孔雀石绿的分析
有毒有害物质资料-孔雀石绿等
孔雀石绿
（Malachite green，又名aniline green、 basic green 4、diamond green B或victoria green B，IUPAC名称4-[(4dimethylaminophenyl)-phenyl-methyl]-N,Ndimethyl-aniline）是一种有毒的三苯甲烷类 人工合成有机化合物，既是染料，也是杀菌 剂，可致癌。其制成可由1分子（mol）的苯 甲醛和2分子的二甲苯胺在浓盐酸混和下，加 热缩合成隐色素碱，在酸性下加过氧化铅使 其氧化，并在溶液中沉淀出色素碱。
染剂
孔雀石绿可用作生物染色剂，把细胞或细胞组织染成 蓝绿色，方便在显微镜下研究。孔雀石绿也用作丝绸、 皮革和纸张的染料。要制造孔雀石绿染料，首先将其 溶于热草酸溶液，冷却后得草酸盐的结晶，或用盐酸 中和后，加定量的氯化锌结晶出氯化锌复盐，成为绿 色碱性染料。
虽然称作孔雀石绿，但其实它不含有孔雀石的成份， 只是两者颜色相似而已。孔雀石是一种天然的矿石， 为水合碱式碳酸铜[Cu(OH)2CO3或2CuOCO2H2O]， 呈翠绿或草绿色的块石，含71.9%CuO、19.9% CO2、 比重3.9-4.03、能溶于酸类，主要用于铜的提炼和供 作颜料，但并不用于水产养殖业。
绿色系
黄绿Yellow green 苹果绿Apple green 嫩绿Fresh leaves 叶绿Foliage green 草绿Grass green 苔藓绿Moss green 橄榄；茶青Olive 常春藤绿Ivy green 钴绿Cobalt green 碧绿Emerald green 绿松石绿Turquoise green 青瓷绿Celadon green 孔雀石绿Malachite 薄荷绿Mint 铬绿Viridian 孔雀绿Peacock green
孔雀石绿的紫外吸收光谱
孔雀石绿的紫外吸收光谱（UV-Vis Spectrum of Malachite Green）
孔雀石绿是一种亲环境激素类化合物，在水环境中会被吸附在有机物或胶体表面从而影响水环境质量。
为了更好地检测孔雀石绿的存在，我们可以通过紫外吸收光谱分析的方法进行鉴定。
在紫外吸收光谱中，孔雀石绿的最大吸收波长为618 nm，吸光度范围为0.1至0.8左右，一般以0.2 mol/L 的盐酸为溶液进行测试，测试结果具有稳定性和灵敏性。
此外，对于孔雀石绿的检测还可以采用高效液相色谱（HPLC）等方法，但紫外吸收光谱分析仍是一种应用较为广泛的方法。
总的来说，孔雀石绿的紫外吸收光谱分析是一种简单、稳定、灵敏的检测方法，可以有效检测水环境中孔雀石绿的存在，为水环境治值得注意的是，孔雀石绿的紫外吸收光谱常常会受到水中其他成分的影响而出现干扰信号，因此在测试过程中需要进行适当的前处理和样品预处理，以提高测试结果的准确性和可靠性。
同时，在实际应用中，我们还可以根据孔雀石绿的吸收特征，结合其他技术手段进行检测和监测。
例如，可以使用基于表面增强拉曼光谱（SERS）的方法，利用金属纳米颗粒等纳米材料的特异性增强效应，提高孔雀石绿的检测灵敏度和准确性。
此外，还可以结合气相色谱（GC）或液相色谱（LC）等技术，实现对孔雀石绿的快速检测与定量分析。
总的来说，孔雀石绿的紫外吸收光谱是一种较为简便和常用的检测方法，该方法依靠孔雀石绿的吸收特性对其进行鉴定和定量分析，具有灵敏、快速、可靠等特点，在水环境监测和保护方面具有重要的应用价值。
理和保护提供重要参考依据。
分析孔雀石绿
LCMS 分析孔雀石绿、隐性孔雀石绿有机色素孔雀石绿用作观赏魚的白点病或烂尾病的治疗药物（抗菌剂），但在日本国内不允许用于养殖鱼。
2004年12月16日，日本厚生劳动省颁发了食安监发第1216002号「关于养殖鱼的孔雀石绿分析法」的通知，定量试验采用HPLC 法，确认试验中采用LCMS 法。
另一方面，孔雀石绿在体内代谢为隐性孔雀石绿，因此，需要对这2种成分进行同时分析。
本文介绍了孔雀石绿以及隐性孔雀石绿的LC-MS 同时定量法。
孔雀石绿具有铵离子基团，隐性孔雀石绿具有二甲胺基，因此离子化采用正离子ESI 法。
在这些化合物的分析中，流动相的pH 值很重要，对于离子化效率、谱图模式以及保留时间都有影响。
本文中采用流动相为5 mM 甲酸铵（pH3.0）/乙腈＝20/80。
并且，隐性孔雀石绿会因紫外线照射而使离子化效率下降，对检测和定量造成不良影响，因此，在分析时不通过UV 检测器。
本分析条件高灵敏度地检测出0.8 ppb 的孔雀石绿以及隐性孔雀石绿，两个成分在0.8-40 ppb 范围内线性良好。
图1 孔雀石绿以及隐性孔雀石绿的SIM 色谱图孔雀石绿孔雀石绿隐性孔雀石绿隐性孔雀石绿图2 孔雀石绿以及隐性孔雀石绿的正离子ESI 质谱图图3 孔雀石绿以及隐性孔雀石绿的工作曲线表 1 分析条件色谱柱：Phenomenex Synergi 4u Fusion-PR80A (2.0mmI.D.×150mmL.)流动相：5mM 甲酸铵缓冲液（Ph 3.0）/乙腈=20/80流速 ：0.2mL/min 进样体积：2μL 柱温：40℃电压：+4.5kV(ESI-Negative mode) CDL 温度：250℃ 雾化气流速：1.5L/min 干燥气压力：0.1MPa CDL 温度：250℃ 加热块温度：200℃ CDL ，Qarray 电压：默认值 扫描范围：m/z 100-500 SIM ：m/z329(孔雀石绿)m/z331(隐形孔雀石绿)注：数据出自日本CSC面积面积浓度浓度。
孔雀石绿及其危害
孔雀石绿及其危害孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，属三苯甲烷类染料。
又名碱性绿、严基块绿、孔雀绿，它既是杀真菌剂，又是染料，易溶于水，溶液呈蓝绿色。
孔雀石绿既是工业性染料，又是一种杀真菌剂，自上世纪30年代以来，许多国家曾经采用孔雀石绿杀灭鱼类体内外寄生虫和鱼卵中的霉菌，对鱼类水霉病、原虫病等的控制非常有效，而且操作方便，价格低廉。
只需少量，约每公升水0.03mg的孔雀石绿即有效果。
加上价格便宜，因此广泛使用在水产养殖上。
孔雀石绿对治疗鱼身碰撞刮伤相当有效，可以防止细菌感染，避免伤口溃烂、扩散;部分养殖户不知孔雀石绿是禁药，加上饲料业者或水产品药商低价促销，且使用效果不错，常在幼鱼2～3周龄、或捞捕池中成鱼及后续运输过程，在水中添加孔雀石绿治疗鱼身外伤。
因此，长期以来孔雀石绿在水产养殖业中的使用极为普遍。
另外，在纺织工业中，孔雀石绿还被广泛用作丝绸、羊毛、皮革和纸张的染料等。
从上世纪90年代开始，国内外研究学者陆续发现，孔雀石绿具有较多副作用，目前已被禁止使用。
1孔雀石绿的危害孔雀石绿具有高毒素的副作用。
它能溶解很多的锌，引起水生动物急性锌中毒;能引起鱼类的鳃和皮肤上皮细胞轻度炎症，使肾管腔有轻度扩张，肾小管壁细胞的细胞核也扩大：还影响鱼类肠道中的酶，使酶的分泌量减少，从而影响鱼的摄食及生长。
美国国家毒理学研究中心研究发现，给予小鼠无色孔雀石绿104周，其肝脏肿瘤明显增加。
试验还发现，孔雀石绿能引起动物肝、肾、心脏、脾、肺、眼睛、皮肤等脏器和组织中毒。
孔雀石绿具有高残留的副作用。
据专家介绍：孔雀石绿一经使用，养殖动物终身残留。
虽然在后期的养殖过程中添加维生素类和微量元素可以减少一些，但至今仍无法完全消除。
广东省大部分使用土池养鳗的养殖场，如果在不知情的条件下拿到经孔雀石绿处理过的鳗苗，在养殖过程中进排水量又不足够的话，整个违禁药物代谢过程相对较慢。
同时，对于以前使用过孔雀石绿这类违禁药物的池塘，在塘内会有残留，鳗鱼属于无鳞鱼类，可以通过皮肤吸收而最终导致商品鳗鱼孔雀石绿残留。
孔雀石绿
代谢规律杨贤庆【5】在罗非鱼肌肉中孔雀石绿残留规律的研究发现，大规格的罗非鱼体内MG和LMG代谢的速度较快，但在60d内依然有较多的残留，对比之下，小规格的罗非鱼大写较慢，肌肉中残留较多。盐度对药动力学的影响在不同的水产动物中其结果不一。通过对比不同盐度养殖的罗非鱼，同一时间咸淡水养殖罗非鱼肌肉中MG残留量要高于淡水养殖，而LMG的量恰恰相反，但总体相差不多。咸淡水养殖的罗非鱼MG代谢的时间比LMG的所需时间比淡水养殖的较长。
孔雀石绿
前言
孔雀石绿的基本性质
毒理作用
代谢途径
限量检测Biblioteka 式近年来，由于水产养殖的规模的扩大，养殖渔药泛滥的现象较严重。孔雀石绿(malachite green, MG)是一种带有金属光泽绿色的结晶体，化学名为四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式为C23H25ClN2。孔雀石绿一种合成的工业染料，自1936年以来，许多国家就将其广泛用作水产养殖业中，作为杀虫剂和杀菌剂，用来杀灭体外寄生虫和鱼卵中的霉菌。以前在我国被用于欧洲鳗anguilla、甲鱼Trioyx sinesis、河蟹Eriocheir sinensis、罗非鱼Orechromis spp、鳜鱼Siniperca chuatsi鲢鱼Hypophthalmichehys molitrix等水霉病、小瓜虫病、聚索虫Zoothanminium病的防治、从1990年开始，国内外学者陆续研究发现，孔雀石绿及代谢产物无色孔雀石绿(leucomalachite green, LMG)在鱼体内和环境中残留时间长，其化学官能团-三苯甲烷（triphenylmethane）被确证具有高毒、高残留、“三致”等毒副作用。鉴于此，美国、加拿大、日本、欧盟等许多国家都将其列为水产养殖禁用药物。我国从2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及化合物清单》中。但是，由于孔雀石绿的抗菌效果非常好，并且价格低廉、对其毒副作用的宣传力度不够等原因，在水产养殖中仍有违规的情况。2005年6月5日在英国超市出售的鲑鱼体内检出孔雀石绿后，许多国家和地区也相继在水生动物中发现其残留，并迅速做出反应。孔雀石绿继“苏丹红1号”之后成为食品安全中又一热点问题。
孔雀石绿检测标准
孔雀石绿检测标准介绍孔雀石绿是一种有机物，常用于染色、防腐、除草等领域。
然而，孔雀石绿的过量使用可能对人体健康产生负面影响。
为保护公众的健康，许多国家都制定了孔雀石绿的检测标准。
本文将深入探讨孔雀石绿的检测标准，包括其原理、方法和应用。
原理孔雀石绿的检测是基于其化学性质的特点进行的。
常见的检测方法有高效液相色谱法、气相色谱法等。
这些方法利用孔雀石绿分子的结构特征，通过色谱技术对孔雀石绿进行分离和测定。
高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分离和定量分析方法，它利用样品中不同成分在色谱柱中的差异分离出目标物质。
在孔雀石绿的检测中，也可以使用HPLC方法。
检测步骤1.样品制备：将待测样品进行处理，例如提取、稀释等。
2.色谱柱选择：选择适合的色谱柱，根据需要可使用反相柱、离子交换柱等。
3.流动相选择：根据孔雀石绿的特性选择合适的流动相，如甲醇、乙腈等。
4.柱温控制：控制色谱柱的温度，以优化分离效果。
5.检测器选择：选择合适的检测器，如紫外/可见光检测器、荧光检测器等。
6.方法验证：确定分析方法的准确性和重复性。
7.样品分析：将样品按照一定流速通过色谱柱，采集检测结果。
气相色谱法气相色谱法（GC）是另一种常用的孔雀石绿检测方法。
它利用样品中不同成分在固定相和流动相之间的差异分离出目标物质。
检测步骤1.样品制备：将待测样品进行提取和净化处理，通常使用溶剂提取法或固相萃取法。
2.气相色谱仪选择：选择适当的气相色谱仪，包括色谱柱、进样器和检测器等。
3.良好的进样技术：确保样品能够均匀地进入色谱柱。
4.标准曲线的建立：使用标准样品建立孔雀石绿的浓度与响应信号的关系曲线。
5.批内和批间精密度实验：评估方法的精密度和准确性。
6.样品分析：按照一定流速将样品进入气相色谱仪，记录检测结果。
应用孔雀石绿的检测标准广泛用于食品、环境和农产品等领域。
食品安全是社会关注的热点之一，特别是对于水产品、禽畜肉和加工食品等易污染食品，孔雀石绿的检测显得尤为重要。
孔雀石绿检测标准
孔雀石绿检测标准
孔雀石绿是一种常见的化学物质,通常用于染料、药剂、农药等
领域。
孔雀石绿的检测标准主要包括以下几个方面:
1. 外观标准:孔雀石绿具有翠绿色或蓝绿色的外观,其颗粒大小、形态、分布等会影响其外观质量。
2. 纯度标准:孔雀石绿的纯度越高,其化学性质越稳定,用途越
广泛。
因此,孔雀石绿的纯度标准主要包括纯度百分比和杂质含量等
方面的要求。
3. 含量标准:孔雀石绿是一种有机化合物,其含量对化学性质和
物理性质有着重要的影响。
因此,孔雀石绿的含量标准主要包括含量
百分比和总重量等方面的要求。
4. 稳定性标准:孔雀石绿在一定环境下容易分解,其稳定性标准
主要包括在不同的温度、酸碱度、含水量等环境下的稳定性等方面的要求。
5. 安全性标准:孔雀石绿具有一定的毒性和危险性,其安全性标
准主要包括对人体和环境的安全性等方面的要求。
不同的检测标准适用于不同领域和用途的孔雀石绿,具体标准可
咨询相关专业机构或实验室。
孔雀石绿的作用说明
合成步骤：将硫酸铜和甲醛溶液混合，加 入氢氧化钠调节PH值，加热至沸腾后冷却， 经过滤、洗涤、干燥等步骤得到孔雀石绿 晶体。
注意事项：合成过程中需严格控制反应条件，避 免对人体和环境造成危害。
温度：孔雀石绿 合成需要在一定 的温度下进行， 通常为室温或稍 高温度。
酸碱度：孔雀石 绿合成需要在酸 性或碱性条件下 进行，通常需要 调节溶液的pH值。
孔雀石绿对水生生物有毒性，可能导致水生生物死亡或繁殖受阻。
孔雀石绿在环境中不易降解，容易在生物体内积累，对生态环境造成长期威胁。
孔雀石绿可能与其他物质发生反应，产生更具有毒性的物质，对环境造成更大的危 害。
PART FOUR
苯胺染料 苯酚 甲醛 甲酸
原料：硫酸铜、甲醛、氢氧化钠等
反应条件：高温高压
溶解度：孔雀石绿在水中溶解度较小，溶于乙醇、甲醇等有机溶剂 稳定性：孔雀石绿在酸性或碱性溶液中不稳定，易分解产生有毒物质 溶解性质：孔雀石绿为深绿色晶体，易溶于水，难溶于有机溶剂 溶解影响因素：孔雀石绿的溶解度受温度、pH值、有机溶剂等因素影响
孔雀石绿对光和热的稳定性 较好，不易变色。
孔雀石绿在常温下稳定，不 易分解。
反应时间：孔雀 石绿合成需要一 定的反应时间， 通常需要数小时 至数天。
原料：孔雀石绿 合成需要使用各 种原料，如铜盐、 酸、碱等。
PART FIVE
高效液相色谱法：通过色谱柱分离孔雀石绿和隐色孔雀石绿，用紫外检测器检测，可定性检测孔雀 石绿的存在。
薄层色谱法：将孔雀石绿在薄层板上展开，用孔雀石绿标准品作为对照，通过斑点的颜色和位置进 行定性检测。
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二、多克隆抗体的制备
将免疫原(LMG-BSA)与福氏完全佐剂以1∶1混溶, 对两只新西兰大白兔进行多次免疫(第一次动物免疫将 免疫原与福氏完全佐剂混溶,之后的动物免疫将免疫原 与福氏不完全佐剂混溶),经5次免疫后,制得多克隆抗体。
三、间接酶联免疫吸附分析法步骤
用包被抗原(LMG-OVA)包被酶标板,200μL/孔， 4℃过夜。 用PBST缓冲液洗板3次, 300μL/孔，加入1%Casein进行 封阻，室温放置1h,洗板。 加入抗体,标液(或样品稀释液)各100μL/孔,室温孵育1h。 包被在酶标板上的固定抗原(LMG-OVA)和添加的标液中 的LMG游离抗原与竞争抗体的结合位点。PBS洗涤扣干3 次，游离的抗原抗体复合物被洗涤去除。 加入用PBS稀释的山羊抗兔 IgG2辣根过氧化物酶偶合物 (GaRIgG-HRP), 200μL/孔,室温1h。形成抗原-抗体-酶标 二抗的复合物固定在酶标二抗上，洗板, 。PBS洗涤扣干3 次，游离的酶标二抗被洗涤除去。 加入TMB底物溶液200μL/孔,显色,避光反应,在微量振荡器 上振摇约15～20min。 加入5%硫酸,80μL/孔,终止反应。
孔雀石绿的分析
孔雀石绿 ：
化学名为四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式C23H25ClN2， 又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿、维多利亚绿或中国绿,属三 苯甲烷类,用于制陶、纺织、皮革、食品着色剂和细胞染剂, 目前多用于抗真菌感染和杀灭寄生虫,在水产领域一般用于鱼 类防治水霉病,烂鳃病以及寄生虫等,由于其性价比高,曾一度 在水产养殖业中广泛应用。 但各种毒理学实验表明,MG具有高毒、高残留、“三致” 等毒副作用,其在水产领域的应用已为世界各国所禁止。近年 来发现孔雀石绿(MG)特别是其代谢产物无色孔雀石绿(LMG) 在水产动物体有明显的蓄积残留现象,而其化学官能团三苯甲 烷是一类致癌物质
二、免疫学检测主要用酶联免疫检测法。
国内孔雀石绿检测标准
酶联免疫检测法
理化检测方法适用于专业检测和实验室使用，,但难以满足现 场快速检测和基层样品初筛的要求。近年来发展迅速的免疫分析 法(IA)集免疫反应、有机合成、酶催化等先进技术于一身,具备快 速准确,成本低廉等特点,可以满足现场初筛,快速判定的要求。
孔雀石绿(MG)的结构式：
无色孔雀石绿(LMG)的结构式:
孔雀石绿的检测方法
目前孔雀石绿的检测以理化检测法和免疫学检测法为主。
一、理化检测法
薄层层析法 分光光度法 气相色谱法( GC) 高效液相色谱法( HPLC)
液相色谱质谱串联检测法( LC-MS)
气相色谱质谱联用法( GC-MS)
Hale Waihona Puke 建立小分子免疫分析技术,关键点有3个:
人工抗原合成和抗体制备。 酶和抗体标记物的备。 检测技术方法学的建立。 LMG是小分子质,在免疫学上称半抗原,必须要同大分子 载体偶联后才能免疫动物制备抗体。
无色孔雀石绿的修饰
无色孔雀石绿的衍生化反应途径
一、免疫原及包被抗原的制备
利用重氮化法将无色孔雀石绿修饰物与牛血清白蛋白 (BSA)和卵清蛋白(OVA)交联,制成免疫原及包被抗原
结果处理：
用酶标仪于450nm处测定各孔溶液的吸光度(A)。标 准溶液中无色孔雀石绿的浓度越大,吸光度越小。以A～ logC作图得到测定无色孔雀石绿的标准曲线,从图中可以 算出检出限(DL)和IC50值。IC50值越小,灵敏度越高。待 测样品中无色孔雀石绿的浓度可根据其相应的吸光度从标 准曲线中求出。