疗高血压㊁冠心病㊁慢性心力衰竭和心律失常[1]㊂琥珀酸美托洛尔及其制剂在美国药典(U S P 34)和英国药典(E P 2011)[2-3]均有收载,我国药典暂未收载㊂我们参照英国药典(E P 2011)琥珀酸美托洛尔有关物质H P L C项下的方法,建立琥珀酸美托洛尔有关物质的H P L C 检测方法,并参照中国药典‘药品标准分析方法验证指导原则“[4]对本方法进行了验证㊂1 仪器与试剂A gi l e n t 1260高效液相色谱仪,A L 204电子分析天平㊂琥珀酸美托洛尔原料(自制),琥珀酸美托洛尔2020,39(6)河南大学学报(医学版)㊃389㊃杂质A(008E15)㊂乙腈㊁三乙胺为色谱纯;水为超纯水;其他试剂均为分析纯㊂2方法与结果2.1色谱条件色谱柱:Z O R B O X-C18,150mmˑ4.6mm,5μm;流动相:醋酸铵3.9g,用810m L水溶解,加三乙胺2m L㊁冰醋酸10m L㊁磷酸3m L和乙腈146m L,混合均匀;流速:1.0m L㊃m i n-1;柱温:25ħ;检测波长:280n m;进样量:20μL㊂2.2溶液的制备2.2.1供试品溶液的制备取琥珀酸美托洛尔20m g,置10m L量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液,即得㊂2.2.2对照溶液a的制备取琥珀酸美托洛尔5m g㊁琥珀酸美托洛尔杂质A3m g,置100m L量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液,即得㊂2.2.3对照溶液b的制备精密量取供试品溶液1.0m L,置100m L量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀;精密量取1.0m L,置10m L量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液,即得㊂2.2.4对照溶液c的制备取琥珀酸美托洛尔10m g,置10m L量瓶中,用0.1m o l㊃L-1盐酸溶液溶解并稀释至刻度,摇匀;将该溶液放置254n m波长的紫外灯下照射6h;精密量取1.0m L,置50m L量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液,即得㊂如果供试品溶液中出现一个峰面积较对照溶液b峰面积大的且出峰时间为对照溶液b主峰0.3倍保留时间的峰,进样对照溶液c,该溶液仅用于鉴定杂质C的峰㊂2.2.5计算公式杂质C=供试品溶液中杂质C峰面积ˑ0.1对照溶液主峰面积ˑ1000ˑ100%,其他单杂=供试品溶液中单个杂质峰面积对照溶液主峰面积ˑ1000ˑ100%,总杂=供试品溶液中所有杂质含量的总和㊂2.3方法学考察2.3.1系统适用性按2.1项下色谱条件,量取对照溶液a20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图至琥珀酸美托洛尔主峰保留时间的3倍㊂杂质A与主峰分离度为8.85㊂2.3.2专属性1)空白试验㊂取流动相20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图至琥珀酸美托洛尔主峰保留时间的3倍㊂2)杂质C定位㊂量取对照溶液c20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图至琥珀酸美托洛尔主峰保留时间的3倍㊂3)降解试验㊂采用强酸(加6m o l㊃L-1盐酸0.5m L,60ħ水浴加热2h)㊁强碱(加6m o l㊃L-1氢氧化钠0.5m L,60ħ水浴加热2h)㊁强氧化(加体积分数为30%过氧化氢1.0m L,60ħ水浴加热1h)㊁高温(100ħ条件下加热1h)㊁强光(4500ʃ500)l x条件下照射24h方法对琥珀酸美托洛尔进行破坏,使其产生降解产物,同时制备空白降解溶液,按上述方法进行测定㊂本品在氧化降解杂质数量和杂质含量上增加明显,主峰与相邻杂质分离度分别为4.11和1.51㊂其他降解试验的降解产物较少,琥珀酸美托洛尔与相邻杂质的分离度均大于3㊂2.4最低检测限取对照溶液b20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图至琥珀酸美托洛尔主峰保留时间的3倍,量取琥珀酸美托洛尔峰高和基线噪音,计算琥珀酸美托洛尔的信噪比(S/N)为31.5㊂取琥珀酸美托洛尔对照溶液b用流动相稀释10倍,进样检测,记录色谱图,琥珀酸美托洛尔峰的信噪比为3.5,即最低检出浓度为0.2μg㊃m L-1(供试品溶液浓度的0.01%)㊂2.5精密度试验取琥珀酸美托洛尔对照溶液b20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图至琥珀酸美托洛尔主峰保留时间的3倍㊂连续进样6次,主峰峰面积的R S D为1.35%㊂2.6溶液稳定性取供试品溶液和对照品溶液b,室温条件下,分别于0㊁4㊁8㊁12㊁24h测定,杂质C㊁最大单杂和总杂含量的绝对偏差均不大于0.003%,说明琥珀酸美托洛尔供试品溶液在24h内稳定㊂2.7样品有关物质测定取琥珀酸美托洛尔样品3批,按前述方法检测,计算有关物质,结果见表1㊂㊃390㊃J o u r n a l o f H e n a n U n i v e r s i t y(M e d i c a l S c i e n c e)2020,39(6)表1样品含量测定结果批号最大单杂/%总杂/% 1205010.090.14 1205020.060.09 1205030.040.063讨论3.1方法的确定琥珀酸美托洛尔在美国药典(U S P34)中列出有琥珀酸美托洛尔杂质A㊁B㊁C㊁D四种杂质,英国药典(B P2011)中则列出有12种已知杂质;U S P采用分别用杂质对照品测定琥珀酸美托洛尔中杂质A㊁B㊁C㊁D的含量,对4种已知杂质测定结果准确,而其他杂质仍需用自身对照法测定㊂E P采用自身对照法结合杂质A和杂质C定位,加校正因子方法计算杂质C,不加校正因子计算杂质A和其他杂质,对杂质对照品要求相对较低㊂我们参照E P,经方法学验证,该方法简便㊁准确㊁可靠,能满足琥珀酸美托洛尔有关物质的限度检测要求㊂3.2耐用性将柱温分别设定为20㊁25㊁30ħ,其他按照前述色谱条件进行测定,琥珀酸美托洛尔和杂质A的分离度无显著差异,单杂和总杂的含量测定结果无显著变化㊂将流动相流速分别设定为0.9㊁1.0㊁1.1m L㊃m i n-1,其他按照前述色谱条件进行测定㊂琥珀酸美托洛尔和杂质A的分离度均大于8,单杂和总杂的含量测定结果无显著变化㊂配制流动相比例分别814ʒ156㊁824ʒ146㊁834ʒ136,其他按前述色谱条件进行测定,琥珀酸美托洛尔和杂质A的分离度分别为7.9㊁8.8㊁9.1,单杂和总杂的含量测定结果无显著变化㊂说明该方法耐用,色谱条件的轻微改变不影响该分析方法的测定结果㊂参考文献:[1]中华医学会心血管病学分会,中华心血管病杂志编辑委员会.β肾上腺素能受体阻滞剂在心血管疾病应用的专家共识[J].中华心血管病杂志,2009,37:195-209.[2]美国药典[S].2011:3508-3509.[3]英国药典[S].2011:1452-1454.[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典:四部[S].中国医药科技出版社,2015:105-109[责任编辑段金卯](上接第387页)参考文献:[1]唐哲,西娜.我院辅助用药合理管控的探索与实践[J].中国药房,2016,27(31):4396.[2]茹爱忠,刘静,蔡瑞君,等.建立辅助用药预警监控干预体系对合理用药及新医改控费的作用[J].中国药事, 2018,32(1):97-103.[3]韩爽,钟敏涛,李锦,等.我国辅助用药应用现状及管理对策初探[J].中国药学杂志,2016,51(8):678-682.[4]路丹,卢成华.我院2013-2015年辅助用药应用分析[J].中国药房,2017,28(8):1030-1033.[5]王笑妍,付秀娟,黄玉鑫,等.我院重点监控药品的药事管理模式探索[J].中国药房,2018,29(7):882-885.[6]王丽,蔡德芳,陈勇,等.辅助用药分类方法探索[J].中国药师杂志,2015,18(12):2156-2159.[7]马洁,王南,张四喜,等.以P D C A循环理论为基础的临床药师工作模式探讨[J].中国医院药学杂志,2018,38 (5):555-557.[8]徐婷,张妍,李莉,等.基于信息化手段探索建立医院辅助用药廉政风险防控预警体系[J].江苏卫生事业管理,2019,30(5):655-658.[9]徐敢,王冲.药占比在医院管理评价工作中的管制价值和社会效果分析[J].中国药房,2015,26(34):4762-4765.[责任编辑段金卯]。
HPLC法测定奋乃静及奋乃静片有关物质方法的建立
ｍｉ — １０ Ａ（ ０ ０ ｎ — ６ ％Ａ（ ０ ５ ｎ） ｎ）＋ ０ ％ ５ ～６ ｍｉ ） ７ ６ ～７ ｍｉ 。
取 奋乃静对 照 品 ２ ， ２ ５ｍｇ 置 ５ｍＬ容量瓶 中 ， 加 甲醇溶解后 ， 加入 ３ ％过 氧化氢溶液 ２ｍ 摇 匀 ， ０ Ｌ， 加 甲醇至 刻度 ， 摇匀 ， 置 １ ， 放 ． ｈ 作为系统适 用性试验 ５
Ａ — ａ ｌ； —ａ ｘｉａｙｍａｅｉｌ — ｅｐｈ ｎ ｚｎ ； — —ｍｐ ｒｔ ｓ —ｓｍｐｅ Ｂ — ｕ ｌ ｒ ｉ ｔｒａ；１—ｐ ｒ ｅ ａ ｉｅ ２— ９— ｉ ｕｉｉ ｅ
１ｍｏ・。 酸溶 液 １ｍＬ、 ｏ・ 氢 氧化钠 溶液 ｌ ｌ 盐 Ｌ １ｔ ｌ ｏ Ｌ
Ｕ Ｉ Ｕ ２ ０ ｊ Ｕ ４ ０ ５ ０ ６ ０ ７ ０ ８ ０
ｏ ｒ ｌｔｄ ｓ ｂ ｔ ｎ ｅ ｅ ｐ ｅ ａ ｉ ｅａ ｄ ｐ ｒ ｈ ｎ ｚｎ ｂ ｅ ｓ ｆ ｅａ ｅ ｕ ｓａ ｃ ｓｉ ｐ ｒ ｈ ｎ ｚｎ ｎ ｅ ｐ ｅ ａ ｉ ｅｔ ｌｔ ． ｎ ａ
Ｉ Ｙ Ｏｌ Ｓ Ｐ ｒｈｎ ｚ ｅ Ｒ ｌ ｅ ｂｔ ｃ； Ｐ Ｃ ＫＥ Ｗ １ ｅ ｅａｉ ； ｅ ｔ ｓ ｓ ｎ ｅ Ｈ Ｌ ｐ ｎ ａｄｕ ａ
Ａｇｌ ｔ１０ 型 高效 液相色谱仪 （ 国 Ａ ｉ ｎ公 ｉ ｎ ２ ０ ｅ 美 ｇｌ ｔ ｅ
２ 方 法与结 果
２１ 色谱条件 与系统 适用性试验 ．
采用 Ｋ ｏ ｓ ８４６ｍ × ５ ｌ， ｍ） ｒｍａｉＣ１ ． ｍ ２ ０ｉ Ｉ ５ ｌ （ ｎｌ 色谱 柱； 流动相 Ａ为甲醇 ， 流动相 Ｂ为 Ｏ０ ｌ 。 ．３ｍｏ・ 醋酸铵 Ｌ
图１ 系统适用性试验色谱 图 １ 一降解物 ； 一 ２ 奋乃静
Ｆｉ Ｃｈ ｏ ｔ ｇ ａ ｏ ｙ ｔ ｍ ｕ ｔ ｂｉ ｔ ｅ ｔ ｇ１ ｒ ｍａ ｏ ｒ ｍ ｆｓ ｓ ｅ ｓ ｉａ ｌ ｙ ｔ ｓ ｉ １一ｄ ｇ ａ ｅ ｍｐ ｒｔ ２一ｐ ｒ ｈ ｎ ｚ ｎ ｅ ｒ ｄ ｄ ｉ ｕ ｙ； ｉ ｅｐ ｅ ａ ｉｅ
有关物质检验方法概述
限量检测的适用范围： 1）对准确性要求不高，稳定性中不易发生明显 变化，例如API的工艺杂质。 2）虽然要求不高，但也应有一定的要求，比如 在方法制定上称取的样品量应规定为“取0.20g” 而不是“取0.2g”，这是因为隐含的规定，前者 的取样量应为0.195g～0.205g，而后者是 0.15g～0.25g；而由于限度检查一般限度较低， 所以标准往往也是只有一位有效数字，这时由 于方法的准确性较低，例如像滴定液的校正因 子（ChP0.95-1.05之间）也是可以不考虑的。
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3）ICH Q3A 和Q3B 两部分均有描述，定量限 不得高于报告阈值，即需要报告的杂质具 备定量的条件。ICH Q3A 和Q3B 两部分对于 杂质的描述，对于数据的最终报告（这部 分的将在后面进行阐述），均采用数据的 方式，应为定量计算而得出的。
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4）USP 等国外药典中要求未知杂质的限度为 不得过0.1%，ICH Q3A 和Q3B 也要求超过鉴 定阈值（一般为0.10%）的杂质必须鉴定， 检验时必须采取先修约后判定（0.10%和 0.1%的意义是完全不同的），这是限量法 所不需要而且也做不到的。 5）USP<621>（色谱法）和EP2.2.46（色谱分 离技术）对于有关物质的积分、计算和报 告，也说明了其检验方法应为定量的。
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鬼峰案例（摘自小木虫网友提问）： 液相条件：agilent 二元泵，梯度洗脱，其中缓冲液配制方法如下： 缓冲液＝（7.8g NaH2PO4+4ml 三乙胺+1.2g 十二烷基硫酸钠， 加水至1000ml，调pH3.0）/乙腈（90/10） 乙腈： 缓冲液 0min 28 72 5min 28 72 45min 58 42 50min 28 72 60min 28 72 该条件下，在约30.5min出现鬼峰，且一直出现（进空白溶剂、 样品等均出现），如图，波长260nm，流速：1.0ml/min，柱温 35摄氏度，色谱柱：C18 5 um 250×4.6mm。
HPLC方法建立和优化
4.样品分离的系统方法
充分用已知样品结构确定以哪种方法开始
普通反相? 离子抑制? 离子对? 还是其他
观察流动相条件改变时色谱峰的移动
根据变化的方向及大小决定下一步干什么
低pH流动相中寿命缩短 的主要原因是键合相在酸 性条件下水解，这会导致 保留时间和峰形的明显改 变
2.2 色谱柱常见问题 3、色谱柱的维护
三、色谱分离基础
3.1 溶剂的基础知识
粘度
溶剂粘度：
3.5 3
2.5 2
1.5 1
0.5 0
流动相粘度 水百分比
系M列eO1H 系M列eC2N
系Et列OH3 系AMc列eeOtHo4ne 系TH列F 5
a改变 a改变 a改变 a改变 a改变 a改变 a改变 a改变
结果
改变K、a、N 的途径
改变a的途径
改变流动相
改变K、a、N 的途径
改变N值的方法∶
减小填料的颗粒度 找到最佳的流速（根据不同内径） 合适的温度：粘度低、温度高 降低溶剂的粘度 增加柱长 减小柱外效应
k＝VR’/V0
vR
VR v0
VR’
t0
tR‘
tR
k :用来描述色谱柱中溶 质的迁移速度
2.1 色谱柱的性能指标
3、分离因子（ a ）:
a ＝k2/k1
vR
VR v0
VR’
t0
tR‘
tR
a :用来描述和表征两种
不同的溶质在色谱柱里 的分离过程
2.1 色谱柱的性能指标
4、峰的对称性（ AS）:
美国药典要求（5％）
32.4% 13.4% 4.4%
tR
W1/2h
有关物质测定HPLC方法的建立
有关物质测定hplc方法的建立一、开始之前必须明白：1、有关物质来源的两种途径：1）合成过程中的中间体和副产物；2）储存过程中产生的降解产物；2、分析你的样品结构，熟悉样品的基本性质；3、样品中可能含有的中间体；4、样品的基本稳定性和可能产生的降解产物；二、准备工作1、查阅文献，看看是否同行已经做过类似的工作，有的话就简单了，直接奔主题了。
2、没有文献（苦！），那就很是麻烦了。
1）分析结构，看看有无紫外吸收，有就比较简单，选用紫外检测器就行了，没有的话那就麻烦，可以选用蒸发光散射检测器等；2）分析结构，看看选用何种色谱方式进行分离（正相或者反相色谱）；3）分析结构，看看流动相该如何选择，要不要选用一些离子对试剂。
4）分析结构。
5）与同类产品进行比较；三、开工（以紫外检测为例）1、流动相的选择（采用粗品进行选择）1）、有文献，按文献进行优化。
不过我得提醒一下，文献的方法参考是可以的，要想完全按照他的条件做出来是很难的。
2）、没有文献。
a、紫外扫描一下，看看哪里有最大吸收。
将能得到的中间体、副产物、分解产物、样品配成相同浓度，在紫外扫描分光光度计上扫描一下，选择所有物质具有相同的最大吸收处的波长作为测定波长。
要是有pda检测器就不需要这一步了。
b、还是得找一些资料，看看类似的样品的流动相，以它为起始流动相进行选择，如果没有，那就找专业书吧，看看它是怎么教你选择流动相的。
2、最低检测限3、系统适应性试验重复进样5次，记录色谱图，给出系统评价报告4、考察中间体及副产物和样品的分离度。
同时定出中间体在色谱图中的出峰位置，为定质量标准提供依据。
5、考察降解产物和样品的分离情况。
这个一般是通过破坏性试验来考察。
常用的一般是高温、强光、氧化、强酸、强碱五个因素进行考察，通过考察，应该可以知道色谱图中那些峰是由于什么因素产生，这个也可为定质量标准提供依据。
6、根据上面的试验，应该可以知道样品的一些大概情况了，样品中有哪些杂质应该比较明确了。
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有关物质测定hplc方法的建立一、开始之前必须明白：1、有关物质来源的两种途径：1）合成过程中的中间体和副产物；2）储存过程中产生的降解产物；2、分析你的样品结构，熟悉样品的基本性质；3、样品中可能含有的中间体；4、样品的基本稳定性和可能产生的降解产物；二、准备工作1、查阅文献，看看是否同行已经做过类似的工作，有的话就简单了，直接奔主题了。
2、没有文献（苦！），那就很是麻烦了。
1）分析结构，看看有无紫外吸收，有就比较简单，选用紫外检测器就行了，没有的话那就麻烦，可以选用蒸发光散射检测器等；2）分析结构，看看选用何种色谱方式进行分离（正相或者反相色谱）；3）分析结构，看看流动相该如何选择，要不要选用一些离子对试剂。
4）分析结构。
5）与同类产品进行比较；三、开工（以紫外检测为例）1、流动相的选择（采用粗品进行选择）1）、有文献，按文献进行优化。
不过我得提醒一下，文献的方法参考是可以的，要想完全按照他的条件做出来是很难的。
2）、没有文献。
a、紫外扫描一下，看看哪里有最大吸收。
将能得到的中间体、副产物、分解产物、样品配成相同浓度，在紫外扫描分光光度计上扫描一下，选择所有物质具有相同的最大吸收处的波长作为测定波长。
要是有pda检测器就不需要这一步了。
b、还是得找一些资料，看看类似的样品的流动相，以它为起始流动相进行选择，如果没有，那就找专业书吧，看看它是怎么教你选择流动相的。
2、最低检测限3、系统适应性试验重复进样5次，记录色谱图，给出系统评价报告4、考察中间体及副产物和样品的分离度。
同时定出中间体在色谱图中的出峰位置，为定质量标准提供依据。
5、考察降解产物和样品的分离情况。
这个一般是通过破坏性试验来考察。
常用的一般是高温、强光、氧化、强酸、强碱五个因素进行考察，通过考察，应该可以知道色谱图中那些峰是由于什么因素产生，这个也可为定质量标准提供依据。
6、根据上面的试验，应该可以知道样品的一些大概情况了，样品中有哪些杂质应该比较明确了。
现在对三批样品进行测定，通过归一化来观察，应该可以知道杂质的大概情况，根据这个可以定出相应采用自身对照法测定的杂质限量。
一般情况下还应定出最大的单一杂质限量。
如果样品中的杂质可以很好得到纯品，那么你就可以采用外标法来准确定量。
7、杂质的限量必须根据你的样品本身性质来定。
关于HPLC主成分自身对照法检查有关物质时检测波长确定的讨论审评二部张玉琥有关物质检查，包括对产品中残留合成原料、中间体、副产物及可能的降解产物的检查，是控制药品质量的重要指标，目的是检查药品中所含的上述杂质是否符合安全性的要求,同时也是药品稳定性评价中需重点考察的项目。
有关物质检查常用的方法之一是HPLC主成分自身对照法（紫外检测器），即将HPLC 色谱图中杂质峰面积与主成分自身对照液峰面积进行比较，以确定杂质限度是否合格。
采用此方法时确定的检测波长是否合理直接影响到方法的可行性，因此检测波长的选择是方法学研究的重要内容。
在审评中发现一些申报单位在采用HPLC主成分自身对照法检查有关物质时直接或间接地以主成分的最大吸收波长作为检测波长，由于有关物质检查的对象是杂质，若将主药的最大吸收波长确定为检测波长，则杂质在此波长下的吸收可能偏低，某些杂质甚至无吸收，这样会造成对杂质含量的低估甚至漏检，从而不能反映产品的真实质量，影响了对品种质量可控性及稳定性的评价。
在有关物质检测波长确定方面，申报资料中比较常见的做法有：1．直接将主药的最大吸收波长选作检测波长。
2．简单地套用含量测定的色谱条件。
在HPLC法进行含量测定时，为提高方法的灵敏度，降低干扰，往往选用主成分的最大吸收波长作为检测波长。
若套用含量测定的色谱条件，实际仍是以主药的最大吸收波长作为有关物质检测波长。
3．以样品进行破坏性试验（酸、碱、热、光照、氧化等）后的溶液做紫外扫描，将扫描图谱中最大吸收波长确定为有关物质的检测波长。
因破坏性试验后溶液中存在尚未破坏的主药、降解产物、辅料等，此溶液的紫外吸收为各成分紫外吸收的加和，并不能反映降解产物的紫外吸收特性。
由于未破坏主药所占比例较大，故破坏性试验后溶液的最大吸收波长一般仍为主药的最大吸收波长。
采用HPLC主成分自身对照法检查有关物质，其前提之一是需检查的杂质与主成分在确定的检测波长下应有相近的紫外吸收（响应值接近），选择检测波长时需对产品中可能存在的杂质（合成原料、中间体、副产物以及降解产物）的紫外吸收特性进行研究。
已知杂质的紫外吸收特性可采用对其流动相溶液直接进行扫描的方法考察，未知杂质（如未知降解产物等）可通过二极管阵列检测器考察其紫外吸收情况，根据各主要杂质及主成分的紫外吸收特性，选取响应值基本一致的波长作为有关物质的检测波长。
若对不同杂质难于找到均适宜的检测波长，可考虑选择在不同波长下分别测定，也可考虑采用加校正因子的主成分自身对照法。
只有经试验研究确认主成分的最大吸收波长符合有关物质检查对测定波长的要求时，为方便操作，可选作有关物质的检测波长，以与含量测定的色谱条件一致。
另外，HPLC主成分自身对照法检查有关物质比较适用于对微量杂质总量的控制，也可用于单个杂质的限度（一般不超过0.5%）控制。
对于具有明确归属的已知杂质，建议采用杂质对照品法进行检查。
对于有毒有害杂质，更应采用杂质对照品法单独测定，并制定严格的限度。
关于原料药有关物质检查方法建立的思考作者: lcc666 发布日期: 2007-1-10 查看数: 73 出自:[table=96%][tr][td][/td][/tr][tr][td=1,1,60]正文[/td][td]审评四部七室赵慧玲【摘要】本文针对审评原料药有关物质检查方法中存在的问题，介绍欧洲和英国药典关于原料药已知杂质的研究现状和有关物质方法建立及质量控制，以供申请人参考。
【关键词】有关物质、方法学、分离度。
笔者审评原料药有关物质检查方法中发现，大多申请人越来越多地认识到控制原料药有关物质的重要性，自行建立方法考察原料药中存在的有关物质。
但在研究中往往片面认为样品通过了破坏性试验和1％自身对照法后的系统适用性试验就符合了要求。
因此，忽视对主成分中杂质产生原因的分析，忽视仪器的检测灵敏度的分析、忽略色谱柱（柱效）的选择、流动相及比例的选择、检测波长的选择。
忽视主成分和可能产生的杂质分离度的问题。
原料药有关物质方法建立应关注的问题：原料药中的杂质来源于合成的中间体、副产物、以及降解产物，建立方法初期，仅采用破坏性试验的方法考察降解产物的做法是片面的。
由于降解产物的量较小，如果选择的方法不好，比如，柱效低，波长选择不合理、流动相及流动相比例不合适，即使有降解产物，也达不到有效的灵敏度和有效的分离。
因此，一个好的分析方法的建立首要问题应是围绕主成分和杂质的分离度和检测波长进行。
对于生产原料药的企业来讲，由于可以通过工艺得到中间体、副产物，在方法建立初始，首先应该将可能的中间体和副产物作为杂质对待，进行柱效、流动相及流动相比例、波长和分离度等方法学的研究。
方法建立成熟后，可根据中间体和副产物的安全性和工艺得到的难易程度决定是否固定为已知杂质。
如果工艺中难以得到，且比较安全，可考虑采用杂质校正因子加上相对保留时间的方法。
或采用杂质相对保留时间加上自身对照方法。
上述三种方法均有好的分离度和响应值（灵敏度）作保证。
也是研发和审评中应当提倡的。
如果原料合成中确实得不到副产物，对于有紫外吸收的样品可以用二极管阵列检测器，考察未精制的粗品，并对比已精制过的样品，确定粗品中各成分的分离度和样品中可能杂质的检测波长。
方法确立后，可采用自身对照方法或面积归一化法控制杂质。
对于后一方法，在研发和审评中应当慎重选用。
如果证明上述四个方法是比较成熟的方法后，如果再加上破坏性试验考察降解产物，其方法就更加完整和适用。
介绍欧洲和英国药典控制有关物质关注的问题欧洲和英国药典的原料药标准后面，大部分都附有可能产生的中间体和副产物的结构，在有关物质质量控制中有些采用已知杂质的方法；有些采用杂质校正因子加上相对保留时间的方法；杂质相对保留时间加上自身对照方法和自身对照方法或面积归一化法。
例如：核黄素磷酸钠的有关物质检查就是采用HPLC的已知杂质－核黄素、其他杂质相对保留时间加上自身对照的方法。
取本品0.1g，用水50ml溶解，并用流动相稀释至100ml，取该溶液8ml，用流动相稀释至50ml，作为供试品溶液。
另取核黄素对照品60mg，加盐酸试液1ml溶解，用水稀释至250ml, 取该溶液4ml，用流动相稀释至100ml，作为对照品溶液(a)。
再另取核黄素磷酸钠对照品0.1g，用水50ml溶解，并用流动相稀释至100ml，取该溶液8ml，用流动相稀释至50ml，作为对照品溶液(b)。
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（填充剂粒度：5μm；柱长：0.25m；内径：4.6mm）；以甲醇－7.35g/L磷酸二氢钾溶液（150：850）为流动相；检测波长266nm；流速2ml/分。
5－单磷酸核黄素的保留时间为20分钟；其他相对保留时间：3，4－二磷酸核黄素大约0.2；3，5－二磷酸核黄素大约0.3；4，5－二磷酸核黄素大约0.5；3－单磷酸核黄素大约0.7；4－单磷酸核黄素大约0.9；核黄素大约2。
取对照溶液（a）100μl注入液相色谱仪，调节主峰高度为满量程的50％；再注入对照溶液（b）100μl，记录色谱峰直到核黄素的峰面积能被准确计算，且4－单磷酸核黄素峰与5－单磷酸核黄素峰的分离度应不小于1.5。
精密量取供试品溶液、对照溶液（a）和对照溶液（b）各100μl，分别注入液相色谱仪，供试品溶液的色谱图中，如有与核黄素峰保留时间相应的色谱峰，其峰面积不得大于对照溶液（a）主峰面积（6.0％），二磷酸核黄素面积的和不得大于对照溶液（a）主峰面积（6.0％），且均应以干燥品计。
结合国内研发核黄素磷酸钠的状况提几点建议在审评核黄素磷酸钠原料和注射剂有关物质的过程中发现，申请人常参照中国药典收载的核黄素磷酸钠及注射液标准项目进行。
忽视了国内外标准和国内同品种质量的调研，盲目申报。
一些资料中单磷酸核黄素的分离度并不好，从图谱看起来，表面上其质量比国外标准的质量好，但实际上是单磷酸核黄素等多个组分并未得到有效分离。
虽然国外将各单磷酸盐均看成有效成分，而未作为杂质控制，但在方法学研究中，的确关注了各单磷酸盐的分离度，这应是方法学研究的重点。
如果建立的方法不能使每一个成分分离，这个方法就不是一个好的方法。
从这个例子分析，审评中不能简单认为杂质个数少了，质量就好，杂质个数多了，质量就差，一定要结合分析方法的好坏，经过综合分析判断后下结论。
否则，容易犯主观主义和片面主义的错误，将由于因分析方法的分离度较差而导致的杂质个数少的药品误认为质量好。