细胞筛选个人整理
细胞筛选个人
细胞筛选个人Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】细胞筛选一嘌呤霉素(一)确定最优筛选浓度当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。
一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。
1.培养待转染（而不是转染后）的细胞。
（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）2.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×105个/ml的细胞悬液。
3.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。
（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。
）4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0,2,4,6,8,10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。
（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。
（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。
）5.每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天(即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。
如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。
6.在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大概需3到14天。
在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。
最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。
(二)转染细胞1.第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。
2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。
将已经制备的病毒颗粒0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1
最全的G418筛选稳定表达细胞系简介G418是一种广谱抗生素，可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的细胞，从而筛选出具有稳定表达的细胞系。
G418筛选是基因转染中常用的一种选择方法，通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。
本文将G418筛选步骤和优化方案。
G418筛选步骤细胞株选取首先需要选取稳定转染所需的细胞株。
需要保证选取的细胞株生长健康、分裂正常、易于培养以及不易死亡。
常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。
转染在开始筛选之前，需要将目的基因转染进入所选细胞株。
目前常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等，需要根据实际情况选择转染方法。
初步筛选完成转染后，需要在培养基中加入G418，通常的加药浓度不超过1mg/mL，推荐浓度为400μg/mL。
在转染后24-48小时内开始进行初步筛选，通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。
细分筛选初步筛选后，需要将G418的浓度逐步增加，通常第二轮加药浓度是初步筛选浓度的2倍，第三轮加药浓度是第二轮的2倍。
逐渐递增药物浓度，可以让敏感的细胞死亡，生存的细胞逐渐表达目的基因，从而得到稳定的细胞株。
稳定维持筛选到稳定的细胞后，需要对细胞进行定期维护。
通常可以在培养基中加入适当的G418浓度，维持稳定表达的转染细胞。
优化方案药物浓度G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。
在进行筛选前需要先进行剂量反应实验，通过不同浓度药物的处理，检测细胞生长状态和基因表达情况。
细胞密度传统细胞密度在98%时，死亡率是最高的。
因此，为了降低G418对细胞的毒性，可以将细胞密度控制在70-80%左右。
同时，过稀的细胞密度也会影响到筛选效果，因此需要根据实际情况进行调整。
培养时间筛选时间也直接影响到G418对细胞的毒性程度和筛选效果。
不同的细胞株和实验条件下，对筛选时间的选择有所不同。
通常初步筛选时间在24-48小时，细分筛选筛选时间需要根据实际情况进行判断。
稳转细胞系筛选注意事项
稳转细胞系筛选注意事项稳转细胞系筛选是细胞工程和生物医学研究中非常重要的一环。
以下是关于稳定细胞系筛选的50条注意事项，并对每一条进行详细描述：1. 选择合适的细胞系来源：在进行稳转细胞系筛选前，首先要选择合适的细胞系来源，以确保细胞系的稳定性和易转染性。
常用的细胞系来源包括HEK293、CHO、MDCK等。
2. 确定转染条件：在进行稳转细胞系筛选前，需要确定适合的转染条件，包括转染试剂种类、浓度、转染时间和细胞密度等。
3. 标定荧光素酶检测试剂盒：在进行稳转细胞系筛选时，需要使用荧光素酶检测试剂盒来检测稳定转染细胞系的活性。
4. 建立适当的质粒载体：选择适当的质粒载体对稳转细胞系的构建和筛选至关重要。
常用的载体包括pCDNA3.1、pcDNA3.1+、pEGFP-N1等。
5. 筛选适宜的筛选标记物：在进行稳转细胞系筛选前，需要选择适宜的筛选标记物，如抗生素、蛋白荧光标记等。
6. 确定稳定转染细胞系的稳定性：在进行稳定转染细胞系筛选时，需要对转染细胞系的稳定性进行验证，通常采用长期培养和连续传代的方式来确保转染细胞系的稳定性。
7. 选择适合的培养基和培养条件：在进行稳转细胞系筛选时，需要选择适合的培养基和培养条件以促进细胞系的稳定生长和表达。
8. 确定荧光素酶基因的稳定插入：在进行稳转细胞系筛选前，需要确保荧光素酶基因在细胞基因组中的稳定插入，通常采用PCR、Southern blotting等方法来验证。
9. 考虑基因组的稳定性：在进行稳转细胞系筛选前，需要考虑基因组的稳定性，并尽量避免对细胞基因组的不良影响。
10. 确定筛选标准：在进行稳转细胞系筛选前，需要确定筛选标准，如荧光素酶基因活性的阈值、抗生素的最佳浓度等。
11. 使用酶切鉴定：使用酶切鉴定来确保质粒载体的正确构建和稳定转染细胞系的正确筛选。
12. 建立稳定转染细胞系的储备：在进行稳转细胞系筛选后，需要建立稳定转染细胞系的储备，以备后续实验使用。
细胞转染与筛选
细胞转染与筛选方法总结细胞转染：对数期生长的U251细胞经含EDTA的0.25%胰酶消化后，细胞计数，接种于六孔板，每孔种植2×105个细胞，加2ml/孔完全培养基培养过夜，弃去培养基，PBS 洗3次，加入2ml/孔OPTI-MEM培养基。
将3μl FUGENE HD加入94μl空白OPTI-MEM培养基中，混匀，室温放置5min，加入PEGFP-N1或PEGFP-LRIG1质粒体2μg，混匀，室温放置10min，加入六孔板中。
六小时后，将细胞培养基换成DMEM完全培养基。
细胞筛选：转染后36h, 荧光显微镜下观察细胞转染情况，48h后加入G418，其终浓度为1000μg/ml。
放入细胞培养箱继续培养，每两天换液，重新加入G418。
待正常组细胞全部死亡（约15d）将G418浓度调整至500μg/ml，继续培养2周后，长出抗性克隆，挑取单个克隆，在96孔板中扩增，培养2周后，单个克隆已经长满整个孔，将细胞消化后转入6孔板，使用完全培养基继续培养，继而进行其他指标的检测。
细胞转染操作方法转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。
转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。
电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
细胞筛选 个人整理
细胞筛选一嘌呤霉素(一)确定最优筛选浓度当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。
一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。
1.培养待转染（而不是转染后）的细胞。
（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）2.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×105个/ml 的细胞悬液。
3.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。
（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。
）4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0, 2, 4, 6, 8, 10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。
（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。
（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。
）5.每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天( 即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。
如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。
6.在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大概需3到14天。
在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。
最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。
(二)转染细胞1.第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。
2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。
将已经制备的病毒颗粒0.5 ml加至上述培养基，轻吹混匀。
去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。
生理学复习 各正常指标 (个人整理)
生理学一、细胞的基本功能细胞内液（占体重40%）体液（60%）组织液（15%）→功能性细胞外液细胞外液血浆（5%）(占体重20%) 淋巴关节液无功能性细胞外液（占组织间液的10%；占体重1-2%）脑脊液血浆理化性质：酸碱度pH：7.35—7.45缓冲体系：HCO3-/H2CO3[HPO4]2-/H2PO4]-渗透压：渗透压为770kPa（29—310mosm/Kg.H2O）二、血液红细胞：男(4.0--5.5)×10^12/L 女（3.5—5.0）×10^12/L血液Hb：男120--160g/L 女110--150g/L血细胞白细胞：(4--10)×10^9/L中性粒细胞：0.5--0.7(50--70%)嗜酸粒细胞：0.005--0.05(0.5--5%)嗜碱粒细胞：0.00--0.001(0--1%)淋巴细胞：0.2--0.4(20--40%)单核细胞：0.03--0.08(3--8%)血小板：(100--300)×10^9/L血浆生理：血晶体渗透压：280--310mOsn/kg(280--310mmol/L)葡萄糖:3.9—６.１mmol/L高血糖的诊断标准：空腹血糖≥7.8mmol/L；餐后血糖≥11.1mmol/L。
血氯：95--105 mmol/L血钠：135--145 mmol/L血钾：3.5—5.5 mmol/L血清总蛋白（TP）：60—80g/L血清白蛋白（A）：40—55g/L血清球蛋白（G）：20—30g/L 白/球（A/G）=1.5—2.5：1血细胞生理：红细胞压积: 男0.4--0.5 女0.37--0.48红细胞平均直径: 6--9 um(平均7.2um)平均红细胞血红蛋白(ＭHＣ):２７－３４pg平均红细胞容积（ＭＣV):８０－１００ｆｌ平均红细胞血红蛋白浓度(ＭＣHC): ３２０－３６０ｇ／Ｌ（３２％－３６％）网织红细胞数: 0.005--0.015(0.5--1.5%) 网织红细胞绝对值(24-84)×10^9/L出血时间: （ＢＴ）６．９±２．１ｍｉｎ（不大于九分钟）三、血液循环系统心脏生理：（一般生理）心率→60－100次/分钟每搏排血量(SV)：60～80毫升（平均为７０ｍｌ）心排血量(CO)：男**４.２－４.８L/min 女比男性少１０％左右心脏指数(CI) ：0~3.5L/(min.㎡)射血分数(LVEF) ：５５％－６５％中心静脉压（5-12cmH2O）（电生理）静息膜电位：-90mV（I K1通道，K外流）O期去极化（-90--+30mv，钠离子内流）Ⅰ期快速复极化初期（+30—0mv，一过性钾外流）动作电位：Ⅱ期平台期（0mv左右,钾外流+钙内流）Ⅲ期快速复极化末期（0-- -90mv，钾外流）Ⅳ期静息期（-90mv左右，离子内外交换）兴奋性的周期性变化：有效不应期：（O期→Ⅲ期-60mv）绝对不应期（O期→Ⅲ期-55mv无论多大刺激无新的电活动）局部动作电位（Ⅲ期－55-- -－60mv）相对不应期（Ⅲ期－60-- －80mv，阈上刺激产生新的电活动）超常期（－80mV-- －90mV，阈刺激或阈下刺激产生新的电活动）血管生理：动脉血压正常不高于140/90mmHg，不低于90/60mmHg高血压：高血压前期120～139 或80～891 期高血压140～159 或90～992 期高血压160～179或100～1093期高血压≧180 或≧110微静脉血压15～20mmHg右心房血压最低接近于零中心静脉压(CVP)：4～12cmH2O有效滤过压＝(毛细血管压＋组织液胶渗压)－(组织液静水压＋血浆胶渗压)有效滤过压＞0，组织液生成→滤过有效滤过压＜0，组织液回流→重吸收生理学四、呼吸肺通气功能：√潮气量（ＴＣ）平静呼吸时400-600ml,一般以500ml ，运动时增大。
稳定细胞株筛选流程
稳定细胞株筛选流程稳定细胞株筛选是一种常用的实验方法，用于筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
这种方法可以用于基因功能研究、药物筛选和生物制品生产等领域。
本文将介绍稳定细胞株筛选的流程。
第一步：构建表达载体稳定细胞株筛选的第一步是构建表达载体。
表达载体是一种质粒，可以将目的基因导入到细胞中。
常用的表达载体有pCDNA3.1、pEGFP-N1等。
在构建表达载体时，需要将目的基因克隆到载体中，并加入适当的启动子和选择标记。
第二步：转染细胞转染是将表达载体导入到细胞中的过程。
常用的转染方法有热激转染、电穿孔转染和化学转染等。
在转染时，需要选择适当的细胞系和转染剂，并优化转染条件，以提高转染效率。
第三步：筛选稳定细胞株转染后，需要筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
常用的筛选方法有抗生素筛选和流式细胞术筛选等。
在抗生素筛选中，将选择标记加入到表达载体中，转染后加入相应的抗生素，只有表达目的基因的细胞才能存活下来。
在流式细胞术筛选中，将目的基因与荧光蛋白等标记融合，通过流式细胞术筛选出表达目的基因的细胞。
第四步：鉴定稳定细胞株筛选出稳定细胞株后，需要进行鉴定。
常用的鉴定方法有PCR、Western blot和免疫荧光等。
在PCR中，通过扩增目的基因的特定片段来鉴定细胞株是否表达目的基因。
在Western blot中，通过检测目的基因的蛋白质表达来鉴定细胞株。
在免疫荧光中，通过检测目的基因的荧光信号来鉴定细胞株。
稳定细胞株筛选是一种重要的实验方法，可以用于筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
在筛选过程中，需要注意选择适当的表达载体、转染方法和筛选方法，并进行鉴定，以确保筛选出的细胞株稳定表达目的基因。
生理学名词解释重点个人整理。
1．神经调节通过神经系统的活动对机体功能活动进行的调节，基本方式为反射。
2．体液调节指体内的一些细胞能生成并分泌某些特殊的化学物质，后者经由体液运输，到达全身的组织细胞或某些特殊的组织细胞，通过作用于细胞上相应的受体，对这些细胞的活动进行调节。
3．Feed-forward 即前馈，控制部分在反馈信息尚未到达前，已受到纠正信息的影响，及时纠正其指令可能出现的偏差的自动控制形式。
4．Negative feedback 即负反馈，指经过反馈调节，受控部分的活动方向和它原先活动相同的方向发生改变的调节方式。
5．正反馈指经过反馈调节，受控部分活动向和它原先活动相同的方向发生改变的调节方式。
6．内环境机体的内环境就是细胞外液。
7．自身调节某些细胞、组织或器官在不依赖于神经或体液调节的情况下，其自身能够对刺激产生适应性反应。
8．Homeostasis 即稳态，机体内环境各种物理化学性质保持相对稳定的状态。
9．Facilitated diffusion 易化扩散，指某些肺脂溶性小分子物质或者某些例子借助于膜结构中的特殊蛋白质的帮助顺电-化学梯度的跨膜转运，不需要细胞代谢提供能量。
10．单纯扩散simple diffusion 脂溶性小分子物质经脂质双分子层间隙进行的一种简单物理扩散。
11．Primary active transport 原发性主动转运，指离子泵利用分解ATP产生的能量将离子逆浓度梯度和电位梯度进行跨膜转运的过程。
12．继发性主动转运secondary active transport 有些物质利用原发性主动转运建立的离子浓度梯度，在离子顺浓度梯度扩散的同时将其他物质逆浓度梯度或电位梯度进行跨膜转运，这种间接利用ATP能量的过程。
13．动作电位的全或无现象刺激强度未达到阈值，动作电位不会发生；刺激强度达到阈值后，即可出发动作电位，而且其幅度立即到达该细胞动作电位的最大值，也不会因刺激强度的继续增强而随之增大。
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细胞筛选
一嘌呤霉素
(一)确定最优筛选浓度
当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。
一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。
1.培养待转染（而不是转染后）的细胞。
（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）
2.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血
清的培养基制成1.5×105个/ml的细胞悬液。
3.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后
向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。
（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。
）
4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0,2,4,6,8,10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基
溶液替换各孔中的旧的培养基。
（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。
（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。
）
5.每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天(即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无
抗无血清培养基溶液一次。
如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。
6.在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一
般生存时间而定，大概需3到14天。
在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞
死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。
最优浓度为在3-5天内杀死
所有细胞的浓度。
(二)转染细胞
1.第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到
70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。
2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。
将已经制备的病毒颗粒0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。
去除60mm培养皿内的
旧的培养基，加入含病毒培养基。
（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，
有时候Polybrene对细胞有毒性。
这时，可以用ProtamineSulfate代替Polybrene）
(三)筛选细胞
1.病毒感染后24小时，可以换用含最优浓度puromycin的培养基。
2.如果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至4-6小时，然后换用新鲜培养基，
24-48小时后换加含最优浓度puromycin的培养基。
最好设立一个对照皿，不加病
毒液，加入Ploybrene，观察Polybrene是否对细胞有毒性；如果Polybrene没有
毒性，还可以加入puromycin，作为puromycin是否有效的对照。
3.以后每隔一天换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，以替换含大量死细
胞的培养基。
直到抗性群落能被识别出（一般是在筛选后10到12天）。
4.待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm
平皿内。
5.60mm平皿内细胞长满后，收获细胞，在蛋白或mRNA水平鉴定基因敲低效率。
6.10cm培养皿内的细胞待长满后传代，首先每种稳定细胞系冻存4-5支细胞，待基
因敲低鉴定清楚后，解冻冻存细胞，进行表型观察分析。
通常情况下，由于慢病毒
为复制缺陷型病毒，受感染的细胞不能产生新的病毒，因此从加入病毒颗粒开始，经过5-6次换液后，培养基内已不存在病毒颗粒，可以移至普通细胞培养室内培养
研究。
二G418
(一)确定最优筛选浓度
由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
1.G418的配制：取1gG418溶于1ml1mol/L的HEPES液，加蒸馏水定容至10ml（使
G418终浓度为0.1g/ml,HEPES终浓度为100mmol/L），过滤消毒，4度保存。
HEPES的化学全称为羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanicacid），分子量238.31，是一
种氢离子缓冲剂，能较长时间的控制溶液的pH处于恒定的范围，而对细胞无毒
性作用。
1mol/LHEPES的简单配置：HEPES23．83g，溶解于80ml的双蒸水中，用10mol/L的NaOH调节pH至7.2-7.4，定容至100ml，0.22um小滤器过滤。
HEPES
使用终浓度为10-50mmol/L。
2.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内按0ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、
300ug/ml、400ug/ml，500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml，900ug/ml、1000ug/ml浓度用无抗无血清培养基稀释G418制成筛选培养基。
心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。
比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200ug/ml。
这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。
3.培养待转染（而不是转染后）的细胞。
（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）
4.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血
清的培养基制成1×104个/ml的细胞悬液。
5.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1×103个），然后向
每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养。
（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。
）
汇合度：实际上就是指细胞占培养表面的比例，如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100%汇合，也就是汇合度100%。
汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%！
6.培养6小时左右开始加药。
加筛选培养基筛选:吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一
次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基适量。
7.换液：每日检查细胞活力，根据细胞活力和培养基的颜色，每三天(即每隔两天)
更换筛选培养基一次。
如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。
有死细胞勤换液，可以减少对存活细胞的影响。
8.确定最佳筛选浓度：在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间
随细胞的生长率和一般生存时间而定，在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最
小G418浓度即为最佳筛选浓度。
在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用
某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量
在10天前就看不到活细胞了。
假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第
5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步
筛选，以确定最佳筛选浓度。
(二)转染细胞
1.第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到
70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。
2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene，终浓度为8μg/ml。
将已经制备的病毒颗粒0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。
去除60mm培养皿内的
旧的培养基，加入含病毒培养基。
（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，
有时候Polybrene对细胞有毒性。
这时，可以用ProtamineSulfate代替Polybrene）
3.转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近70％汇合时按1：4密度传代，继
续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时开始筛选。
(三)筛选细胞
1.加G418：去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养
基（无抗无血清）(实际应用时可以比最佳筛选浓度高一级别)。
2.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
当有大
量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。
筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药用完全培养基培养。
3.待其逐渐增大后，挑出单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1
个/10ul。
在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。
待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。
4.单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。
典型贴壁细胞平板密度。