嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
G筛选稳定表达细胞系经验总结图文稿
G筛选稳定表达细胞系经验总结Company number【1089WT-1898YT-1W8CB-9UUT-92108】G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
嘌呤霉素筛选细胞原理
嘌呤霉素筛选细胞原理
嘌呤霉素是一种广泛用于细胞生物学研究的抗生素，它通过特异性地抑制蛋白
质合成而对细胞产生影响。
嘌呤霉素筛选细胞原理主要是利用其对细胞的影响来筛选出对嘌呤霉素敏感或耐药的细胞株，从而为进一步研究细胞的生物学特性提供重要的工具和方法。
嘌呤霉素的作用机制是通过与细胞内的核糖体结合，阻止蛋白质的合成。
在细
胞中，核糖体是蛋白质合成的重要场所，而嘌呤霉素的结合会引起核糖体的功能受损，从而影响细胞的正常生物学活动。
因此，对嘌呤霉素敏感的细胞在其作用下会出现生长受抑制甚至死亡的现象，而对嘌呤霉素耐药的细胞则能够继续生长并繁殖。
在进行嘌呤霉素筛选细胞的实验中，首先需要将待筛选的细胞种植在含有嘌呤
霉素的培养基中，然后观察细胞的生长情况。
对于对嘌呤霉素敏感的细胞，其生长将受到明显的抑制，甚至会出现细胞死亡的现象；而对于对嘌呤霉素耐药的细胞，则会继续生长并形成细胞克隆。
通过这种方式，可以筛选出对嘌呤霉素敏感或耐药的细胞株，为后续的细胞生物学研究提供了重要的实验材料。
嘌呤霉素筛选细胞的原理不仅在细胞生物学研究中具有重要意义，同时也在药
物筛选和耐药机制研究中发挥着重要作用。
通过对细胞对嘌呤霉素的敏感性进行评估，可以为药物研发提供重要参考，同时也有助于深入了解细胞对抗生素的耐药机制，为临床治疗提供理论基础。
总的来说，嘌呤霉素筛选细胞的原理是基于其对细胞的特异性影响，通过观察
细胞在其作用下的生长情况来筛选出对嘌呤霉素敏感或耐药的细胞株。
这一原理不仅在细胞生物学研究中具有重要意义，同时也在药物研发和耐药机制研究中发挥着重要作用，为进一步的科学研究和临床治疗提供了重要的实验基础和理论支持。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）（1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。
细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。
嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。
（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
嘌呤霉素筛选稳定转染细胞（1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜；（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；（3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
）（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。
）到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。
孵育。
（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。
在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。
嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。
注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。
在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。
调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。
储存方法和稳定性：嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放；嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。
稳定株嘌呤霉素使用
使用过表达抗性慢病毒如何制备稳定细胞系？
步骤1，使用目的过表达gene-3xFLAG-IRES-puromycin慢病毒先在96孔板感染中目的细胞，可以设置3个左右不同的MOI组，待感染2-3天后，加入puromycin抗性药物进行筛选；（我们在293T细胞中puromycin维持药物浓度在5 μg/ml，2天即可杀死目的细胞；目的细胞的药物作用浓度可以参考该数值进行摸索）。
实验过程中必须设置空细胞的加药组，以确保药物的有效性。
步骤2，对具有抗药的混淆细胞感染株进行消化，稀释，然后分散在96孔板中，确保平均每孔细胞数量1个左右。
使用带有puromycin药物的培养基正常维持细胞，然后逐步放大，获得抗性稳定细胞系；
补充说明：对照病毒是GFP-3xFLAG-IRES-puromycin双标慢病毒，是带有荧光和抗性的，筛选对照稳定株的方法同步骤1和步骤2.
1。
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前，需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。
对于一些常见的细胞系，通常可以在资料中找到推荐的药物浓度。
例如Hela细胞用400 μg/ml的G41或1 μg/ml的嘌呤霉素进行稳定细胞株筛选。
用G418或潮霉素B，选用在5天左右出现细胞大批死亡，2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。
对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。
不同批次的药物活性有一定差异。
因此在使用新批次药物时，需要重新测定最佳浓度。
筛选抗生素的推荐使用浓度（μg/ml）
抗生素工作范围筛选浓度维持用量
G418 50-800 400-500 100
Hygromycin 50-800 200 100
Puromycin 0.25-2 0.5-10 0.25
1、在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。
第二天在培养基中按G418(0,50,1000,200,400,800μg/ml)或者嘌呤霉素（0,1,2.5,5,7.5,10μg/ml）加入。
2、用G418筛选处理5-10天。
每2天观察细胞一次。
每4天跟换新的有抗生素的培养基（如果有必要可以更换得更勤）。
直到得到最佳浓度。
3、用嘌呤霉素处理4-7天。
每2天跟换新的有抗生素的培养基。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）（1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。
细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。
嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。
（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
嘌呤霉素筛选稳定转染细胞（1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜；（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；（3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
）（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。
）到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。
孵育。
（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。
在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。
嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。
注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。
在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。
调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。
储存方法和稳定性：嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放；嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。
嘌呤霉素筛选浓度 (2)
未知驱动探索，专注成就专业
嘌呤霉素筛选浓度
嘌呤霉素（Puromycin）是一种常用的抗生素，可用于筛选经过质粒转染的细胞中是否有成功表达了融合蛋白或其他感兴趣的基因。
嘌呤霉素的浓度应根据具体实验的需求和细胞的特性来进行确定。
一般来说，嘌呤霉素的浓度可以在0.5-10 μg/ml范围内进行筛选。
初始筛选通常使用较高浓度（如2-10 μg/ml），以确保只有成功表达了目标基因的细胞能够存活下来。
随后，可以逐渐降低嘌呤霉素的浓度，以获得高达100%的筛选效率。
在实验过程中，可以通过处理并荧光显微镜观察细胞的存活情况，或者进行细胞增殖和生存率的测定，从而确定最佳的嘌呤霉素筛选浓度。
实验者也可以参考文献或嘌呤霉素的使用说明来选择适当的浓度。
1。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结一、引言简述稳定表达细胞系的重要性和应用领域阐明嘌呤霉素筛选法的原理和优势二、研究背景介绍稳定表达细胞系在生物制药、基因功能研究等领域的作用阐述嘌呤霉素筛选法在细胞系构建中的应用背景三、实验材料与方法详细列出实验所需的细胞株、质粒、嘌呤霉素等材料描述实验的基本流程，包括细胞转染、筛选、扩增等步骤四、嘌呤霉素筛选原理解释嘌呤霉素的作用机制和如何用于筛选稳定表达细胞阐述筛选过程中细胞的选择压力和适应性变化五、实验操作步骤详细描述实验的具体操作步骤，包括细胞培养、转染、筛选等提供实验操作中的注意事项和常见问题解决方案六、筛选效率与稳定性分析通过实验数据展示筛选效率，包括细胞存活率、表达水平等分析细胞系的稳定性，包括长期培养后的表达水平变化七、优化策略与改进措施根据实验结果提出优化筛选条件的建议描述改进措施，如提高转染效率、调整筛选压力等八、实验结果展示实验中获得的稳定表达细胞系的数据和图像分析实验结果，包括成功构建的细胞系数量、表达效率等九、案例研究选取几个典型的案例，详细描述筛选过程和结果分析案例成功或失败的原因，提供经验教训十、问题与挑战列出在筛选过程中遇到的主要问题和挑战分析问题产生的原因，提出解决方案十一、经验总结总结在嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系过程中积累的经验强调实验操作的准确性、条件控制的重要性十二、未来展望根据当前研究趋势，预测稳定表达细胞系构建的未来发展方向提出未来研究中可能采用的新方法和技术十三、结语强调稳定表达细胞系在生物医学研究中的应用价值表达对参与实验的团队成员的感谢十四、参考文献列出实验过程中参考的文献资料十五、附录附上实验操作的详细步骤、实验数据、图表等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）
（1）24孔板内以5~8x104?cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。
细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；
（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；
（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；
（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。
嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。
（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
嘌呤霉素筛选稳定转染细胞
（1）day0：24孔板内以5~8x104?cells/孔的密度铺板，孵育过夜；
（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；
（3）day1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
）
（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。
）到细胞内，然后孵育过夜；
（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。
孵育。
（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；
（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。
在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。
嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。
注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。
在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。
调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。
储存方法和稳定性：
嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放；
嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。
为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期，最好存放于-20°C，保质期为2年。
Starttoselectonpuromycin(2ug/mlfinalconcentration)3-4daysposttransfection.Massivecelldeathwillbeevi dentafter36-48hoursselectiononpuromycin.Dependentonthetransfectionefficiency,mosttransfectionwon' testablishsomepuromycin-resistantcoloniesexceptthattheretrovirus-producingcelllinesareusedforgener atingviralvector.Ifthefirstgenerationlentiviralvectorisusedinthetransfection,trytouseMo-MLVenvelopexpre ssingvector,ratherthanVSV/Gexpressingvectorforpackagingviralvectors.Thestablecolonies(trytopoolthe differentpuromycin-resistantcellcoloniestogehter,don'tmakesinglecolonyclone)willbeamplifiedafter10-14 daysselectiononpuromycin.。