(蓝白斑筛选) lacZ - β-半乳糖苷酶
蓝白斑筛选的原理及方法
蓝白斑筛选的原理及方法载体pGEMZ在俟半乳糖苷酶（lacZ ）的a肽编码区内具有多克隆区域。
在重组质粒中插入片段使a-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。
不带有插入片段的载体，表达有功能的禺半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉lacZM15基因，导致内源a-肽失活。
载体pGEMZ或其它含lacZ基因的a-肽互补细菌，具有俟半乳糖苷酶的3片段，所得功能俟半乳糖苷酶（a- 肽加3片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。
在载体pGEMZ 的多克隆区域，克隆上插入片段导致a-肽编码区的破坏，使俟半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。
a-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落，因俟半乳糖苷酶只是部分失活。
重组质粒转化到合适的菌株中（JM109 ，DH5a ），然后涂布到含0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal 指示平板上。
可将50ul 的X-Gal 和100 ulIPTG 贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在37oC 保温30 分钟使液体扩散。
IPTG 溶于水中，贮液浓度为100mM ,X- Gal溶于DMF，贮液浓度为50mg/ml 。
IPTG 和X- Gal 需分装后保存在-20 oC ，可保存2-4 个月。
IPTG 即Isopropyl B -D-1-thiogalactopyra no side ，也称Isopropyl B-D-thiogalactoside ，中文名为异丙基-B -D-硫代半乳糖苷。
分子式为C9H18O5S 分子量为238.30, CASNumber367-93-1，Ultra Pure, dioxane free，纯度＞99.6%。
我公司提供Merck 公司该产品。
.本产品为接近白色的粉末常用分子生物学试剂，常用于蓝白斑筛选及IPTG 诱导的细菌内的蛋白表达等。
IPTG是B -半乳糖苷酶的活性诱导物质。
基于这个特性，当pUC系列的载体DNA或其他带有lacZ基因载体DNA以lacZ缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体的载体DNA1行转染时，如果在平板培养基中加入X- Gal和IPTG,由于B -半乳糖苷酶的a -互补性，可以根据是否呈现白色菌落（或噬菌斑）而方便地挑选出基因重组体。
蓝白斑筛选的原理
蓝白斑筛选的原理一、蓝白斑的神奇“变色术”大家知道吗，蓝白斑其实就像是大自然中的一场魔术表演，别看它们貌不惊人，却能帮我们解决不少难题。
你有没有想过，为什么有些细菌能够变成蓝色，或者白色，甚至在你不小心“挑错”了的瞬间，就像是“拔得头筹”一样暴露出来？这其中可大有玄机。
蓝白斑筛选的原理，说白了就是通过细菌的颜色变化来区分哪些细菌完成了任务，哪些没有。
想象一下，你参加一个比赛，规则是“谁先完成任务，谁就能变成蓝色”。
你在想啥呢？当然是完成任务的那一方啦！话说回来，这个蓝白斑的过程其实是根据细菌是否能够分解特定的物质来判断的。
你知道吗？一些细菌能通过产生某种酶来分解含有特定物质的化合物，分解后就会发生化学反应，结果就是变色。
你仔细观察，变成蓝色的细菌就是“完成任务”的那一方，它们已经成功地分解了化合物；而那些保持白色的细菌呢？嗯，通常是没完成任务的。
咋样，这个“筛选法”简直就像是考试，谁考得好谁就“变色”！二、筛选的“大功臣”——β半乳糖苷酶说到蓝白斑筛选的核心原理，咱们不得不提一提β半乳糖苷酶（这个名字一听就有点儿高大上，是吧？别担心，听我说完你就明白了）。
简单来说，这个酶就像是“钥匙”，它能打开某些特定“门”，从而使得细菌在某些条件下变色。
比如我们常常看到的那种蓝白斑筛选系统，它就是通过这个酶来检测细菌的“作业完成情况”的。
怎么样，听起来是不是有点像个“检察官”，专门检查细菌是否履行了自己的职责？咱们平时用的就是这么个系统：比如说你要插入一个外源基因到细菌里，然后通过检测这个β半乳糖苷酶的活动情况，来判断哪个细菌成功拿到了“基因”，哪个没有。
要是基因插入成功，β半乳糖苷酶就开始起作用，细菌变成了蓝色；如果没有插入，那酶就不活动，细菌还是白的。
看，这是不是挺酷的？就像是侦探破案，蓝色细菌就是犯罪嫌疑人，白色的呢，可能是“路人甲”。
三、实际应用：用蓝白斑来找“真凶”说到实际应用，蓝白斑筛选可真是生动又实用，简直是实验室里的小英雄。
蓝白斑筛选重组子原理
蓝白斑筛选重组子原理
蓝白斑筛选重组子是一种常用的分子生物学技术，用于筛选含有特定DNA序列的重组质粒。
其原理基于大肠杆菌（E. coli）的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）基因（lacZ）和其启动子（lac promoter）的特性。
在重组质粒中，通常会将目标DNA序列插入到lacZ基因中的某个位置，从而破坏lacZ基因的完整性。
当重组质粒被转化到大肠杆菌中时，如果大肠杆菌中的β-galactosidase活性受到影响，那么它就无法将X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷）转化为蓝色产物，而只能将其转化为无色产物。
因此，含有完整的lacZ基因的大肠杆菌会产生蓝色菌落，而含有破坏的lacZ基因的大肠杆菌则会产生无色菌落。
为了实现蓝白斑筛选，通常会将重组质粒转化到含有X-gal的琼脂平板培养基上。
在培养过程中，含有完整lacZ基因的大肠杆菌会形成蓝色菌落，而含有破坏lacZ 基因的重组质粒则会形成无色菌落。
因此，通过观察菌落颜色，可以快速筛选出含有特定DNA序列的重组质粒。
总之，蓝白斑筛选重组子的原理是利用大肠杆菌β-galactosidase基因和启动子的特性，通过观察菌落颜色来筛选出含有特定DNA序列的重组质粒。
蓝白斑筛选
一、1、蓝白筛选的原理LacZ'是lacZ基因的突变型，编码半乳糖苷酶N端的146个氨基酸（全长1201氨基酸）。
MCS也在这个区域内。
这类载体的适合宿主细胞必须是Z基因突变型，只具有Z基因C端的序列。
当两个Z基因的突变产物在一起时可产生蛋白质间的互补，称α互补。
如pUC系列的载体一般采用DH5α、JM109。
因为pUC系列的质粒具有lacZ的α片段，而具有lacZ△M15基因型的DH5α、JM109等能表达与α片段互补的ω片段，因此当不带有外源基因的质粒pUC导入宿主细胞，具有lacZ的β-半乳糖苷酶活性，而插入外源基因的pUC质粒导入宿主细胞，则不具有β-半乳糖苷酶活性。
当将具有α互补的细菌培养在含IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，本身无色）的培养基上时，因β-半乳糖苷酶能将X-gal底物水解产生兰色物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此菌落为兰色。
相反，不互补则产生白色菌落。
如果在MCS位点上插入DNA片段导致插入突变，则不能产生α互补，因此菌落是白色的。
从而通过菌斑的颜色即可选择出具有插入外源基因的质粒的大肠杆菌。
2、影响转化率的几个重要因素⑴、受体细胞转化的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，它可容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
另外还应根据载体的性质及实验的目的选择合适的宿主。
此外，受体细胞生长状态和密度也很重要。
不要使用经过多次转接或储存于4℃的培养菌。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，密度过高或不足均会影响转化率。
⑵、载体DNA和重组DNA方面载体本身性质决定了转化的高低，不同的载体DNA转化同一受体细胞，其转化效率不同。
载体的空间构象也有明显影响，超螺旋结构的载体质粒往往有较高的转化率，经体外酶切连接操作后的载体DNA或重组DNA由于空间上难以恢复，其转化率常比cccDNA低两个数量级。
蓝白斑筛选名词解释
蓝白斑筛选名词解释蓝白斑筛选（blue-white selection）是一种用来筛选融合过表达的目的基因的方法。
它在分子生物学研究中被广泛应用于筛选携带特定基因型的细胞克隆。
蓝白斑筛选的基本原理是利用一种称为β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的酶来区分含有目的基因的细胞克隆和不含有目的基因的细胞克隆。
β-半乳糖苷酶是一种能够水解乳糖和其类似物的酶，在无添加基因座的细胞中存在着，而在添加了基因座的细胞中则不存在。
在蓝白斑筛选中，一般会将目的基因与与β-半乳糖苷酶基因lacZ连在一起，形成一个连锁或位点插入建构。
当该建构被转入宿主细胞中后，如果目的基因被激活或表达，那么lacZ基因也会被转录和翻译形成β-半乳糖苷酶。
而在加入X-半乳糖（一种受β-半乳糖苷酶水解的物质）后，带有lacZ基因的细胞会产生蓝色的反应物，形成蓝斑。
因此，只有带有目的基因的细胞才会出现蓝斑。
通过蓝白斑筛选，研究人员可以快速、高效地筛选出携带目的基因的细胞克隆。
这种方法的应用范围很广，包括但不限于以下几个方面：1. 基因克隆：蓝白斑筛选能够帮助研究人员快速鉴定克隆中是否含有目的基因，并确定目的基因的定位以及克隆的纯度。
2. 蛋白质表达：通过蓝白斑筛选，可以筛选出表达目的蛋白的细胞克隆，从而方便研究人员进行蛋白质的表达和纯化。
3. 基因表达调控：蓝白斑筛选可以帮助研究人员研究目的基因的表达调控机制，以及筛选出调控因子。
4. 化学物质筛选：通过蓝白斑筛选，研究人员可以筛选出具有特定功能的化学物质，从而研究其对细胞生物学过程的影响。
总之，蓝白斑筛选是一种重要的遗传工程技术，通过利用β-半乳糖苷酶对含有目的基因的细胞进行筛选，为基因克隆、蛋白质表达、基因表达调控等多个领域提供了高效、可靠的方法。
蓝白斑筛选的原理及方法
蓝白斑筛选的原理及方法载体pGEMZ在β-半乳糖苷酶（lacZ）的α-肽编码区内具有多克隆区域。
在重组质粒中插入片段使α-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。
不带有插入片段的载体，表达有功能的β-半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉lacZM15基因，导致内源α-肽失活。
载体pGEMZ或其它含lacZ基因的α-肽互补细菌，具有β-半乳糖苷酶的ω片段，所得功能β-半乳糖苷酶（α-肽加ω片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。
在载体pGEMZ 的多克隆区域，克隆上插入片段导致α-肽编码区的破坏，使β-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。
α-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落，因β-半乳糖苷酶只是部分失活。
重组质粒转化到合适的菌株中（JM109，DH5α），然后涂布到含0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal指示平板上。
可将50ul的X-Gal和100 ulIPTG贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在37oC保温30分钟使液体扩散。
IPTG溶于水中，贮液浓度为100mM，X- Gal溶于DMF，贮液浓度为50mg/ml。
IPTG 和X- Gal需分装后保存在-20 oC，可保存2-4个月。
◆IPTG即Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，也称Isopropyl β-D-thiogalactoside，中文名为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
分子式为C9H18O5S ，分子量为238.30，CAS Number 367-93-1，Ultra Pure，dioxane free，纯度>99.6%。
我公司提供Merck公司该产品。
◆本产品为接近白色的粉末常用分子生物学试剂，常用于蓝白斑筛选及IPTG诱导的细菌内的蛋白表达等。
IPTG是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。
基于这个特性，当pUC系列的载体DNA（或其他带有lacZ 基因载体DNA）以lacZ 缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体的载体DNA进行转染时，如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑选出基因重组体。
蓝白斑筛选
蓝白斑筛选原理(入门级)蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。
野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。
有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。
设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。
这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。
用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz'的基因，lacz'中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。
MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。
虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'的质粒后，质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。
操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。
以上是携带空载体的菌株产生的表型。
当外源DNA（即目的片断）与含lacz'的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。
实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。
含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。
蓝白斑实验汇总
载体pGEMZ在β-半乳糖苷酶（lacZ）的α-肽编码区内具有多克隆区域。
在重组质粒中插入片段使α-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。
不带有插入片段的载体，表达有功能的β-半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉l acZM15基因，导致内源α-肽失活。
载体pGEMZ或其它含la cZ基因的α-肽互补细菌，具有β-半乳糖苷酶的ω片段，所得功能β-半乳糖苷酶（α-肽加ω片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。
在载体pGEM Z的多克隆区域，克隆上插入片段导致α-肽编码区的破坏，使β-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。
α-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落，因β-半乳糖苷酶只是部分失活。
重组质粒转化到合适的菌株中（JM109，DH5α），然后涂布到含0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal指示平板上。
可将50ul的X-Gal和100ulIPTG贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在37oC保温30分钟使液体扩散。
IPTG 溶于水中，贮液浓度为100mM，X- Gal溶于DM F，贮液浓度为50mg/ml。
IPTG 和X- Gal需分装后保存在-20 oC，可保存2-4个月。
①Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galacto side）是一种人工工合成的、无色的乳糖类似物；②b-半乳糖苷酶与X gal显色反应是通过b-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝；③lacZ的a肽互补：a-肽（lacZ’ ）是b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸），lacZ只有在a-肽形成4聚体的状态下才有功能。
若受体菌lac Z 突变（lacZ?M15），b-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失a肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xga l 。
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加50μl II液，充分混匀
加100μl 酚-氯仿-异戊醇，涡旋振荡，使溶液呈现乳白色
12000rpm, 10min 取10μl 上清液，电泳检测。
实验药品 1. 溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH 2%SDS 临用前1:1混合贮存液即为II液. 2. 分离液 酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1 3. 1%琼脂糖凝胶
四实验步骤
分别挑取多个白色菌斑和一个蓝色对照菌斑到1.5ml含有 80μg/ml Kan抗生素的LB 液体培养基 37℃摇培过夜（10~12h） 6000rpm, 3min 弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。 短暂离心，收集剩余上清，弹匀至没有明显菌块
阳性克隆的快速检测
一、实验目的 学习蓝白斑筛选试验中阳性克隆的快速 检测方法 掌握蓝白斑筛选的原理和方法
二、蓝白斑筛选的原理
重组质粒转化细菌后，蓝白斑筛选往往是基于抗 生素筛选基础上的第二次筛选。 一般培养转化细菌的培养基中都要加入一定浓度 的适宜抗生素，只有含有质粒载体的细菌才可以生长 形成菌落，即抗生素完成对细菌是否含有质粒载体进 行了初步筛选。 质粒载体上存在的LacZ基因片段当被外源DNA 片段插入时，会产生白色的克隆，不含插入片段的质 粒进入宿主细胞生成蓝色菌落。这就是蓝白斑筛选， 即a-互补显色反应
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i P O lacZ
β-半乳糖苷酶
调控蛋白P
分解乳糖
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i P O
lacZ
-
β-半乳糖苷酶
-
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段 分解乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
三、实验材料、器具及药品
实验材料 LB固体培养基上生长的蓝白菌斑 实验器具 1.5ml Ep管，离心管架，微量取液器，台式高速 离心机，恒温振荡摇床，电泳仪，紫外透射检测仪。