对虾常见病害及防治

对虾常见疾病与防治

随着对虾养殖业的蓬勃发展，疾病暴发流行正成为限制对虾养殖业发展的主要因素。各地对虾发病现象相当普遍，虾病种类越来越多，有些虾病使虾池出现绝产的严重局面。对虾暴发性流行病使1993～1994年对虾绝产面积达50%以上，造成我国养虾业的巨大损失。虽然1996年以来南方广东、广西和海南三省区对虾养殖业有所恢复，但国内对虾养殖业仍遭受病害的困扰。

目前，已知对虾病原已达100多种，主要病原是病毒和细菌，而在对虾养殖生产中，往往是病毒和细菌合并感染或继发感染。就病毒而言，已达18种以上，其中危害对虾最严重的是斑节对虾杆状病毒（Penaeus monodon-type baculovirus，简称MBV）、白斑综合症病毒（White spot syndrome virus，简称WSSV）、黄头病毒（Yellow head virus，简称YHV）和塔拉综合症病毒(Taura syndrome virus，简称TSV)等。

第一节对虾疾病发生的原因

对虾疾病发生的原因比较复杂，当外界的因素的有害因素超过了对虾的适应能力时就会导致对虾发病，各种不同的致病因素导致的疾病表现不同的病症，了解疾病发生的原因有利于作出合理的预防、正确诊断和有效治疗虾病。

一、引起对虾疾病的外界因素

引起疾病的外界因素基本可以概括为生物、理化和人为三大因素。

1 生物因素

生物因素是引起对虾疾病最重要因素之一，造成对虾病害的病原生物包括传染性生物：病毒、细菌和真菌等微生物；侵袭性生物：寄生虫等；敌害生物：凶猛性鱼类等。

2 理化因素因素

养殖水域的温度、盐度、溶解氧、酸碱度、氨氮、H2S等理化因子的变动造成环境胁迫或人为造成的污染物质等因素，超越了养殖对虾所能忍受的临界限度导致对虾发病。

3 人为因素

放养密度不当，混养比例不恰当，饲养管理不善，技术操作不细致等人为因素都容易导致对虾发病。此外，在捕捞、运输和饲养管理过程中，往往由于工具不适宜和操作不小心，使饲养对虾本身受到摩擦或碰撞而受伤，受伤处组织机能丧失和体液流失，渗透压紊乱，引起各种生理障碍以致死亡。除了这些直接危害以外，伤口也是各种病原微生物侵入的途径。

投喂饲料的数量或饲料中所含的营养成分不能满足养殖对虾维持生活的最低需要时，养殖对虾往往会生长缓慢甚至停止生长，身体瘦弱，抗病力降低，严重时就会出现明显的症状甚至死亡。营养成分中容易发生问题的是缺乏维生素、矿物质、氨基酸。其中最容易缺乏的是维生素和必需氨基酸。腐败变质的饲料也是致病的重要因素。

二、内在因素

疾病的发生都有一定的原因和条件，外因必须通过内因产生变化，因此内因是变化的关键，对虾对病原的敏感性的强弱与其自身的遗传性质和免疫力有关系，而生理状态、营养条件、生活环境等也能影响对虾对病原的敏感性。

以上这些病因对养殖的对虾的致病作用，有时是单一种病因的作用，也可以是几种病因混合的作用，并且这些病因往往会有相互促进的作用。

第二节对虾疾病的预防

做好对虾疾病的预防工作是提高对虾增养殖产量及经济效益的重要措施之一。目前对虾养殖模式中，追求高密度、高产量和高效益是共同特点，防病便显得更为重要。多年来的实践证明，只有贯彻“全面预防，积极治疗”的方针，采取“无病先防，有病早治”的原则，才能达到减少和避免疾病的发生。以防为主是对虾疾病的特点所决定的。对虾生活在水中，一旦生病，及时和正确的诊断较为困难；其次，当发现有对虾开始死亡时，一般病情已较严重，治愈很困难；另外，对对虾进行治疗时，给药困难。内服药一般只能由对虾主动吃入，但当病情严重时，对虾已丧失食欲，即使特效药也不能达到治疗效果，尚能摄食的病虾，也因摄食量降低而不能吃到足够的药饵而影响疗效；体外用药一般采用全池泼洒和药浴的方法，仅适用于小水体，而对大水体便难以达到相应的效果。因此，在对虾的病害防治工作中，必须坚持以防为主，在预防措施上，既要注意消灭病原、切断病原传播途径，又要十分重视改善生态环境和提高养殖对虾自身的抗病力，只有采取全面的综合预防措施，才能减少和避免疾病的发生，从而保证对虾养殖业的稳定和可持续发展。

一、保证良好的养殖环境

对虾是生活在水中的生物，水环境的好坏直接决定着对虾能否健康快速地生长。

一）设计和建造养殖场时应符合防病要求

在建场前应首先对场址的地质、水文、水质、生物及社会条件等方面进行综合调查，在各方面都符合养殖要求时才能建场。其中尤其是水源一定要充足，水的理化性状要适合养殖对虾的生长，不被污染（主要是水源是否有码头，浮油，周边河流入海则要考虑河两岸有没有污染源，如化工厂、造纸厂、皮革厂等），不带病原体；同时每个池塘有独立的进排水系统等。

二）改善生态环境

1 每年清除池底过多的淤泥和污染物质，或排干池水后池底进行翻晒，淤泥不仅是病原体的滋生和贮存场所，而且淤泥在分解时消耗水中大量溶氧，同时产生有毒或有害物质，如硫化氢、氨等。

2 定期换水或加注新水保持水质清新。

3 在主要生长季节，晴天的中午，开增氧机或水质改良机，充分利用氧盈，降低氧债，改变溶氧分布的不均匀性，改善池水溶氧状况，提高池塘生产力。

4 定期泼洒水质改良剂和底质改良剂，改善水质和底质。

5 采用生态养殖的办法，减少病害的暴发。

二、控制和消灭病原体、切断传播途径

一）清整池塘

清池包括清除池底淤泥和池塘消毒两个内容，暂养池、养成池或越冬池在放养前都应清池。新建的池塘一般不需要浸泡和消毒，如果灌满水浸泡2-3天，再换水后放养更加安全。新建高位池的清池则较为简单，主要是清除池底杂物及平整池底。对于水泥护坡的池塘，由于水泥具碱性，容易造成pH值升高，则要先进水浸泡，浸泡水位为1-1.5 m左右，浸泡时间为7-10天，浸泡水pH值可达到8.8左右，正常海水pH为8.0-8.2。所以要将浸泡水排干后方可进行养殖

养殖过对虾的老塘则需要进行彻底清理。已养过对虾的池塘，因在底泥中沉积有大量残饵和粪便等有机物质，形成厚厚的一层淤泥。这些有机质腐烂分解后，不仅消耗溶氧，产生氨、亚硝酸和硫化氢等有害物质，而且成为许多病原体的滋生基地，因此应当在养殖空闲季节，即冬季或春季将池水排空，将淤泥尽可能挖掉。放养虾苗前再用药物消毒。消毒时应在池底留有少量水，盖过池底即可，然后用漂粉精150×10-6的浓度或漂白粉500

×10-6的浓度，或生石灰400×10-6的浓度左右，溶于水中后均匀泼洒全池，过1-2天后灌入新鲜海水，采用（15-30）×10-6有效氯的漂粉精消毒，再过3-5天后就可放养。

二）工具消毒

养殖的各种工具，往往成为传播疾病的媒介，因此，发病池所用的工具，应与其它池塘使用的工具分开，避免将病原从一个池塘带入另一个池塘。如工具缺乏无法做到分开时，应将发病池用过的工具处理后再使用。一般网具可用20 g/m3的浓度硫酸铜水溶液或50 g/m3的浓度高锰酸钾水溶液或100 g/m3的浓度福尔马林溶液或纯淡水等浸泡0.5 h；木制或塑料工具，可用5%漂白粉水溶液消毒，然后用清水洗净后再使用。

三）疾病流行季节前的药物预防

大多数疾病的发生都有一定的季节性，在南方多数疾病一般清明节前后和10-11月份这段时间内容易造成大规模流行。因此，掌握发病规律，及时有计划的在疾病流行季节前进行药物预防，是补充平时预防不足的一种有效措施，疾病流行季节期间将药物拌在饲料中制成颗粒药饲投喂。用药的种类随各种疾病而不同，尽量多用中草药，以免产生耐药性。有几点应注意的事项：

1必须选择对虾喜吃、营养全面、能碾成粉末的药。

2颗粒药饲在水中的稳定性好，一般应在水中30 min以内不散开，而对虾吃入后又能很快消化吸收。

3药饲的大小必须适口。

三、加强饲养管理

一）放养健康的虾苗和适宜的密度

放养的虾苗应体色正常，健壮活泼，必要时应先用显微镜检查，种苗不带有危害严重的病原，放养密度应根据池塘条件、水质和饵料状况、饲养管理水平等，决定适当密度，切勿过密。

二）投饲料要新鲜、量适

饲料的要求除了营养丰富全面，饵料及其原料绝对不能发霉变质。配合饵料的营养成分要全，特别不能缺乏各种维生素；黏合性要强，在水中至少要维持2小时不散开。

每天的投饲量要适宜，每天的投喂量要分多次投喂。每次投喂前要检查前次投喂的吃食情况，以便调节投饵量。

三）控制好养殖水环境

在对虾的饲养过程中，应每天至少巡塘3-4次，巡塘可以及时发现可能引起疾病的各种不良环境污染，尽早采取改进措施，防患于未然；也可以及时发现疾病的一般症状，例如对虾离群独自漫游于水面，失掉平衡，体色反常，比吃食等，就应立即进行诊断检查，尽早设法治疗，巡塘时应注意的问题是养殖对虾的活动情况、摄食情况、水温、水流、水色和透明度等，PO43--P、H2S、NH4+-N、总碱度、氧化还原电位、NO2--N、COD和NH3-N等每5 d测定一次。DO、pH、盐度和水温每天测定两次。及时作出分析，及时采取措施。

四）防止病原传播

在日常管理工作中防止病原的传播主要应采取以下几点措施：

1对生病的或带有病原的对虾要及时捞出，即发生疾病以后除及时治疗外，尽可能将同一水体中生病的和尚未生病的对虾分开饲养。尚未生病的对虾很可能已成为带菌者或带虫者，因此，凡已发现疾病的池塘，其中的所有动物都不要与其他水体中的动物接触，该池中的水也不要排入其它池塘。有的育苗场因一池中的苗种大部分生病死亡，剩余少数不值得继续培育下去，或合并到其它苗种池中，这种做法应严加禁止。

2在生病的池塘中用过的工具应当用浓度较大的漂白粉、硫酸铜或高锰酸钾等溶液消毒，或在强烈的阳光下晒干，然后才能用于其它池塘。有条件的也可以在生病池塘中设专用

工具。

3病死或正在发病的对虾，应及时捞出并深埋他处或销毁，切勿丢弃在池塘岸边或水源附近，以免被鸟兽或雨水带入养殖水体中。

4标粗池发现有疾病的对虾在治愈前原则上不进行分苗。

第三节药物的施用方法

使用药物预防或治疗对虾的疾病，其给药方法与人医或兽医是不同的，原因在于对虾生活在水中，与我们人的生活介质——空气不同。

一、药物悬挂

此法是将防治药物装在袋内或篓内，然后悬挂在水中或食场附近。其数量和深浅，按水体面积和养殖种类的习性而定。此法多用于疾病流行季节时的预防或病情轻时用。具有用药量小，副作用小等优点，但杀灭病原体不彻底，只有在养殖对虾游到挂袋附近的水周围处，才能取到作用。目前在南方高位精养虾池在进水渠道里采用药物挂袋法处理水质，减少病害的暴发。

二、浸洗

此法是将患病对虾捕捞到配好有一定药物浓度的容器内浸洗一定时间，使其强制受药。通常用于苗种运输和放养及亲虾。浸洗法用药量少，时间可人为控制，一般不污染水体，不影响水体中的其他生物。但需要捕捞和搬运对虾，而且容易受伤，只适用于体表和鳃上的病原生物感染，放回水体后可能重新感染，对大型水体不宜使用。

三、全池泼洒

此法是疾病防治中最常用的一种方法。通常采用对某些病原体有强大杀灭效果，而对对虾本身安全的药物及浓度，全池泼洒。使用此法，首先应准确地测量池塘水体，计算药量，然后称取药物用水溶解后均匀地泼到全池中去。此法施药方便，能较彻底地杀死养殖动物身上及生活在水体中的病原生物，适用于中、小型水体。但用药量大，对大型水体或价格昂贵的药物不适用，并且水体中的有益生物常被杀死，对水环境也有一定污染。

四、口服药饵

此法是将药物按一定比例均匀地混到饵料中制成药饵后进行投喂，药饵的形状多为颗粒状。此法多用于体内病原生物感染和病情较轻尚未失去摄食饵料能力的对虾或同池中尚未感染的个体预防。有用药量少、使用方便和不污染水体等优点。但口服药饵法只对那些还有食欲的个体有作用，对病重者或失去食欲的个体无效。

五、浸沤法

将草药浸沤在池塘的上风处或将捆扎好的中草药分成数堆，杀灭池水中及体外的病原体。此法适用于预防和早期治疗。

第四节对虾疾病的检测技术

一、对虾疾病的初步诊断

一）诊断器材和常用工具

对虾养殖生产中进行诊断的必要器材包括：解剖刀，解剖剪、镊子、放大镜、水质分析测试盒等，有条件的养殖场应配置显微镜和解剖镜及配套的玻璃器皿，对于检测分析单位应具备细菌分离、培养和鉴定的仪器，同时应具备完善的水质分析仪器，病毒鉴定的仪器等。

二）发病现场情况调查

1 调查发病养殖水体环境和发病史

2 了解池塘水质状况

需要调查水温、酸碱度、溶解氧、氨氮、亚硝酸盐、磷酸盐、硬度、化学耗氧量和有机耗氧量等。

3 调查养殖状况

包括放苗密度，投饵情况、生产操作管理等。

4 及时发现对虾疾病

从对虾的摄食、活动和体色等及时发现对虾病害。

二、对虾病毒检测技术的研究

病毒病是危害对虾最严重的疾病，随着科学技术的不断进步，生物学家应用生物学技术可以在细胞或细胞超微结构的水平上研究对虾病变和病毒结构，生物学技术是一种常用的检测手段，现把对虾病毒的检测方法分述如下。

一）现场快速诊断方法（Rapid detection）

对虾病毒病具有暴发性，所以，在生产上需要用简单快速的方法来诊断对虾是否带有病毒。

董颖等（1996）通过人工投喂感染实验，观察了中国对虾（Panaeus chinensis）感染暴发性流行病病原后出现的特殊外观病症，即与健康虾截然不同的空胃和拒食。在现场利用这种外观症状作排外诊断（Diagnosis by excusion

）和鉴别诊断（Differential diagnosis），可以简便和快速地判断出池虾群体中有无病虾，同时根据统计发病虾的概率也可以了解群体的发病进程。

排外就是把“空胃”作为排外的标准，排除掉饱胃及丰胃健康虾、刚蜕壳的健康虾等，留下少量可疑虾作鉴别用。例如，患有HPV病的对虾，只有在晚期可以出现空胃。但那时对虾的肝胰腺已呈蓝绿色，明显萎缩溃烂，且虾体异常瘦小，皮色发暗等，这些特征极易识别。根据病虾胃的特殊病症，很容易同健康虾空胃区别。

小时候发病的病虾。这项诊断技术的局限是仅适用于中国对虾感染“流行病”病原，并已发病（即出现病症）后的那些个体，且必需活体观察，但它的优点也是显而易见，不需复杂的仪器设备，也不需要高深的专业知识，极易普及应用。

Lightner曾经采用快速现场诊断对虾肝胰腺细水病毒样病毒（Hepatopancreatid Parvo-like virus,HPV）的方法（Giemsa stain）,该方法需要60。C染色30min,这个条件在野外难以保证。Sindermann et al.(1988)和廖一久（1989）在斑节对虾（Penaeus monodon）杆状病毒（Penaeus monodon-type baculovirus）病的现场诊断中，用1%伊红或0.1%孔雀绿涂片作为初步的结果。这种方法是单一染色，制片的对比度差，分辨率低。黄捷等人（1995）筛选出两种即可混合在一起，又能将对虾肝胰涂片的细胞核和细胞质分别台盼蓝和伊红Y （TE）。用含有0.6%台盼蓝和0.2%伊红的混合染色液涂染肝胰腺细小病毒样病毒感染的对虾肝胰腺，观察到核内的病毒包含体。

宋晓玲等（1996）的TE染色光镜快速诊断，取死亡亲虾（Penaeus chinensis）胃上皮用TE染液进行压片染色，可观察到细胞核内空泡化，胞核肿大，即为阳性发病。

Lightner(1983)和Redman曾经报道检查草虾是否感染杆状病毒的简易方法，即直接用肝胰腺涂片，然后用0.05%的孔雀绿染色，若见明亮蓝绿色的圆球形包含体即为阳性。但孔雀绿对包含体并无特异性，包含体不容易与其他圆形物如脂滴或泌颗粒区分。Vickers 等(1993)报道了利用压片涂抹对虾的肝胰腺，分别用H－E染色和Y啶橙染色。都可以在不到1 h内检测出Penaeus monodon-type baculovirus(MBV)包含体。经Y啶橙染色的细胞利用荧光显微镜，可见黄绿色的杆状病毒核内包含体。Y啶橙对不同组合的蛋白质有不同程度的结合性，细胞质为红色，脂滴为黑色，可避免孔雀染色的不准确性。荧光显微镜也许是在光

镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位的最有力的工具。

暗场显微镜通过聚光之前的特殊装置，使通过样品进入物镜成像的光只有折射光或衍射光。这样没有样品存在时视野是黑色的，而折射率很大的小颗粒观察得很清晰。Momnoyama 等(1995)用暗场显微镜在日本对虾（Penaeus japonicus）快速检测到有Rodshaped nuclear virus of penaeus japonicus(RV-PJ)。在血淋巴中观察到有许多0.5微米大小的病毒粒子。使用荧光显微镜和暗场显微镜这两种方法，虽然观察效果较好，但是对于一般虾农来说是不切实际的。

二）组织病理检测（Light microscopy）

光学显微镜技术曾经在细胞学研究中发挥了重要作用。不仅如此，在科学技术非常先进的今天，仍然离不开光学显微镜。用显微镜技术检测对虾病毒，就是利用各种不同染色方法将固定的虾组织进行切片后，通过光学显微镜观察致病细胞病变的发育过程，病毒包含体的形成部位、形状和大小，以及因感染WSSV而膨胀的细胞核。

何建国等（1992）用常规的组织切片方法，经HE染色在高倍镜下镜检斑节对虾WBV包含体，其仔虾感染率为100%，养成期感染率为63.6%～100%。Lo 等(1997)用光学显微镜在斑节对虾的眼柄、淋巴器官、中肠等组织中，观察到被WSSV感染而肿大的细胞核。孙修勤和楠田理一（1996）用HE和Feulgen染色，在中国对虾的肝胰腺细胞中发现了HPV包含体，其大小为22～24nm。Spann等（1995）用Feulgen染色，在来自澳大利亚的斑节对虾的淋巴样器官细胞中发现Lymphoid organ virus（LOV）病毒形成的胞质含体。

Bonami用Eosin染色，在范氏对虾的淋巴器官中发现Lymphoid organ virus（LOVV）病毒形成的细胞质包含体。宋晓玲等（1996）对死亡亲虾（Penaeus chinensis）用Davidson'sAFA固定，按常规方法进行光镜制片，用Ehrlichi's酸性苏木精染色。1%伊红酒精（95%）溶液复染。在肝胰腺血窦观察到血淋巴细胞核的皮下及造血组织坏死杆状病毒（Hypodermal and Hematoopoietic Necrosis Baculorirus，HHNBV）病变。Brown和Brann's Gran染色可检测到草虾的MBV形成的核内无定形包含体。Giemsa染色应用于对虾幼体中的HPV诊断可提高检测的灵敏度（罗文新，1997）。

三）电子显微镜（Elertron microscopy）

虽然光学显微镜仍然在组织病理学检测中起着重要作用，但是光镜的分辨率低，要研究内部的精细结构和病毒粒子的大小、结构和复制过程，需要分辨率更高的设备。

Couch（1974）首次用电子显微镜在桃红对虾（Penaeusduorarum）体内，观察到一种对虾杆状病毒（Baculoviruspenaeid，Couch Bp），其大小为74nm×270nm。何建国等（1996）用2.5%戊二醇固定液（0.1摩/升磷酸缓冲液，Ph7.2）固定具有白斑和红体（不带白斑）的斑节对虾，组织略硬化后，解剖肝胰腺、甲壳下表皮及鳃，切成0.5毫米×0.5毫米×0.5毫米大小样品。继续在戊二醇固定液中固定。固定后的样品经磷酸缓冲液冲洗3次，每次30分钟以上。经丙铜酸系列脱水。Epon's812液渗透包埋，Epon's812液聚合条件为37℃，60℃过夜12小时以上。超薄切片在AO超薄机上进行，切片厚度为50～100nm，切片经醋酸铀和柠檬酸铅双层染色之后在Philips CM10透射电镜观察。在鳃上皮细胞和甲壳表皮细胞感染三种类型杆状病毒。Lightner和Redman（1993）在原糙对虾（protrachypene precipuca）中发现一种虹彩病毒（Shrimp iridovirus，IR-DO），为6角形，具单位膜构成的囊膜。核酸蕊子直径约85nm，为DNA型。病毒粒子直径为122±7nm，最宽处直径为136±nm。Boonyaratpalin 等（1993）在泰国养殖的斑节对虾中首次发现黄头病毒（Yellow head virus，YHV），病毒粒子大小为150～200×45～40nm，核衣壳为90～160×16～22nm。

何建国等（1995）在患白斑病的斑节对虾鳃上皮细胞质中，发现直径约25nm的类微核糖核酸病毒（Picornaviruslike）。Lo 等（1997）在斑节对虾的精巢中观察有WSSV。陈细法等（1997）应用超薄切片和负染等技术，在日本对虾、长毛对虾（

Penaeus penicillatus）和中国对虾的肠、肝胰腺、淋巴样器官、鳃和肌肉组织中，发现一种新杆状病毒，称之为淋巴样细胞核型杆状病毒（Lymphoid cell muclear baculovirus，LNBV）。病毒直径96～112nm，是已知感染对虾最大的一种病毒。中央是高电子密度的核心，外囊衣壳和囊膜，两膜之间有宽阔的间隙。这9是已报道的任何一种对虾杆状病毒所没有的。纯化的病毒核壳衣表面有螺旋排列亚单位，也是该病毒特有的。

张进兴等（1997）在中国对虾的卵巢组织和受精卵细胞中，用电子显微镜观察到有球状病毒粒子。其大小为80nm左右。对虾肝胰腺细小病毒是在中国对虾中发现的第一种病毒（Lightner et al.，1985）。薛清刚等（1996）对该病毒进行了系统的研究。病毒颗粒呈20面立体对称，直径为23.3～29.8nm，属细小病毒科。现称其为中国对虾肝胰腺细小病毒（Hepatopaneratic Parvovirus of Penaeus chinensis,HPVPC）。Wongteerasupara等(1995) 在患病的斑节对虾体内发现SEMBV 病毒（a non-occluded ,systemic baculovirus）,位于细胞核内，无囊膜。有核衣的完整病毒粒子呈椭圆形，有突出的多绒毛状附属物，大小为276nm×121nm。

电子显微镜虽然可以观察到病毒粒子，但是样品制备困难，费事较久，而且对于形态特征相似的病毒难以鉴别。所以，电镜技术主要用于检测病毒的有无及病毒类型的初步鉴定。而对于种和型鉴别必须借助于特异性更强的方法。

四）免疫检测技术（Immunoassay）

免疫生物技术是利用特异性抗原抗体反应来研究组织细胞特定抗原的定位和定量技术。由于无脊椎动物缺乏免疫球蛋白介导的免疫应答，要对感染进行免疫诊断，只能根据抗体对病原体的特异反应。为了显示和观察这种抗原抗体反应，需要预先将某种标记物结合到抗体上。借标记物的荧光或酶有色反应、放射性或高电子密度，在光镜或电镜下进行定性、定位或定研究。

酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosbent assay,ELISA）利用酶与底物反应来检测抗原或抗体的方法。Lewis等(1986)报道了用间接夹心ELISA法检测对虾杆状病毒。该方法可以检测至少10纳克的病毒蛋白。黄捷等（1995）用单克隆抗体酶联免役技术检测对虾皮下造血组织坏死杆状病毒（Hypodermal and hematopoietic necrosis baculovirus,HHNBV）的病原体。这种方法快速简单，灵敏度高，且可定量。涂小林等（1995）用ELISA方法在中国对虾的肝胰腺和鳃组织检测了一种杆状病毒。

免疫荧光法（Immunofluorescence assay）是预先将荧光素标记在抗体上，再与涂片、切片上或细胞悬液中的抗原进行反应。借助于荧光显微镜能够观察是否存在相应的抗原并确定相应的位置。陈秀男等（1988）用该方法来检测草虾肝胰腺和排泄物所存在的包含体。病毒包含体在荧光显微镜下绿色荧光或橙红色。

免疫荧光法需要特殊设备，不易作定量分析，而且对结果判定有一定的主观性。相对地说ELISA检测的灵活性高，可达纳可水平。且具有特易性强、简单、及易观察等特点，可做定性定量分析，适合于对虾病毒的早期诊断（罗文新，1997）。

反向间接血凝实验（Reverse indirect hemagglutination，RIHA）是将特异性抗体与抗原连接到适当处理过的哺乳动物红细胞表面。通过抗体与抗原之间的特异性结合反应介导血细胞的凝结，从而达到检测相应抗原目的的一种简便免疫学诊断技术。薛清刚等（1995）用该方法检测了中国对虾的肝胰脏细小病毒HPV）。实验表明，该方法简便，重复性好，试剂稳定和样品检测可在1.5-2 h内完成，适合在现场推广使用。

五）对虾组织细胞培养技术（Tissue culture assay）

虽然自Grace（1982）从鳞翅目昆虫Antherae eucalypti建立首株细胞后，昆虫的组织培养研究进一步活跃起来。然而甲壳动物的组织培养研究工作国内外尚处于初期的实验性阶段。Peponnet和Quiot（1971）首次报道了螯虾、龙虾和蟹的类淋巴组织的离体培养。Daig

介绍了小龙虾的上皮细胞培养。但这些实验仅限于原代组织细胞的培养。近10多年来，对虾的组织研究工作进展较快，取得了一定的成果（王立平等，1995；张晓华等，1995；Luedeman

et al.1992；Hsu et al.，1995）。

Chen等（1986）首次报道了斑节对虾卵巢、心脏、心肌、肌肉、神经、肠道、肝胰腺和鳃等组织的体外培养，发现仅前两种组织可生长繁殖，并将卵巢组织细胞传至第三代。Hsu 等（1995）对斑节对虾Oka器官（淋巴组织）组织细胞的各种培养条件进行了全面地研究，并建立了世界上第一个对虾细胞株。这是对虾组织培养研究工作的一个重大突破。

发展对虾组织培养技术，不仅对深入研究对虾病毒提供了方便，而且也为对虾免疫学、遗传学、细胞工程学等方面研究提供了有利条件。由于目前还没有控制对虾病毒病的有效药物，可利用组织培养筛选抗病毒药物。利用对虾组织培养还可以制备病毒疫苗及为核酸探针检测病毒提供条件。

六）CID50病毒滴定法（50% Tissue Culture Infectous Dose Assay）

Lu等（1995）应用T CID50来测定YBV的感染滴度，被感染组织为用96孔组织培养板培养的虾淋巴器官细胞，测定YBV感染的虾的鳃匀浆液，其病毒滴度为5.10（5.75）CID50/ml。这是首次报道的测定虾病毒浓度的检测手段。

分子生物学技术极大地推动了生物学科的发展。由于分子生物技术的不断发展和完善，分子生物学更加迅速广泛地渗透到生命科学的各个学科。分子生物学技术具有高度的特异性和高度的灵敏性等特点，为对虾病毒病的诊断和病毒的检测提供了新的手段。

七）聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）

PCR是1983年由美国Mullis首先发现的。它是一种体外核酸扩增系统，在模板DNA，引物（模板片段两端的已知系列）和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，依靠TaqDNA聚合酶的催化，由高温变性，低温退火及适温延伸三个步骤组成一个周期，循环进行使模板DNA 得以扩增。Erlich等（1988）和Ost（1988）就把PCR作为诊断病原体最有效的技术。Brock （1992）和Lightner等（1992）用PCR来检测对虾的有关病毒。

Chang 等（1993）利用PCR 技术对斑节对虾杆状病毒（MBV）纯化和扩增。这是首次成功地利用PCR技术进行对虾病毒的DNA扩增。何建国等（1996）用PCR技术检测斑节对虾的白斑综合杆状病毒（WSSV），并结合电镜观察证实红体病斑节对虾（不带白斑者）不是WSSV 所致。Kimura等（1996）用两对PCR引物（P1/P2和P3/P4）检测了日本对虾的杆状病毒（RV-PJ）。套式PCR在蟹（Helice tridens）、昆虫（Ephydridae）和桡足类（Schmackeria dubia）检测到有WSSV。杨丰等（1995）用PCR方法进行所分离的斑节对虾杆状病毒（MBV）包含体的鉴定，结果很理想。Wang等（1996）用PCR方法检测对虾中BP病毒，并获得了预计的扩增产物。郭福生等（1996）根据昆虫杆状病毒多角体基因保守片段设计引物，用PCR 对数百分养殖中国对虾虾卵、幼虾、成虾、5种海捕虾与养殖有关的媒介饵料——桡足类、钩虾、蓝蛤、小杂蟹、底泥等进行了杆状病毒检测。

八）原位杂交（In situ hybridization）

原位杂交是利用放射性或非放射性标记的已知序列DNA和RNA探针，在细胞或染色体上与其互补的核酸序列配对杂交，再经放射自显影或免疫荧光、化学发光，在杂交原位上显示杂交体的技术。Bruce等（1993）用原位杂交的技术检测对虾的杆状病毒。Poulos等（1994）用非放射性标记的DNA探针来检测斑节对虾的杆状病毒（MBV）。Mari等（1995）将HPV的DNA基因部分克隆，经内切酶消化得一个2.3kbp的片段，构建2个不同的Dig-I-IdUTP标记的探针，进行肝胰腺石蜡切片原位杂交，能与感染组织反应。探针在细胞核中产生强烈标记。严重感染的肝胰腺，细胞碎片与探针紧密结合，还可以在上皮细胞表面形成微小突起。Mari等（1993）抽提Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus（IHHNV）的核酸而得到少量dsDNA，克隆到Puc18，经过限制性内切酶分析。其中一个克隆，BQ31，用来构建不同大小的DiG-IIdUTP标记的探针。在原位杂交中，探针使靶细胞形成显著性标记，特别是核内Cowdry A型包含体。Arimoto等（1995）将中肠腺坏死杆状病毒（Baculoviral

midgut gland necrosis type viruses，BMHV）基因组DNA的部分BamhI酶切片段克隆。用P-32-CTP标记制成探针，从而检测病虾的BMNV。结果证明脊尾白虾（

Exopalaemon carinicauda）在养殖对虾暴发性流行病学上具有重要意义。Wongteerasupay等（1996）在患有白斑病的六种对虾原位杂交中，Penaeus mondon baculovirus PmNOBII的DNA片段呈阳性杂交。

九）点杂交（Dot-blot hybridization）

点杂交是将PCR产物固定到尼龙膜上或硝酸纤维素滤膜上，用标记的与产物内部部分或全长核苷酸系列互补的探针进行点杂交，将未杂交的探针洗掉，通过杂交斑点的放射自显影，估计与样品核酸杂交的量。根据放射性映象的强度确定每一斑点的探针浓度，并同一系列对照作比较以确定核酸的浓度。

Wongteerasupay等（1996）用点杂交方法证明pmNOBII不与BP探针、IHHNV-DNA探针和MBV探针杂交。Lo等（1996）用巢式PCR检测虾、蟹和其他节肢动物是否含WSSV时，在one-step PCR后，再用点杂交方法验证PCR产物。核酸扩增后再进行探针杂交实验，将是直接检测对虾病毒最敏感的方法。

许多分子生物学技术都可以用来检测对虾的病毒，例如PTPCR等方法。采用分子生物学技术检测对虾病毒，虽然仪器费用和操作技术要求高，但是灵敏度高和特异性高。随着分子生物学技术不断的发展和完善，把它作为一种检测对虾病毒手段将会得到越来越普遍的使用。

第五节对虾的病毒性疾病的防治

引起对虾大规模死亡的病害主要是病毒病，下面介绍几种主要的病毒病但目前还没有特效的治疗方法，主要以防为主，预防方法参照本章第二节的步骤进行。

一、对虾杆状病毒

对虾杆状病毒（简称BP）是在甲壳动物中发现最早的一种病毒。BP呈杆状，由囊膜和核衣壳组成，在宿主细胞核中形成可有多达100个大小不一的包含体。

对虾杆状病毒感染肝胰腺和中肠上皮细胞核。BP对幼体的危害大，有发病急、死亡率高的特点，从无节幼体和糠虾幼体开始，糠虾期最为严重，累积死亡率达90%以上。到PL-5期死亡率迅速下降，此时一般为亚急性或慢性发病，患病虾摄食量减少，生长慢及体表和鳃的附着物增多。放养密度过高时，无论急性还是慢性病，都将造成对虾大量死亡。

二、斑节对虾杆状病毒

斑节对虾杆状病毒（简称MBV），最具代表性的有效种宿主是斑节对虾。

MBV主要感染肝胰腺和前中肠的上皮细胞核。MBV最先出现在蚤状幼体Ⅱ期和糠虾幼体期，主要致死阶段在仔虾期，致死率可达90%以上，成虾可能带毒，甚至感染程度严重，但只要养殖环境好，则对MBV感染耐受力强。MBV感染会引起摄食量减少、生长慢及体表和鳃的附着物增多，严重感染时，腺管大面积破坏或并发细菌感染，干扰和破坏宿主的消化与吸收功能，造成宿主大量死亡。另外，MBV感染还是造成斑节对虾“公孙虾”现象的原因之一。

三、中肠腺坏死杆状病毒

中肠腺坏死杆状病毒（简称BMNV）。BMNV主要感染肝胰腺和中肠上皮细胞核。BMNV对幼体危害大，也有发病急、死亡率高的特点，从无节幼体Ⅱ期和糠虾期开始，仔虾第9、10期最严重，累积死亡率达98

﹪，第20期的仔虾死亡率迅速下降。染病虾苗通过腹部可见肝胰腺和中肠腺变白混浊，同时可能有革兰氏阴性菌并发感染，其对成虾的危害相对较小。

四、肝胰腺细小病毒

肝胰腺细小病毒（简称HPV）是1983年我国在中国对虾中发现的第1种病毒。

HPV主要感染肝胰腺和前中肠腺的上皮细胞核。其外部症状不特异，严重感染时，肝胰腺变白混浊，生长慢，厌食，体表和腮的附着物多，腹部肌肉混浊，易被弧菌或索兰氏镰刀菌等条件至病菌继发感染。HPV很少单独引起虾的高死亡率。相对于成虾来说，对幼虾的影响更大。

以上4种肠感染病毒有相似之处，在于它们对对虾早期生活阶段致死率高，而对成虾的影响相对较小。

五、传染性皮下及造血组织坏死病毒

传染性皮下及造血组织坏死病毒（简称IHHNV）主要感染外胚层组织如鳃、表皮、前后肠上皮细胞、神经索和神经节，以及中胚层器官如造血组织、触角腺、性腺、淋巴器官、结缔组织和横纹肌写的宿主细胞核。成虾对其有耐受性，但如养殖条件恶化也会致死。患急性IHHNV的幼虾厌食，表皮上皮出现白色或淡黄色斑点，濒死的斑节对虾明显变蓝，腹部肌肉混浊，行为上它们会在池中慢慢升起，静止一会儿翻滚，接着腹面朝上沉入池底，几小时内重复此过程知道筋疲力尽或被其它健康的虾吃掉。而在南美白对虾中常表现为典型的慢性病，所以又称畸形发育不良综合症（RDS），病虾额剑变形弯曲，触角鞭节起皱，表皮粗糙，生长慢，处于慢性消耗状态，导致个体小畸形。

十、黄头病毒

黄头病毒简称YHV，斑节对虾YHV症状特异，幼虾（生长50～70天）几天内摄食率骤增，1天内完全停止摄食，第3天大量死亡，全池覆没。濒死虾通体苍白，头胸部黄色肿大，鳃由白到淡黄到棕色，肝胰腺变为淡黄色，所以有“黄头病”之称。

YHV危害极大，在泰国和台湾地区的养殖斑节对虾中引起严重虾疫，印度尼西亚、马来西亚、中国大陆、密西西比斑节对虾也遭受严重打击。YHV可感染斑节对虾。刀额新对虾和墨吉明对虾对YHV在池中有抗性。

十一、桃拉综合症病毒（简称TSV）

南美白对虾从仔虾第1～14期到将入池时易发生TSV，因此，带TSV的虾一般在0.05～5 g之间，更大的虾也可能感染。可将其区分为急性发病期和恢复(或慢性发病)期。在急性发病期，濒死虾全身淡棕红，尾扇和后足明显发红(因此又称“红尾病”)，一般在蜕皮时死亡，暗示蜕皮对其发病机现的重要性，典型壳软，空肠，几乎全体表、所有附器、鳃、胃、后肠、食管的表皮上皮多病灶坏死。而在恢复(慢性发病)期，病虾举止与摄食和正常虾一样。养殖虾累积死亡率80%～95%，而其幸存者存活率有的可达60%或更高。

十二、白斑综合症病毒(简称WSSV)

白斑综合症病毒至少有4个种株，它们是：①皮下及造血组织坏死杆状病毒，在中国对虾中发现，以称中国病毒，引起对虾暴发性流行病；②日本对虾杆状核病毒；③系统性外胚层和中胚层杆状病毒，在斑节对虾中发现，导致红体病或白斑病；④白斑杆状病毒。

WSSV引起系统感染，主要感染真皮、前后肠上皮、造血组织、结缔组织、鳃、触角腺、血细胞、神经和横纹肌等。急性感染引起虾摄食量骤减，头胸甲与腹节甲壳易于被揭开而不粘着真皮，甲壳上可见十分明显的直径为0.5～2 mm的白斑，可能是表皮非正常Ca2+盐的沉积。在许多病例中，WSSV濒死虾显示出通体淡红色到棕红色(因此又名“红体病”)，可能由于表皮色素细胞扩散所致，有些也有少量白斑。WSSV毒力较强，起始症状出现3～10天内累积死亡率达100%。

WSSV的控制是一个系统而复杂的工程，涉及的方面很多。随着对WSSV流行病的认识的加深和新技术的发展，对WSSV的控制措施的操作性也逐渐加强。总体上来说WSSV的控制采取以“预防为主，治疗为辅”的方针。

1 消除生产中垂直传播的传染源

WSSV垂直传播的传染源是携带WSSV的亲虾。目前已有众多分子生物学方法，如PCR、核酸探针和免疫学方法，如单克隆抗体和多克隆抗体技术检测WSSV，这些方法敏感性高、特异性强，因而在亲虾选育中可采用这些方法选育没有携带WSSV的虾作为亲虾，从而切断WSSV的垂直传播途径，但在实际操作过程中，因不同种类虾而有所不同。除此之外，建立无WSSV对虾品种，这在我国大陆已能进行全人工繁殖的对虾品种中是可行的，如中国明对虾、日本囊对虾、凡纳滨对虾等，而对于南方主要养殖品种之一的斑节对虾目前尚无法实现。主要原因是斑节对虾在我国尚没有用于生产的大规模的全人工繁殖技术，因而无法建立无WSSV品系，因而急需加强开展斑节对虾全人工繁殖的攻关研究。消除WSSV垂直传播传染源的另一种方法是建立抗WSSV的品种，由于WSSV弱毒株的产生和WSSV总体上致病力有所下降，从而为建立抗WSSV的对虾品种成为可能（何建国等，2001）。

2 切断WSSV垂直传播的传染途径

育苗期仔虾的WSSV检测是目前切断WSSV进入对虾养殖期的主要手段。世界上多采用PCR检测法，一般为套式PCR法，也有用核酸探针的检测方法和单克隆抗体的检测方法。虽然上述WSSV的检测方法在国内都有应用，但普及率比较低，同时，由于检测育苗期仔虾数量的局限性，无法完全准确地判断一批数量较大的虾苗是否完全携带WSSV的仔虾，因而在一些国家也是常用的对虾苗检测和选购参考的手段。

3 消除WSSV的水平传播的传染源和传播途径

WSSV的宿主种类多，已发现和确定的有近40种，每一个种类在WSSV的水平传播的传染源。在WSSV暴发流行初始阶段，主要是受WSSV保存宿主的影响，已知的保存宿主为养殖的对虾野生的东方白虾、长臂虾、日本樱虾等和大量的蟹类。因而，在清塘时一定要将上述几种生物消除掉。何建国等（1999a）在上万亩虾场的实验结果，上述消除水平传播传染源的措施起到较好的养殖效果。与此同时，要切断对虾养殖过程中的WSSV的水平传播途径，在虾塘进水口安装过滤网，由虾塘内至外的滤网分别为60、40、20目绢网，这样既可以不影响进排水，又可以防止较大型生物进入养殖池中，从而减少了WSSV的传播。经对虾养殖实践，效果还是比较理想。

4加强水质的监控

从WSSV潜伏感染到急性感染，一方面与对虾个体大小有关，而另一个重要方面是受水体理化因子和大的气候影响，这方面的研究可以通过MBV与理化因子的关系得到佐证。因而水质的监控在养殖过程中至关重要。日常监测指标应包括盐度、pH、温度、S2-、NH3-N、NO-2-N 等。温度是病毒暴发流行的前提条件之一。也是在养殖过程中目前较难控制的因素。对斑节对虾个体MBV病毒感染度与水体理化因子的关系研究揭示：

Y=-12.089＋1.216X1＋2.734X2＋0.258X3

式中，Y为病毒感染度；X1为盐度；X2为氨氮（μg·L-1）；X3为硝酸氨（μg·L-1）。养殖对虾在低盐、低氨氮、低亚硝酸氮的条件下，对虾个体内潜伏病毒数量会减少，而不易暴发病毒病。为防病应提倡低盐度养殖对虾。同时，通过增加氧气、改善水质，减少氨氮和亚硝酸氮。本式是一个简化公式，去除了pH与氨氮协同作用，促进氨氮毒性增强，故阴天、雨后、台风过后，水体pH的调节至关重要，一般1 d内pH相差不超过0.5，如超过0.5则应立即调节。通过上述措施的处理，减少WSSV的暴发流行。

5 采用低盐度和增氧方法养殖。从抗WSSV来看，凡纳滨对虾养殖最适宜盐度为10-20