激光共聚焦显微镜与普通显微镜成像原理及区别
激光扫描共聚焦显微镜
1、 选择好适宜的荧光探针。 原则上讲,无论是荧光素还是荧光标记抗体均 可用于LSCM 。如果打算用2种以上荧光标记物,要 注意它们是否激发光波长及发射光波长能区别开， 还要注意是否与LSCM的激发器相匹配，要根据现有 的激发波长来选择荧光标记物。
• 不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，故除综合 考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找 出最适的荧光探针。
6.观察活细胞、活组织：ＬＳＣＭ在不损伤
细胞的前提下，对活组织、活细胞进行观 察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期 处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观 察过的样品还可以继续用于其他的研究。 这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为 重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。
7. 生化成分精确定位观察配合专用的分子探 针，对于要检测的成分不仅可以定位到细 胞水平，还可以定位到亚细胞水平和分子 水平。
2015/6/12
激光扫描共聚焦显微镜：以激光作为激发光源，采用 光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫 描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统.
形态学研究：组织细胞 标本的抗原免疫荧光检 测，凋亡检测…
目的结构是用荧光探针标记的， 都可以用激光共聚焦显微镜观察
分子生物学：荧光原位杂交对DNA 和RNA定量，外源基因在真核细胞 的表达及定位，蛋白质相互作用 (FRET)…
4. 采 用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细小的激光 束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合成一个整体。传统的 光镜在场光源下一次成像，标本上每一点都会受到相邻点的 衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无 法相比的。
5.光电倍增管：检测设定范围内的光信号，并将光信号转换成 电 信号，相当于相机中的CCD或胶卷。 PMT只能检测到信号的强弱，不能记录信号的颜色，记录 的 结果通过信号强度和填充颜色表示。PMT单位用电压值V 表示，数值越大代表信号倍增越大，提高倍增会同时增加图 像的正常信号强度和噪声信号强度，使图像的信噪比下降。
激光共聚焦荧光显微镜原理
激光共聚焦荧光显微镜原理
激光共聚焦荧光显微镜是一种高分辨率的显微技术，其原理是利
用激光光束聚焦到非常小的区域内，通过荧光信号来获取样品的形态、结构和运动等信息。
在激光共聚焦荧光显微镜中，激光光束通过镜头透过样品，焦点
聚焦到比传统荧光显微镜分辨率高的区域，在这个区域内样品发射的
荧光信号通过探测器进行接收和分析。
与传统荧光显微镜相比，激光共聚焦荧光显微镜的优势在于可以
将样品聚焦到非常小的区域内，并通过不同颜色的荧光信号来区分样
品的不同结构。
同时，由于样品接受的激光光束非常强，所以可以用
非常低的荧光强度来观察样品，减少样品就会受到的伤害。
激光共聚焦荧光显微镜在生物学、医药研究、纳米技术等领域具
有广泛的应用。
例如，在生物学研究中可以通过该技术观察细胞膜、
核糖体和蛋白质等复杂的结构，并且可以进行动态跟踪；在药物研究
中可以观察药物在细胞内的运动和分布；在纳米技术领域可以观察纳
米材料的形态、大小分布以及表面化学特性等。
在使用激光共聚焦荧光显微镜时，有几点需要注意。
首先，激光
光束的强度对样品会造成损伤，需要注意控制激光光束的强度和样品
的曝光时间。
其次，激光共聚焦荧光显微镜需要比传统荧光显微镜更
高的技术要求，需要对仪器进行合理的调整和操作。
此外，样品的制
备和标记都需要严格要求。
总的来说，激光共聚焦荧光显微镜是一种非常重要的高分辨率技术，在多个领域都发挥了重要作用。
在使用该技术时需要注意控制激光光束的强度和曝光时间，并对仪器进行严格的操作和维护，以确保获得高质量的数据。
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用一、激光扫描共聚焦显微镜的原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。
原理图二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。
通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。
三、激光扫描共聚焦显微镜的应用（一）细胞的三维重建普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。
LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。
这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。
旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。
通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。
通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。
LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。
激光共聚焦显微镜成像原理
激光共聚焦显微镜成像原理激光共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscopy）是一种高分辨率的显微镜技术，它利用激光光源和共聚焦光学系统对样品进行扫描成像。
相比传统显微镜，激光共聚焦显微镜具有更高的空间分辨率和光学切片能力，可以实现对生物和材料样品的三维高清成像。
激光共聚焦显微镜成像的原理可以简单概括为以下几个步骤：激光光源的发射、激光聚焦成束、样品的激发和发射光信号的收集。
激光光源发射一束单色、高强度的激光光束。
这种激光光源通常采用氩离子激光器、固体激光器等。
然后，经过一系列光学元件（如透镜和反射镜）的聚焦作用，激光光束被聚焦成一束非常细小的光点。
这个光点称为聚焦点，也是成像的基本单元。
接下来，激光光束照射到样品表面，激发样品中的荧光分子或散射光子。
这些激发光子会以不同的波长和强度发射出来，形成样品表面的光信号。
通过共聚焦光学系统，将样品表面的光信号收集起来。
共聚焦光学系统通常由聚焦物镜、孔径补偿镜、光学切片镜和探测器等组成。
聚焦物镜将样品的光信号聚焦到探测器上，而孔径补偿镜和光学切片镜则用于调节光斑的大小和位置，以实现更精确的成像。
在整个成像过程中，激光共聚焦显微镜采用逐点扫描的方式，通过控制扫描镜和样品的相对运动，逐点地获取样品的光信号。
这些点的光信号被收集和记录下来，最终形成一个二维或三维的图像。
激光共聚焦显微镜成像原理的关键在于光学切片能力。
传统显微镜成像时，由于样品的厚度和光学性质的限制，图像往往存在模糊和混叠现象。
而激光共聚焦显微镜则能够通过调节光学切片镜的位置，只选取样品中某一特定深度的光信号进行成像。
这样就能够获得清晰的二维或三维图像，同时还能够对样品进行光学切片分析。
除了空间分辨率和光学切片能力的提高，激光共聚焦显微镜还具有其他一些优点。
例如，激光光源的单色性和高亮度使得显微镜具有较高的灵敏度和信噪比；逐点扫描的方式可以减少背景噪声，提高成像质量；同时，激光共聚焦显微镜还可以进行时间序列扫描和光谱扫描，用于研究样品的动态过程和光学性质等。
激光共聚焦显微镜要点解析(一)
激光共聚焦显微镜要点解析（一）激光共聚焦显微镜是80年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图象处理，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，在亚细胞水平上观察例如Ca2+，pH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子细胞生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
一、基本原理和功能1.1 基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰;激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描,标本上的被照射点,在探测针孔处成像,由探测针孔后的光电倍增管(PMT)或冷电耦器件(cCCD)逐点或逐线接收,迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面,克服了普通显微镜图象模糊的缺点。
1.2 激光共聚焦显微成像仪的图像处理功能1）“细胞CT”功能通过狭缝扫描技术将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平,使图像更加清晰,从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。
2）三维成像与细胞内部结构图像相结合的功能激光共聚焦显微成像仪可以将断层图像与三维重建图像有机的结合起来,不但能揭示细胞内部的结构和提供细胞的长、宽、厚、断层面积、细胞体积等参数,而且可以给人以三维立体的概念。
例如:可以使细胞旋转起来从而能随意观察细胞各个侧面的表面结构。
3）将形态学、生理学与分子细胞生物学的研究相互结合利用激光共聚集显微成像仪不但可以观察细胞形态的动态变化,而且用适当的荧光探针可以观察细胞内部的生物化学变化。
如细胞内游离Ca2+、pH值及其它细胞内离子的实时测定。
荧光原位杂交的杂交点观测和定量分析。
激光扫描共聚焦显微镜（LaserScanningConfocalMicroscopy
激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy, LSCM)成像技术目的结构是用荧光探针标记的，都可以用激光共聚焦显微镜观察形态学研究：组织细胞标本的抗原免疫荧光检测，凋亡检测…分子生物学：荧光原位杂交对DNA和RNA定量，外源基因在真核细胞的表达及定位，蛋白质相互作用(FRET)…活细胞动态荧光测量：细胞内Ca2+、Cl-等离子的动态分布及定量，细胞连接间的信息传递(FRAP)…成像基础：荧光成像主要原理：利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测。
z sections = imagesyzx激光共聚焦显微镜的设计特点：Laser：经过照明针孔后形成点光源，光源方向性强、发散小、亮度高、颜色纯、单色性强Beamsplitter(光束分离器)：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。
Pinhole (照明针孔和探测针孔)：最大限度的阻挡非聚焦平面以及聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品焦点位置PMT (PhotoMultiplier Tube, 光电倍增管)：检测设定范围内的光信号，并将光信号转换成电信号，相当于相机中的CCD或胶卷PMT只能检测到信号的强弱，不能记录信号的颜色，记录的结果通过信号强度和填充颜色表示PMT单位用电压值V表示，数值越大代表信号倍增越大，提高倍增会同时增加图像的正常信号强度和噪声信号强度，使图像的信噪比下降激光扫描共聚焦与传统荧光显微镜的主要区别： 激光扫描共聚焦显微镜只接收共焦点处荧光。
普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光，来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收。
影响来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率（焦平面以外的荧光结构模糊、发虚）。
CCDPMTFV1000 (Olympus)：多个荧光通道(405, 458, 488, 515, 543, 633)，可同时检测多个荧光标记一个透射光通道，透射光图像为非共焦图像激光扫描共聚焦显微镜的主要应用No.1 免疫荧光染色(单标、双标、多标)细胞浆、核、膜抗原的分布、半定量分析 几种抗原的共定位抗原与细胞器的共定位抗原转位No. 2 荧光标记活细胞内成分：氯离子荧光探针：MQAE[N -(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide]细胞内pH的荧光探针：BCECF AM[2’,7’-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester]活性氧荧光探针：DCFH-DANO荧光探针：DAF-FM DA[3-Amino,4-aminomethyl-2’,7’-difluorescein, diacetateNo. 3 荧光标记各种亚细胞结构：细胞内微丝：荧光染料标记的毒蕈肽(phalloidin)细胞膜荧光探针：DiI 即DiIC18(3) [1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，红]和DiO即DiOC18(3) [dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate，绿] 内质网探针：荧光标记的glibenclamide高尔基体探针：荧光标记的C5-ceramide。
激光共聚焦扫描显微镜使用原理讲解
1．激光共聚焦扫描显微镜的基本原理？与普通显微镜的区别？1.原理：激光共聚焦扫描显微镜利用激光束经光源前方的照明针孔（激发针孔）形成点光源，在物镜焦平面上形成一个轮廓分明的小点，激发出的荧光经原来的入射光路直接反向回到分光镜，并将荧光直接送到探测器前方的探测针孔（共聚焦针孔），通过探测针孔时先聚焦，由探测针孔后的光电倍增管逐点接收，在计算机屏幕上形成清晰的荧光图像。
照明针孔和探测针孔相对于物镜焦平面是共轭（共焦）的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时焦聚于照明针孔和探测针孔。
这样，标本上的被照射点发射的荧光在探测针孔处成像，而来自该点以外的任何发射荧光均被探测针孔阻挡。
2.区别：共聚焦显微镜与普通显微镜相比有许多独特的优点，包括：可以控制焦深、照明强度、降低非焦平面光线的噪音干扰，从一定厚度标本中获取光学切片，即显微CT。
最核心的优点是降低噪音干扰：对于物镜焦平面的焦点处发出的光在针孔处可以得到很好地会聚，可以全部通过针孔探测器接收，而在焦平面上下位置发出的光在针孔处会产生直径很大的光斑，对比针孔的直径大小，则只有极少部分的光可以透过针孔被探测器接收。
而随着距离物镜焦平面的的距离越大，杂散光在探测针孔处的弥散斑就越大，能透过针孔的能量就越少，探测器上产生的信号就越小，这样就能有效防止杂质信号。
2．钙指示剂的类别和优缺点：1. 生物发光蛋白优点：不需要荧光激发系统，光毒性小。
缺点：不能通透细胞膜，对技术要求高，效率较低，需要较多的指示剂。
2. 荧光蛋白指示剂优点:比值测定，荧光信号强。
缺点：染料的信号可变度小，对PH值变化敏感。
3. Fura2（比值型）优点：避免实验设备、细胞类型、实验个体的差异，数据具有高度可比性。
缺点：紫外激发，一定的自发荧光，损害细胞的能量代谢。
4. Fluo3（非比值型）优点：激发，自发荧光小，对细胞的损害较小。
缺点：数据直接为荧光强度值，容易受染料浓度、细胞动态变化等因素的影响。
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。
它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。
本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。
一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。
在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。
与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。
换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。
对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。
二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。
1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。
在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。
荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。
2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。
双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。
在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。
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激光扫描共聚焦显微镜采用激光作为光源, 有效地除去了非聚焦平面的信息, 提高了微观形貌的清晰度和分辨率。
其与计算机软件结合可以实现深度方向的光学切片观察, 再将这些扫描得到的信息通过软件算法以及叠加和重组, 可以获得材料的微观三维形貌, 因此激光共聚焦显微镜具有快速、无损、制样简单等优点。
那么激光共聚焦显微镜的原理又是怎样的呢？
它采用激光点光源照射样品, 从发射器发出的光经过光路后在聚焦平面上形成一个大小分明的光点,它沿着原照射光路到达分光镜并且该点发出的光被物镜收集,分光镜将收集来的光直接反馈给探测器。
光点通过前方探测器设有的探测针孔等一系列的透镜, 最终同时聚焦于探测针孔, 这样来自聚焦平面的光可以会聚在探测孔之内, 而来自聚焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像, 从而提高了焦平面的分辨率。
激光共聚焦显微镜逐点扫描样品, 探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像, 转为数字信号传输到计算机上, 最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。
转为数字信号传输到计算机上, 最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。
此外激光共聚焦显微镜还可以对样品进行逐层光学切片扫描, 得到高度方向每一层的图像信息, 传回计算机软件叠加处理后可以得到三维形貌图。
它成像清晰、精确、最大的优点在于能对材料进行深层形貌的观察。
可以对样品进行断层扫描观察和成像, 进行无损观察和三维形貌分析。
激光共聚焦显微镜可用来观察样品表面亚微米级别的三维轮廓形貌, 也可以测量多种微几何尺寸, 像晶粒度、体积、膜深、膜厚、深度、长宽、线粗糙度、面粗糙度等。
激光共
聚焦相比于其他测量手段有其独特的优势, 它提高了图片的清晰度, 有很好的景深, 提高了分辨率, 可以进行无接触的三维轮廓测试。
在金属材料研发方面还经常用到光学显微镜和扫描电子显微镜。
光学显微镜是一种二维的形态学工具, 有效分辨率较低, 分辨率的景深较小, 也不能观察纵向方向的三维形态。
而扫描电镜在样品的制备方面比较复杂, 有时还会引起样品的破坏, 对于扫描的面积和材料的表面高度都有所限制, 同时它也不能测量面积、体积、深度等信息。
在钢铁材料的生产和开发过程中, 众多的环节需要关注表面形貌, 采用激光共聚焦显微镜技术进行相应检测, 不仅可以获得媲美SEM的显微图像, 同时还能够进行快速、无损测量, 加之其较低的引入和维护成本,更符合目前行业成本控制的需求。
本文将举例说明激光共聚焦显微镜在金属研究领域的典型应用。
激光共聚焦显微镜由于其优于光学显微镜的清晰度和分辨率, 使其在金相组织观察方面有独特的优势。
试验样品为海洋平台用钢, 将样品进行磨制、抛光处理, 并用腐蚀溶液腐蚀, 要求观察并测量基体上粒状贝氏体的形态和尺寸。
相比于普通光学显微镜, 激光共聚焦显微镜清晰度好, 分辨率高。
激光作为光源, 它的单色性非常好, 光束的波长相同, 从根本上消除了色差。
共聚焦显微镜中在物镜的焦平面上放置了一个带有针孔的挡板, 将焦平面以外的杂散光挡住, 从而消除了球差。
同时激光共聚焦显微镜采取的点扫描技术和计算机采集和处理信号也进一步提高了图像的清晰度。