梭菌检测方法
梭菌检测
• 用手指，指压培养基和样本液，好好混释。将厌氧袋放在固定架 子上，让它凝固。
• 培养基凝固后，为避免空气的进入，用热封口机将上面封口。 • 35±2.0℃,24±2小时培养。
• 培养完成后，将厌氧袋拿出来，观察袋内的菌落，测量菌落数。
梭菌检测
梭菌属介绍
• 芽孢杆菌科的1属。是能形成芽孢、厌氧生长的革兰氏染色阳性大 杆菌。因芽孢常比菌体大，致使菌体呈梭状而得名。又称厌氧芽 孢杆菌属。是食品卫生不可忽视的存在。
• 常见致病厌氧芽孢梭菌主要有破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒 梭菌和艰难梭菌等，因此，将梭菌属作为厌氧性的食物中毒或品 质劣化的指标而作为检测对象。引起食品中毒的食品，一般被怀 疑有肉毒梭菌或产气荚膜梭菌的污染，如确实是由它们污染的， 从保存性的角度，也会判断不合适。
• 取出已灭菌的吸管要从尖端10cm左右的地方1-2次往回火焰灭菌， 但火焰灭菌不可太长。
• 从锥形瓶和试管移取样液前后，瓶口和管口要过火焰灭菌。
• 需用到剪刀等其他用具时要先用75%酒精棉擦拭，再将其尖端用 火焰灭菌。
• 培养后的样本，不要接触人体或者漏出，进行高压灭菌处理。
• 肉毒梭菌广泛存在于自然界，引起中毒的食品有腊肠、火腿、鱼 及鱼制品和罐头食品等。在美国以罐头发生中毒较多，日本以鱼 制品较多，在我国主要以发酵食品有关，如臭豆腐、豆瓣酱、面 酱、豆豉等。其它也引起中毒的食品还有：熏制未去内脏的鱼、 填馅茄子、油浸大蒜、烤土豆、炒洋葱、蜂蜜制品等。
封口 ↓
培养 ↓
计数各厌氧袋菌落数 ↓
计算菌落总数 ↓
报告
操作步骤
• 称取 12.5 g样品置盛有 225 mL已灭菌的0.85%生理盐水的无菌 锥形瓶内，振荡均匀，倒入带过滤的无菌袋，制成1:20的样品匀 液。
难辨梭菌感染检测_胡云建
比毒素酶免疫方法更敏感， 劳动密集型; 需要特殊设备，24-48小 生物活性毒素 时得出最终检测结果
快速，敏感
特异性较差，需要进一步测试来确定诊 断，不是100%敏感。 费用高，需要特殊设备，可能‘过于’ 敏感 确认毒素产生，劳力密集型，需要4896小时出结果
快速，敏感，检测毒素基 因的存在 操作合适的情况下 是最敏感的方法
/web/HPAweb&HPAwebStanda rd/HPAweb_C/1272032580726
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美国难辨梭菌感染流行率和住院率
美国，难辨梭菌流行率 自1996年以来上升3倍
(McDonald, EID 2006)
美国，难辨梭菌导致的住院率 1997-2007上升4倍
诊断文献解读的误区
• 临床数据的缺乏
– 难辨梭菌的检测，不等同于难辨梭菌感染的诊断 • 无症状的细菌定植比感染更普遍 • 难辨梭菌细菌检测的敏感度提高，可能降低了难辨 梭菌感染的特异度
Peterson, CID. 2007
敏感性提升降低了检测的特异性
• 即便是按照临床金标准临 床显著的腹泻:
– 对敏感性没有影响 – 核酸扩增PCR检测的特异性 下降，从~98% 到 ~89% (p < 0.01)
临床表现: 水样便 (3次> 天) 伴: 发热 胃纳#43;频率〉3次/天 • 感染性腹泻：病原微生物引起，以腹泻为主要特征的一组肠 道传染病，通常伴随恶心、呕吐、或腹痛 • 按照病生理分为：吸收不良性腹泻，分泌性腹泻，侵袭性腹 泻和抗生素相关性腹泻
难辨梭菌 感染患者
无症状 难辨梭菌定植
无难辨梭 菌定植 其他环境表面 呼叫按钮 床把手 病房桌子 电话
难辨梭菌 感染患者
3种不同方法检测艰难梭菌芽孢率的比较
结
、
果
３种 不 同 方 法 检 测艰 难 梭 菌 芽 孢 率 结 果
比较
Ａ Ｔ Ｃ Ｃ ４ ３ ５ ９ ６ 、 Ｖ Ｉ Ｐ １ ０ ４ ６ ３培养 ９ ６ ｈ ， 用平板涂 布
法检测 芽孢 率最 高 （ 平 均 检 出率 为 ２ ５ ． ３ ％、 １ ５ ． ６ ％） ， 培养 １ ２ ０ ｈ（ 平 均 检 出率 为 ４ ３ ． ０ ％、 ３ ５ ． ４ ％） ， 但变异 较大 ； 相差 显微 镜计 数 法 （ 平 均 检 出率 为１ ３ ． ３ ％、 ９ ． ４ ％） ， 培养 １ ２ ０ ｈ （ 平 均 检 出率 为 ３ ５ ． ０ ％、 ２ ７ ． ８ ％） 和孔 雀绿 染 色 法 （ 平 均 检 出 率 为 １ ３ ． ４ ％、 ９ ． ８ ％） ， 培养 １ ２ ０ ｈ （ 平均 检 出率 为３ ２ ． ７ ％、 ２ ８ ． ２ ％） 结果相 近且变异较小 ， 结 果见表 １ 。
（ ａ ： 营养 细 胞 和 芽 孢 ） ； 另一管 ６ ５ ｑ Ｃ 水浴 ２ ０ ｍｉ ｎ 以杀死 营养 细 胞 ， 再 用 生理盐 水进 行 系列稀 释 ， 取
伪膜 性肠 炎 都 是 由艰 难 梭 菌 所 致 ¨ 。芽 孢 是 艰 难梭 菌 传 播 的主 要形 式 ， 具 有感 染 性 ， 耐热 、 耐干
２ ．培养 基 和试 剂 Ｂ ｍｅ ｅ ｌ ｌ ａ琼 脂 和厌 氧发 生
袋为美 国 Ｂ Ｂ Ｌ Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ Ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ ｓ 公 司产品 ； 血
个小区即 ４ ８个 视 野 进行 计 数 。取 １ Ｏ Ｌ加 入产
芽 孢 率 ：芽 孢 数／ （ 芽 孢 数 ＋营 养 细 胞 数 ）×
破伤风梭菌实验室检查与防治原则
破伤风梭菌实验室检查与防治原则破伤风梭菌是一种产生破伤风毒素的革兰氏阳性杆菌，能够引起严重的神经系统疾病和肌肉紧张。
由于破伤风梭菌的高致病性和传染性，破伤风梭菌实验室检查成为预防和控制破伤风感染的关键。
一、实验室检查破伤风梭菌的实验室检查主要包括样本采集、细菌培养、鉴定和药敏试验等环节。
1. 样本采集样本采集是破伤风梭菌实验室检查的第一步。
破伤风梭菌存在于破伤风感染患者的伤口、口腔、呼吸道分泌物等处，因此采集样本的方法应根据感染部位而定。
常用的样本包括伤口分泌物、口腔分泌物、喉咙分泌物、鼻咽分泌物、尿液、粪便和脑脊液等。
2. 细菌培养细菌培养是检测破伤风梭菌存在与否的关键环节。
常用的培养基包括牛肉肉汤培养基、脑心素培养基和血清肉汤培养基等。
在培养基中，破伤风梭菌呈现革兰氏阳性、梭形杆菌或短小离散的杆菌。
同时，破伤风梭菌对氧气敏感，必须在厌氧条件下培养。
3. 鉴定鉴定是确认破伤风梭菌的特征和产生破伤风毒素的方法。
常用的鉴定方法包括菌落形态、革兰染色、各种代谢检测和免疫学检测。
其中最常用的方法是四石田反应和ELISA酶联免疫吸附检测。
4. 药敏试验破伤风梭菌对各种抗生素的敏感性不同。
药敏试验是确定破伤风梭菌对某种抗生素敏感性的方法。
药敏试验的结果可以指导临床治疗的选择和预防措施的制定。
二、防治原则预防破伤风感染的发生是防治措施的重要环节。
常见的措施包括疫苗接种、伤口和创口处理、抗生素治疗和隔离等。
1. 疫苗接种破伤风疫苗是预防破伤风感染最有效的措施。
目前市场上常用的破伤风疫苗包括破伤风类毒素疫苗和破伤风类毒素和肉毒杆菌类毒素联合疫苗。
接种破伤风疫苗可以增强人体免疫力，有效预防破伤风感染的发生。
2. 伤口和创口处理伤口和创口处理是预防破伤风感染的关键措施。
在处理伤口和创口时，应注意切勿用手直接接触伤口和创口，应用消毒液和消毒纱布清洗和包扎。
同时，应避免伤口和创口受到污染，及时更换包扎。
3. 抗生素治疗抗生素治疗是破伤风感染的根本措施之一。
产气荚膜梭菌 国标检测方法
产气荚膜梭菌国标检测方法
《产气荚膜梭菌国标检测方法》
产气荚膜梭菌是一种在自然界中广泛分布的细菌，在土壤、水体和动植物表面等环境中都可能存在，同时也是人和动物的肠道正常菌群。
然而，产气荚膜梭菌也会引起食物中毒，对人体健康造成威胁。
因此，及时、准确地检测产气荚膜梭菌成为了食品安全监管的重要内容之一。
为了规范产气荚膜梭菌的国家标准检测方法，中国国家标准化管理委员会发布了《食品安全国家标准食品微生物检验鲜肉和肉制品、水产品及蛋品中产气荚膜梭菌检验》（GB 4789.9-2016）。
该标准规定了在食品中产气荚膜梭菌的检测方法及技术要求，其内容包括了样品制备、检测方法、结果判读和报告等方面。
在该标准中，样品制备包括了样品采集、致病菌分离培养和纯化等步骤；检测方法主要采用分子生物学技术和培养方法相结合的策略；结果判读则依据标准规定的指标和标准质控程序进行判定；报告部分则要求对检测结果进行详细的描述和解释。
此外，随着检测技术的不断更新和完善，国家标准化管理委员会也会不断修订和完善相关标准，以确保检测方法的准确性和适用性。
同时，食品生产企业也应当严格按照国家标准要求，对生产过程中的食品样品进行产气荚膜梭菌的检测，以保障食品的安全和质量。
总之，《产气荚膜梭菌国标检测方法》作为国家标准的一部分，对食品安全监管起着重要的作用，通过该标准的执行，可以有效避免食品中产气荚膜梭菌的污染，保障食品安全，保护消费者的健康。
3 种检测艰难梭菌方法的临床应用评估
3 种检测艰难梭菌方法的临床应用评估章黎华;李贞;江岑;万颖蕾;彭奕冰【期刊名称】《微生物与感染》【年(卷),期】2016(011)001【摘要】本研究旨在对3种检测粪便样本中艰难梭菌的方法进行临床应用评估 ,为艰难梭菌的实验室检测提供参考.采用艰难梭菌毒素A/B(Clostridium difficile toxins A and B ,CDAB)酶联免疫荧光检测法、环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂(cycloserin-cefoxitin-fructose agar ,CCFA)常规培养法和显色培养法(chromIDTM )同步检测粪便样本中的艰难梭菌 ,并对培养所得菌株进行 tcdB基因扩增以验证其产毒性.以艰难梭菌培养联合 tcdB基因扩增为参考方法 ,分别计算上述3种方法的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值等参数 ,分析其与参考方法的一致性.研究共收集临床粪便样本164份 ,参考方法检测结果为58份阳性 ,106份阴性.经统计分析 ,艰难梭菌毒素 A/B法的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为51 .7% 、95 .3% 、85 .7% 和78 .3% ,CCFA常规培养法分别为72 .4% 、98 .1% 、95 .5% 和86 .7% ,而艰难梭菌显色培养法分别为94 .8% 、92 .5% 、87 .3% 和97 .0% .3种方法中 ,艰难梭菌显色培养法与参考方法的一致性最高(Kappa=0 .856 ).采用该方法检测粪便样本中的艰难梭菌操作简便 ,成本经济 ,结果判断直观、准确 ,具有较好的临床应用价值.【总页数】4页(P24-27)【作者】章黎华;李贞;江岑;万颖蕾;彭奕冰【作者单位】上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科 ,上海 200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科 ,上海 200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科 ,上海 200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科 ,上海 200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科 ,上海 200025【正文语种】中文【相关文献】1.3种不同方法检测艰难梭菌芽孢率的比较 [J], 徐蓉;葛平;陈蓉;刘学杰2.RPR、ELISA、TP-HA三种方法检测梅毒抗体的临床应用评估 [J], 马荣;李晓兰;赵成艳3.2种艰难梭菌感染检测方法的比较与分析 [J], 孔建新;蔡心安4.3种艰难梭菌感染检测方法的比较 [J], 王丽志;陈丽丹;肖斌;甘燕玲;李林海;王前5.五种艰难梭菌检测方法性能评估 [J], 伍众文;郭鹏豪;陈怡丽;魏斯琪;廖康因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
产气荚膜梭菌多重PCR检测方法的建立及其噬菌体裂解酶在真核系统中的表达
产气荚膜梭菌多重PCR检测方法的建立及其噬菌体裂解酶在真核系统中的表达为了建立产气荚膜梭菌多重PCR检测方法，我们起首收集了多个菌株的DNA样本，包括来自不同环境和不同宿主的产气荚膜梭菌。
接着，通过PCR扩增产气荚膜梭菌的16S rRNA基因和alpha toxin编码基因，以确保所构建的多重PCR检测方法能够准确地检测出产气荚膜梭菌。
为了验证所建立的多重PCR检测方法的准确性和特异性，我们进一步进行了菌落PCR和筛选PCR。
通过菌落PCR，我们将多个菌落的DNA样本分别扩增并用电泳检测，发现这些菌落中有一部分可以被我们所建立的多重PCR检测方法检测到。
而筛选PCR则进一步确认了多重PCR检测方法的特异性，因为在筛选PCR中，产气荚膜梭菌菌落DNA样本中的目标基因序列会扩增出一个特定大小的片段，而其他厌氧革兰阳性菌的DNA样本则没有这个片段扩增。
此外，我们还进行了一系列试验来探究产气荚膜梭菌的噬菌体裂解酶在真核系统中的表达状况。
通过真核细胞的共培育试验，我们发现经过产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶处理后的真核细胞出现了明显的溶解现象。
进一步通过Western blotting试验发现，经过噬菌体裂解酶处理后，真核细胞中的细胞裂解相关蛋白发生了明显变化，确认了噬菌体裂解酶在真核系统中的表达对于真核细胞的溶解具有重要作用。
总的来说，本探究成功建立了一种能够检测产气荚膜梭菌的多重PCR检测方法，并探究了产气荚膜梭菌的噬菌体裂解酶在真核系统中的表达状况。
这些探究结果对于了解产气荚膜梭菌的感染机制以及开发相关的治疗方法具有重要意义。
此外，本探究所建立的多重PCR检测方法也可应用于产气荚膜梭菌的疫情监测和环境检测等领域，为相关的疾病预防和控制提供了有力的工具综上所述，本探究成功建立了一种能够检测产气荚膜梭菌的多重PCR检测方法，并探究了产气荚膜梭菌的噬菌体裂解酶在真核系统中的表达状况。
这些探究结果对于了解产气荚膜梭菌的感染机制以及开发相关的治疗方法具有重要意义。
应用气相色谱法鉴定艰难梭菌
材料与方法
仪器 型气相色谱仪 四川分析仪器厂 岛津
数据处理机 厌氧罐等∀
色谱条件
选用长 内径为
的不锈钢色谱柱 填
充∗
目上海试剂厂 白色担体加
固定液为 改性聚乙二醇
采用
氢火焰检测器 氮气作载气 载气流速
Ù色
谱柱柱温 ε 汽化室温度 ε 检测室温度
ε 桥电流为
∀
试剂和培养基
乙醚
氯仿
关键词 气相色谱法 艰难梭菌
分类号
Ù
前言
应用气相色谱法检测细菌的终末代谢产物 作 为细菌的一种快速诊断的方法 国外文献早有报 道∗ ∀
我 们 应 用 此 法 鉴 定 艰 难 梭 菌 Χλοστριδ ιυ δ ιφ φ ιχιλε 的 株临床分离株和 株对照参考株 分 析它们的脂肪酸代谢产物的气相色谱图 发现它们 的色谱图非常相似 均出现乙酸 异丁酸 丁酸 异戊 酸 异己酸 丙酸 戊酸峰 其中乙酸 丁酸 异己酸峰 较高 其次为异丁酸 异戊酸峰 而丙酸峰和戊酸则 较低 结果与国外报道一致 ∀
色
均较多 而异丁酸
异戊酸
戊酸 的含量
较少 丙酸的含量则甚微∀ 其中异己酸的含量最多∀
在
时 株艰难梭菌的色谱图中均出现
一个低平的色谱峰 此峰与
等 报道的 甲
苯 酚峰相似∀
等认为 甲 苯 酚峰 己酸峰
的高低及是否出现与培养基有关 也与加入的标本
量有关∀
艰难梭菌是引起抗生素伪膜性肠炎的主要病原
菌之一 临床分离鉴定此菌按常规方法较费时费力
盛入带玻塞的试管内 加
三氟
化硼甲醇液 混匀 塞紧玻塞 置室温下过夜 反应完
毕后 再加入 ∗
氯仿 振摇提取∀
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梭菌检测Clostridium
test
培养基及耗材名称
培养基及耗材名称
液体流乙醇酸盐培养基FTG
疱肉培养基基础
含铁牛奶培养基
疱肉牛肉粒
乳糖-明胶培养基
缓冲动力硝酸盐
厌氧罐
厌氧产气袋
液体石蜡
产气荚膜梭菌检测（Clostridium perfringens test）
检验流程图
检测步骤-样品接种
高压灭菌好疱肉培养基混匀好样品取约0.5g样品接种到培养基
检测步骤-水浴煮沸
高压灭菌好液体石蜡倒入约2ml液体石蜡封口放入80度水浴煮沸20min
检测步骤-培养
放入厌氧产气袋
放入37度培养48h
挑取可疑菌落
接种到新鲜的血液琼脂
挑取纯化后菌落 接种到FTG 肉汤 FTG 肉汤37度培养18-24h
检测步骤-牛奶爆裂试验 吸取1mlFTG 增菌液1mlFTG 增菌液加入到牛奶培养基中
46度水浴培养
6h
阳性使牛奶产生爆裂
检测步骤-硝酸盐和明胶液化试验
挑取单菌落
挑取单菌落
接种到生化培养基中 37度培养18-24h滴入显色剂观察
检测步骤-结果观察
阳性反应：上层液面显示红色
阳性反应：放入4度冰箱不凝固。