生物固氮的15N2同位素示踪直接测定方法
华中农业大学同位素示踪技术讲课提纲七
af = 1.37-0.37 = 1.0%
∴ Ndff = ap/af = 0.3/1.0 = 30%
Npf = Np×Ndff = 30Kg/亩×30% = 9Kg/亩
施入尿素量：W = 20/40% = 80Kg/亩
肥料N素利用率：R = Npf/Nf= 9/20 = 45%
①15N2还原法（Burris,1941）:充15N2密室进行
NdfA=a样/a气×100%
固氮量=NdfA×总N量 ②同位素稀释法（J、O、Legg等，1975），15N施入土壤
NdfA=1- a固/a非
③AN值法（M、Fried等，1975），田间种固N、非固N NdfA=(As + Afix - As) ×NdfF/Af As、Af、Afix分别代表土壤、肥料、大豆有效N量。 NdfF:来自肥料N素的比例。
Ndff = ap/af×100% （设N素来源于土壤
和肥料二方面） （3）
af：肥料N的原子百分超（或动物饲料N的原 子百分超，此时又多了一个动物排泄因素）。
上片解释见第五章第37片同位 素稀释法
4 、 植 物 从 土 壤 中 摄 取 N 的 % （ Percentage of in the plant tissue derived from
(2) 仪器的本底检查。
(3)离子峰的选择（14N和15N的峰比28N、29N小 10倍，选28N、29N、30N）。
(4) 仪器精确度检查（检查去O2后的空气或 纯N气）。
2.分析样品的制备：
(1) K氏法（Kjeidali） 质谱分析常用法。
A.样品的消化：（例：0.05g植样
+10ml 浓 H2S04+3.3gSe:CuSO4:K2SO4 为 1:10:100混合催化剂→样液清亮再消煮 5h （ 土 ） 或 2h( 植 ) ， 温 度 120-140℃ 。 样品予处理：水杨酸—硫酸法：5g干土 或0.5g植样+12ml水杨酸：硫酸为50g： 1000ml 溶 液 中 放 置 30min ， 再 加 2.5g 硫 代硫酸钠和15ml水，缓缓加热至停出起 泡→冷却→常规消化）。
[讲解]同位素示踪法
![[讲解]同位素示踪法](https://img.taocdn.com/s3/m/8456fb66dd88d0d232d46aaa.png)
[讲解]同位素示踪法同位素示踪法同位素示踪法在高中生物学实验中的应用同位素示踪法是利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法，即把放射性同位素的原子参到其他物质中去，让它们一起运动、迁移，再用放射性探测仪器进行追踪，就可知道放射性原子通过什么路径，运动到哪里了，是怎样分布的。
同位素示踪法是生物学实验中经常应用的一项重要方法，它可以研究细胞内的元素或化合物的来源、组成、分布和去向等，进而了解细胞的结构和功能、化学物质的变化、反应机理等。
用于示踪技术的放射性同位素一般是用于构成细胞化合物的重要元素，如3H、14C、15N、18O、32P、35S、131I等。
在高中生物学教材中有多处涉及到放射性同位素的应用，下面笔者对教材中的相关知识进行归纳如下:1 研究蛋白质或核酸合成的原料及过程把具有反射性的原子参到合成蛋白质或核酸的原料(氨基酸或核苷酸)中，让它们一起运动、迁移，再用放射性探测仪器进行追踪，就可知道放射性原子通过什么路径、运动到哪里以及分布如何。
2 研究分泌蛋白的合成和运输用3H标记亮氨酸，探究分泌性蛋白质在细胞中的合成、运输与分泌途径。
在一次性给予放射性标记的氨基酸的前提下，通过观察细胞中放射性物质在不同时间出现的位置，就可以明确地看出细胞器在分泌蛋白合成和运输中的作用。
例如，通过实验说明分泌蛋白在附着于内质网上的核糖体中合成之后，是按照内质网?高尔基体?细胞膜的方向运输的，从而证明了细胞内的各种生物膜在功能上是紧密联系的。
3 研究细胞的结构和功能用同位素标记氨基酸或核苷酸并引入细胞内，探测这些放射性标记出现在哪些结构中，从而推断该细胞的结构和功能。
4 探究光合作用中元素的转移利用放射性同位素18O、14C、3H作为示踪原子来研究光合作用过程中某些物质的变化过程，从而揭示光合作用的机理。
例如，美国的科学家鲁宾和卡门研究光合作用中释放的氧到底是来自于水，还是来自于二氧化碳。
他们用氧的同位素18O 分别标记H2O和CO2，使它们分别成为H218O和C18O2，然后进行两组光合作用实验:第一组向绿色植物提供H218O和CO2，第二组向同种绿色植物提供H2O和C18O2。
15n同位素标记法
15n同位素标记法15N同位素标记法是一种用于研究氮循环和生物地球化学过程的重要方法。
本文将介绍15N同位素的特点、应用领域以及标记原理等内容。
一、15N同位素的特点15N同位素是氮的一种同位素，其核内含有15个中子。
与常见的14N同位素相比，15N同位素相对稀少，但具有更大的质量。
由于15N同位素的存在，使得我们可以通过测量样品中15N同位素的丰度来了解氮元素的来源、转化以及循环过程。
二、15N同位素的应用领域15N同位素标记法在许多领域都有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 土壤生态学研究：通过向土壤中添加15N同位素标记物，可以追踪土壤中氮的转化过程，了解土壤中氮的来源和去向，以及微生物对氮的利用和转化等。
2. 植物生理学研究：通过将15N同位素标记物注入植物体内，可以追踪氮在植物体内的分配和转运过程，了解不同部位对氮的利用效率以及植物对外源氮的吸收和利用能力。
3. 动物营养学研究：通过给动物饲料中添加15N同位素标记物，可以研究动物对不同氮源的利用效率，了解动物对蛋白质和氨基酸的消化吸收过程。
4. 水生生态学研究：通过向水体中添加15N同位素标记物，可以追踪水中氮的来源和去向，了解水体中氮的循环和转化过程，以及水生生物对氮的利用和转化。
三、15N同位素标记的原理15N同位素标记法的原理是利用15N同位素和14N同位素之间的质量差异来追踪氮的转化过程。
通常使用的方法是将含有15N同位素的化合物与未标记的化合物混合，形成不同比例的混合物，然后将其应用到研究对象中。
通过测量样品中15N同位素的丰度和14N同位素的丰度，可以计算出氮的转化率、利用率等参数。
四、15N同位素标记法的实验步骤15N同位素标记法的实验步骤通常包括以下几个方面：1. 标记物的制备：制备含有15N同位素的化合物，并与未标记的化合物混合。
2. 标记物的应用：将标记物应用到研究对象中，可以通过根部浸泡、叶面喷施、饲料添加等方式将标记物引入到研究对象体内。
氮同位素测定-概述说明以及解释
氮同位素测定-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述：氮同位素测定是一种通过分析样品中氮同位素的比例来揭示样品起源、代谢途径、食物链关系等信息的技术。
氮同位素通常以氮的两种主要同位素氮-14和氮-15的比例来表示，而这种比例在不同来源和环境中具有一定的稳定性。
因此，氮同位素测定可以帮助科研人员揭示物质循环、生态系统中的能量传递规律以及动植物之间的食物链关系。
本文将介绍氮同位素的基本概念和应用，并探讨氮同位素测定的方法和技术。
同时还将介绍氮同位素在不同领域的应用情况，展示其在环境科学、生物学、地质学等领域的重要作用。
通过本文的阐述，读者将更加全面地了解氮同位素测定的意义和应用范围，从而更好地认识和利用这一技术手段。
1.2 文章结构本文分为引言、正文和结论三个部分。
在引言部分，将对氮同位素测定进行概述，并介绍文章的结构和目的。
在正文部分，将详细介绍氮同位素的概念和应用，氮同位素测定的方法和技术，以及氮同位素在不同领域的应用。
最后，结论部分将总结氮同位素测定的重要性，展望其未来发展，并得出结论。
通过这样的结构，读者可以清晰地了解氮同位素测定的相关知识和应用，对其重要性和发展前景有一个全面的认识。
1.3 目的本文旨在介绍氮同位素测定的原理、方法和应用，以便读者更深入地了解氮同位素在科学研究和实际应用中的重要性和价值。
通过对氮同位素的概念和测定技术进行详细介绍，希望能够帮助读者更好地理解氮同位素在不同领域的应用，如环境科学、生物医学、地质学等领域。
同时，我们也将展望氮同位素测定技术未来的发展方向，以期为相关领域的研究和发展提供一定的参考和借鉴。
通过本文的阐述，读者将能够深入了解氮同位素测定在科学研究中的重要作用，促进氮同位素研究领域的进一步发展和应用。
2.正文2.1 氮同位素的概念和应用氮同位素是指氮原子核内具有不同中子数量的同位素，常见的氮同位素有氮-14（14N）和氮-15（15N）。
在自然界中，氮-14是主要存在的同位素，占氮的总量的约99.6，而氮-15仅占约0.4。
^(15)N同位素示踪技术在动物蛋白质代谢研究方法中的应用
^(15)N同位素示踪技术在动物蛋白质代谢研究方法中的应用高占峰;刁其玉
【期刊名称】《饲料研究》
【年(卷),期】2003()10
【摘要】氮素是动物营养最重要的元素之一 ,准确研究蛋白质 (氮素 )的代谢对于动物饲养标准的修订、饲料原料营养参数的准确性和合理配制日粮具有重要意义。
同位素示踪技术在农业中的应用 ,重点讨论了稳定同位素15N示踪技术在动物营养研究特别是在蛋白质代谢研究中应用的先进性、准确性和可行性。
【总页数】3页(P5-7)
【关键词】氮15;同位素示踪技术;动物营养;蛋白质代谢;研究方法;应用
【作者】高占峰;刁其玉
【作者单位】河北省农林科学院;中国农业科学院饲料研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S852.21;S124.2
【相关文献】
1.用15 N同位素示踪技术研究稻草饲养草鱼蛋白质转化效果及其应用 [J], 陈君琛;沈恒胜;宋保京;廖文福;汤葆莎
2.15N同位素稀释技术和示踪技术在森林土壤N素研究中的应用 [J], 文哲
3.同位素示踪技术在动物消化代谢研究中的应用 [J], 龙芳羽;王宝维;张旭晖
4.15N同位素示踪技术在动物蛋白质代谢研究方法中的应用 [J],
5.^(15)N-甘氨酸示踪法在运动动物蛋白质代谢实验中的应用 [J], 许志勤;孙咏梅;高兰兴;金宏;张林;王先远
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稳定同位素示踪技术
表1：试验所得数据
试样 测定项目 15N丰度（%）
地上部分 3.597
15N原子百分超（%） N%（全氮百分含量）
质量（g）
3.227 4.57 1.16
N的数量（mg/盆） 53.0
根系
3.547 3.177 1.31 0.74
9.7
土壤
0.454 0.084 0.19 1000 1900
（一）植物中来自肥料及土壤氮的百分数
=110 （公斤氮/公顷）
“A”值可用于评价土壤肥力状况，定量地 评定同土壤有效养分水平密切相关的因素。
(三) 肥料氮素利用率
肥料氮素利用率
NDFF% × 植物全氮量（kg/公顷）
=
施氮量（kg/公顷）
肥料氮素利用率% (地上部)
= 64.5% × 53mg/盆 100mg/盆
= 34.19%
肥料氮素利用率% (根系)
一般用硫酸钾、硫酸铜和硒粉组成的混合催化剂， 三者的质量比为 100：10：1。
2. 将铵转化成氨气
在高真空气化装置中，用碱性次溴酸钠将铵氧化 而产生氮气，其反应式：
2NH4+ + 3NaBrO
N2↑+ 5H2O + 3NaBr
四 、质谱法测定15N丰度
（一）质谱仪器的工作原理
利用电磁学原理，使带电粒子按照质荷比 进行分离，从而测定其质量的分析仪器。
进行的示踪试验。
局限性:
1. 标记化合物偏高; 2. 样品制备复杂; 3. 所需的仪器如质谱仪比较昂贵。
第二节 稳定同位素15N的测定方法
同位素
12N 13N 14N 15N 16N 17N 18N
氮元素的同位素
射线种类 半衰期 自然丰度 (原子%)
稳定同位素示踪技术评估氮素循环过程分析
稳定同位素示踪技术评估氮素循环过程分析引言：氮素是生物体生长发育和维持生命活动所必需的关键元素之一。
然而，过量的氮素输入可以导致环境问题，如水体富营养化和土地退化。
为了准确评估氮素的循环过程，稳定同位素示踪技术成为了一种有效的工具。
1. 稳定同位素示踪技术的基本原理稳定同位素示踪技术是基于同位素的自然存在及其相对丰度的差异来分析和追踪化学元素的运动和转化过程。
在氮素循环中，氮的两个稳定同位素氮-14（14N）和氮-15（15N）被广泛应用。
通过测量样品中同一化学化合物的不同同位素的相对丰度，可以揭示氮素的来源、转化途径以及相应的过程。
2. 氮素循环过程分析方法2.1. 正交分析法正交分析法是一种常用的稳定同位素示踪技术，在氮素循环过程研究中得到广泛应用。
该方法将不同位置吸收的氮元素分离，通过测量不同部位氮同位素的相对丰度，可以确定氮素在不同环境中的来源和去向。
例如，通过比较土壤中的氮同位素丰度来判断氮素是否来自化肥或土壤有机质。
2.2. 随机分析法随机分析法是一种直接测量被示踪元素在土壤或其他环境中的迁移和转化过程的方法。
该方法通常通过标记同位素添加到实验样品中，然后测量其在时间和空间上的变化。
例如，在氮素循环过程中，通过添加同位素标记化肥，可以跟踪氮素在土壤中的迁移和转化过程，评估土壤中氮素的损失情况和植物对氮素的吸收利用能力。
3. 氮素循环过程分析的研究进展3.1. 氮素来源与转化稳定同位素示踪技术在氮素来源和转化的研究中起到了关键作用。
通过测量不同环境样品中氮同位素的丰度，可以确定氮素的来源，如大气沉降、土壤有机质和化肥。
此外，通过跟踪氮素同位素在不同环境中的转化过程，可以了解氮素的转化途径，如氮素硝化、还原和固氮过程。
3.2. 氮素损失与控制氮素损失是氮素循环过程中的重要环节，对减少农业环境污染和提高氮素利用效率具有重要意义。
稳定同位素示踪技术可以量化氮素在不同环境中的损失情况，并揭示氮素损失的主要途径和影响因素。
氮稳定同位素示踪水体氮污染研究
氮稳定同位素示踪水体氮污染研究氮输入超标会引起发水体富营养化、水生生物死亡等一系列环境问题，通过研究水体氮浓度、氮同位素值的时空分布特点和成因，能定性的判别水体氮污染的来源及其转化机制。
本文结合该学科领域的研究成果，对氮同位素示踪技术运用到水体氮异常的研究中作出综述，有以下成果：论述了两种常用的氮稳定同位素示踪技术的（15N自然丰度法、15N同位素稀释法）的机理及运用;氮的来源及转化过程中的分馏效应;对有机氮同位素的研究中，颗粒有机氮（PON）的δ15N 值再结合13C、C/N比值可以综合判断有机颗粒物的来源，并可作为生态系统中氮的生物地球化学反应及转化过程的识别标志。
标签：氮稳定同位素;水环境;颗粒态有机氮随着工农业生产的发展，氮污染已成为水环境问题研究的热点，世界许多地方水环境中的氮含量都超过了相关机构规定的饮用水中N03一含量的上限值，这也给人们的身体健康带来极大隐患。
迄今，许多学者已将氮稳定同位素应用到判别水中氮污染来源以及水循环过程中氮的转化机制之中.对水体中氮稳定同位素也进行了广泛的探索。
通过对氮稳定同位素的研究，可以有效的判别水体中氮异常的来源，了解氮的转化机制和沿途的变化，从而有效地防范和控制水体氮污染一、氮稳定同位素示踪技术（一）15N自然丰度法氮有14N和15N两种稳定同位素，其中14N豐度为99.64‰，15N丰度为0.36‰[1]。
不同物质中有着不同的14N和15N的同位素比值（δ15N），并且，δ15N 在不同的地质背景和含水介质中也有所相异，所以研究水体中的自然氮同位素值对判断区域地质环境有着重要的现实意义的。
通过研究地表水氮浓度、氮同位素值的时空分布特点和成因，能定性判别水体氮污染的来源及其转化机制。
（二）15N同位素稀释法氮循环过程中在沿途的变化会引起氮同位素的分馏效应，通过加入15N标记体，经过相关的生物化学过程测定15N标记体原子百分比变化可以示踪物质转化迁移途径与程度。
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步骤
在烧瓶X中放入(15NH4)2SO4，分液漏斗中加 入相应数量的次嗅酸盐一碘溶液。在Y和Z中分别 加入KMnO4-KOH溶液和Na2SO4-H2SO4溶液, 约到其 容积的1/10即可。用真空泵从处抽气, 使X的真 空度达到大约10-2-10-3托，关闭活栓a ，然后打 开分液漏斗的活栓, 将次嗅酸盐一碘溶液滴入X中 , 产生15N2气，在产气过程结束后， 将蒸馏水加 入分液漏斗, 并使蒸馏水滴入烧瓶X中，当瓶中 15N2的压力稍大于大气压力时, 滴漏过程便自动停 止。
表.在原位条件下水稻根际大气固氮与固定氮的植物吸收
图.15N2暴露气密性生长室。A茎室；B，中间室；C，根室；D
大气循环进口；E，大气循环出口；F， 15N2 气体入口；G， 气体采样器附件；H，排水孔。
3.同位素化学计量关系
设样品中N来自大气标记Natm和非大气非标记 Nnon两部分组成，其15N原子百分超为Esample，且 大气标记15N的原子百分超为Eatomsphere，则由 同位素质量平衡，有
4.举例
参见：Atmospheric dinitrogen fixation in the flooded rice rhizosphere as determined by the N-15 isotope technique. Soil Sci. Plant Nutr., 16 (4), 551-559, 1980
装置
制备装置如图所示。各玻璃部分间是通过涂 抹硅油的磨口接合并用耐压管道连结。图中Y和Z 分别为KMnO4-KOH和Na2SO4-H2SO4吸存器，15N2气贮 存瓶（V）与另一只瓶子（W）连结, 可以防止空 气回流到V。选用大小不同的圆底烧瓶, 可以使X、 Y 和Z部分的容积, 比试剂在一个大气压下产生的 15N2 的总体积稍微大一些，这时装置内部的气压 应该小于大气压。
这样纯化后的15N2气体就被转移至事先装满水的 贮存瓶V中, 从V 排水至W瓶, 这种布置可阻止空气 从活栓h 处回流 15N2气完全转移到瓶V中之后, 将 它和瓶W一起, 从活栓f和g之间, 与整个装置系统 开。
图.制备15N2的装置。X， 15N2发生器；Y，KMnO4（5%，w/v）-KOH（2.5%） 吸存器；Z，Na2SO4（20%）-H2SO4（5%,v/v）吸存器；V， 15N2 存储瓶；W， 排水存储瓶。1.蒸馏水，2.次溴酸盐-碘溶液；3（15NH4）2SO4；4. KMnO4 KOH溶液;5. Na2SO4-H2SO4 。
1.15N2的制备、纯化和存储
制得，15N即2可由15N标记铵盐在碱性条件下和次溴酸盐反应
试剂
15
NH
4
2OBr
- 15 N 2
Br2
2H 2O
用Bremner法制备次溴酸盐一碘溶液。将400克NaOH 溶解到60毫升水中，将此NaOH溶液的一半加入带有温度 计并以碎冰冷却的一公升Ernlemeyer烧瓶中，将120毫 升Br2缓慢地、逐滴地加入, 猛烈搅拌, 使温度保持在5 ℃ 以下，再加入另一半NaOH溶液，将此混合液搅拌几分钟， 在冰箱中贮存一个星期之后, 将沉淀的NaBr结晶与上清 液分开，用等体积的KI溶液（0.2%，w/v）稀释上清液。 1 毫升这种溶液可以使5-6毫克NH3+氧化成N2。 K2M0N克O1N40-a0KS毫OOH4升,溶得水液到中，N依1a0S次0O毫4溶–升解H2硫5S克O酸4溶K溶M液n液4和。（2.55%克，KvO/Hv,）制中成溶解
打开活塞b、c 、d、e 和f, 关闭活塞g, 从活 塞f处对Y和Z抽真空, 关闭活塞c , 打开活塞a , 小 心地打开活塞b 使X瓶中15N2的进入Y,待分液漏斗 中的水完全置换出X瓶中的15N2 气体后, 关闭活塞 b。关闭活塞e并打开活塞c, 从处放水进入Y中， 置换15N2气体使其转至烧瓶Z , 关紧活塞d, 由活栓 f连通Z和V, 并打开活塞c和g，从处加水至Z中。
（N a N non） E sample N a E atomsphere
则，样品中的N来自大气标记N的比例为
Patm
Na
Na Nnon
Esample E a tom she re
固氮的N量为Na源自N totalE sam ple E atomshere
在整个固氮暴露过程中，也许由于系统外大 气的泄入或土壤N2的发射对气相标记15N2的稀释 作用，使得Eatomshere并不恒定，而是随时间减少 的，因此计算时应取算术或积分平均值。
2.固氮测定装置和流程
固氮生长箱的室C与A和B通过涂抹硅油的磨 砂平边接合在一起，在D、E、F、G和H管口有聚 四 依氟次乙通烯过栓碱塞性阀高，锰整酸个钾容溶器液保和持酸气性密硫状酸态钠溶。液15N并2 F用口真引空入泵玻抽璃真容空器，。当在水15下N2的引泥入土前中，由气于密负容压器冒先出 气 容泡器时中，的继压续力且达保 到持 大几 气分 压钟 。后 为， 了然保后持作引物入的15N生2 使理 条件，使用空气泵通过二氧化碳缓冲溶液循环密 封室上端的（进口D和出口E）的大气相。缓冲溶 液 缓 度由冲维混液持合的在物构80组成0p成比pmK例。2C可O3以（调1/节20，M）以-便KH顶CO部3（的1/C1O02浓M），
用15N同位素测定生物固氮的方法可分为间
接和直接两种方法，间接测定又包括15N富集同位 素示踪法和用15N自然丰度变异法，该两种方法均 需要参比作物或已知参比值以确定生物的固氮量， 因此一般有很大的不确定性，固氮量的确定只能 是半定量的；直接测定法是将联合固氮系统暴露 在15N2气氛围中，通过直接测定15N吸收同化而确 定其固氮的方法，这种方法是一种定量测定生物 固氮的方法，但需要将固氮系统封闭在一个气密 的固氮暴露箱内，操作比较复杂，另外标记同位 素花费较高，因此长期以来在研究应用并不十分 广泛，然而随着DNA或RNA探针技术的发展，直接 固氮测定法在测定固氮和确定固氮微生物的基础 研究方面将展示广阔的应用前景。