微生物限度检验标准操作规程

1 目的

规范微生物限度检验操作，确保检验结果准确、可靠。

2 依据

《中国药典》2010版。

3 范围

本标准适用于微生物限度检验。

4 责任

中心化验室负责人：对本规程的实施负责。

中心化验室检验人员：严格按照本规程执行检验操作。

5 程序

5.1 执行标准：《中国药典》2010版。

5.2 抽样：照《取样标准操作规程》进行。

6 细菌、霉菌及酵母菌计数

计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。

6.1 设备、仪器及用具

6.1.1 设备

微生物限度检测室室、净化工作台、生化培养箱（30-350C）、生化培养箱（23-280C）、电热恒温水浴锅、烘箱、电冰箱、灭菌柜、紫外灯等。

6.1.2 仪器及器皿

显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、薄膜过滤器等。

6.1.3 用具

大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。

6.2 试液

6.2.1 消毒液

A．0.1% 新洁尔灭溶液：供手消毒、擦拭操作台面用。

B．75%乙醇溶液

6.2.2 稀释液、试剂及配制

A．PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.3g、蛋白胨1.0g，加纯化水1000ml，微温溶解，滤清，分装，1210C灭菌15分钟。

B．聚山梨酯80

C．吐温80

D．单硬脂酸甘油酯

6.3 培养基

营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基

6.4 操作方法

6.4.1 试验前准备

6.4.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等移至传递窗内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。

6.4.1.2 开启微生物检测室紫外灯和空调净化系统，并使其工作不低于30min。

6.4.1.3 操作人员进入一更，用洗手液或肥皂洗手，烘干。进入二更，用0.1% 新洁尔灭溶液洗手，穿戴洁净无菌服、口罩、手套。

6.4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。

6.4.2 供试液的制备

供试液的制备若需用水浴加温时，温度不宜超过450C，时间不得超过30分钟。除另有规定外，常用的供试液制备方法如下：

6.4.2.1 液体供试品

取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1:10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

6.4.2.2 固体、半固体或粘稠性供试品

取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用适宜的方法，混匀，作为1:10的供试液。必要时加入适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品

分散均匀。

6.4.2.3 乳膏剂

取供试品5g（或5ml），加至含溶化的（温度不超过45℃）的吐温80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20供试液。

6.4.2.4 栓剂

取供试品10g，加适量稀释液，置45℃水浴保温10分钟，使溶，加入无菌聚山梨酯80 5-8ml，振摇使之乳化，再加稀释液（稀释液和聚山梨酯80的总量为100ml），摇匀，作为1:10的供试液。

6.4.2.5 肠溶制剂

取供试品10g，加PH6.8无菌磷酸盐缓冲液至100ml，45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1:10的供试液。

6.4.3 供试液的稀释

取1支1ml灭菌吸管吸取1:10均匀供试液1ml，加入装有9mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中混匀，即为1:100供试液。（此时操作一般为：左手执试管并将塞打开、倾斜，右手执10ml吸管吸量，注意：勿在乙醇灯焰峰正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭）以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1:1000、1:10000等适宜稀释级。每递增1稀释剂，必须另换一支吸管。

稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，吸管移至第2级稀释管的内壁近液面处（勿接触液面）缓慢地放出全部供试液（吸管内应无黏附或残留液体）。

6.4.4 检查法

6.4.4.1 平皿法

6.4.4.1.1在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取每级稀释级供试液各

1ml置每个灭菌平皿中，每一稀释级每种培养基至少注2～3个平皿（一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流至吸管尖端部。

6.4.4.1.2 阴性对照用1支1ml吸管吸取试验用稀释液（PH

7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）各1ml，分别注入4个平皿中。其中两个作细菌数阴性对照：另两个作霉菌、酵母菌数阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

6.4.4.1.3 倾注培养基

将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、酵母菌计数用玫瑰红钠琼脂培养基）熔化，置45。C水浴中，备用。将45。C左右的琼脂倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速转动平皿（勿使培养基溢出）使供试液与培养基混匀，放置，待凝。

6.4.4.1.4 培养

细菌计数平板倒置于30-35℃培养箱中培养3天。霉菌、酵母菌计数平板倒置于23-28℃培养箱中培养5天，必要时可延长至7天。逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，6.4.4.1.5 菌落计数

将平板置观察台上用标记笔点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察，计数。必要时借助于放大镜和显微镜观察。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。

一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红纳琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红纳琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红纳琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红纳琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。

6.4.4.1.6 菌数报告规则

细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu 的平板计数，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10 c㎡供试品中所含的菌数。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

6.4.4.2 薄膜过滤法

6.4.4.2.1 采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45µm，直径约为50mm。选择滤膜材质