纤维素酶活力的测定
纤维素酶活力的测定
纤维素酶活力的测定（CMC糖化力法）1、定义：1克固体酶粉（或1毫升液体酶），在40℃pH﹦4.6条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠（CMC-Na），产生1.0ug的葡萄糖，即为1个酶活单位，以u/g（u/ml）表示。
2、原理：CMC-Na在纤维素酶的作用下,水解产生纤维寡糖、纤维二糖、葡萄糖等还原糖，还原糖能将3，5﹣二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，在540nm波长下测定吸光度值A，吸光度与酶活成正比。
CMC-Na糖化力主要代表内切β-1.4-葡聚糖的活力和外切酶活力总和。
3、试剂：3.1 0.1mol/LpH﹦4.6醋酸﹣醋酸钠缓冲溶液：将49.0ml0.2mol/L醋酸钠溶液和51.0ml0.2mol/L醋酸溶液混合后加100ml蒸馏水。
注意：0.2mol／L醋酸钠溶液：称取27.22g结晶乙酸钠（AR）定容至1000ml。
0.2mol／L醋酸溶液：称取冰乙酸（AR）11.5ml定容至1000ml。
3.2 3，5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.3克3,5-二硝基水杨酸用水溶解，加入21.0克NaOH，182克酒石酸钾钠，加500ml水，加热溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。
3.3 葡萄糖标准溶液（1.0mg /ml）：称取1.000克葡萄糖（AR）(105℃干燥至恒重)用蒸馏水溶解后定容至1000ml，冰箱保存备用。
3.4 羧甲基纤维素钠溶液：称2.0gCMC-Na溶于200 ml蒸馏水中，加醋酸缓冲溶液100 ml,混匀后存于冰箱内备用。
配后隔天使用。
4、仪器4.1 分光光度计4.2 恒温水浴，50℃4.3 25 ml具塞刻度试管5、分析步骤：5.1标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
纤维素酶活力测定
山东大学实验报告2011年4月20日姓名张行润系年级2009级生科4班学号200900140177 同组者于潜科目生物化学实验题目纤维素酶活力测定—3,5-二硝基水杨酸法仪器编号105一、实验目的1、学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法2、巩固使用分光光度计二、实验原理纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。
其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。
纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。
因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
本实验中酶活力定义：1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。
由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。
三、实验器材（1）722型分光光度计（2）恒温水浴（3）沸水浴锅（4）电炉子（5）剪刀（6）分析天平（7）试管架（8）胶头滴管（9）具塞比色管（25mL×10）（10）移液管（2mL；5mL）（11）烧杯（500mL×3）（12）洗耳球四、实验材料（1）纤维素酶：0.05g酶溶解定容至50ml，取1ml再定容至100ml待测（用PH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制）；（2）3、5—二硝基水杨酸显色液；（3）0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置；（4）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）；（5）蒸馏水。
纤维素酶酶活测定可编辑全文
纤维素酶酶活测定纤维素酶活测定方法一、原理纤维素酶能将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，具有还原性末端的纤维二糖糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。
反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
酶活定义纤维素酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。
二、实验试剂羧甲基纤维素钠（聚合度1700-2000），内切纤维素酶（苏柯汉）50mmol NaAC-HAC、DNS试剂三、实验仪器容量瓶（1000ml ×2、500 ml×3、100 ml ×4、50ml×4 ml）、移液器、烧杯（500ml×3、50ml×3）、具塞试管、电热套、水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平四、标准曲线的绘制五、酶活测定由于苏柯汉给定的pH范围为4.8-5.2，故选用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液测定纤维素酶酶活。
1、样品的制备CMC-Na溶液的制备：用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液配置0.5%的CMC-Na （羧甲基纤维素钠）溶液，准确称量CMC-Na0.05g，精确至0.001g，溶于蒸馏水中，45℃水浴锅中搅拌溶解，冷却后定容至100ml。
纤维素酶液的制备：准确称取纤维素酶，精确到0.001g。
用50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液配置成适当的浓度10000倍，保证吸光度在0.2-0.6之间。
2、DNS法测酶活：取1.8ml 0.5% CMC-Na的溶液于25ml 具塞刻度试管中，55℃预热10min左右，加入0.2ml 适当稀释的酶液，于55℃水浴锅中保温30min后，然后加2ml DNS，混匀，沸水浴5min，冷却至室温，定容到25ml。
混匀测OD540nm。
纤维素酶的三种活力测定方法
纤维素酶的三种活力测定方法
纤维素酶是一种重要的酶类，具有分解纤维素的作用。
为了评估纤维素酶的活力，人们研究出了多种测定方法，其中较为常用的有以下三种：
1. 滴定法：将一定量的纤维素酶加入含有纤维素的溶液中，反应一定时间后，使用酸碱滴定法测定反应液的酸碱度变化，从而得出纤维素酶的活力。
2. 电泳法：将一定量的纤维素酶加入蛋白质凝胶中，进行电泳分离，然后在凝胶中添加含纤维素的溶液，观察纤维素的降解情况，从而得出纤维素酶的活力。
3. 显色法：将一定量的纤维素酶加入含有纤维素的溶液中，反应一定时间后，使用显色剂对反应液中的产物进行染色，然后利用分光光度计测定反应液的吸光度变化，从而得出纤维素酶的活力。
这三种测定方法各有优劣，研究者应根据实际需要选择合适的方法进行测定。
- 1 -。
两种常用纤维素酶活力测定方法滤纸酶活-CMC酶活
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(F PA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1mi n催化纤维素生成lu g葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(F PA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液l ml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6c m)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴l Omin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmi n后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlO OO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
纤维素酶活力的测定
目的本检测方法是用来确定本公司纤维素酶类的催化活性。
本方法适用于各种固体和液体纤维素酶制剂。
说明本方法适合于纤维素类酶的质量分析和质量控制领域。
但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。
原理纤维素被纤维素酶水解最终降解生成β-葡萄糖。
鉴于纤维素结构的复杂性，没有任何一种酶能将纤维素彻底水解。
1950 年Reese提出了C1-Cx概念。
C1是一水解因子，作用于纤维素的结晶区（如棉花纤维即为高度结晶性纤维），使氢键破裂，呈无定形可溶态，成为长链纤维素分子。
再由Cx最终催化形成还原性单糖。
而Cx通常包括：（1）内切葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，简称EG)。
这类酶随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子（羧甲基纤维素钠（CMC）即为人工合成的一种线形纤维素钠盐）截短。
（2）外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91），又称纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase，简称CBH）。
这类酶作用于β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。
（3）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG），这类酶将纤维二糖（水杨素即为葡萄糖苷键连接的纤维二糖）水解成葡萄糖分子。
据上述理论，分别设计以滤纸（filter paper）、棉球、CMC、水杨素为底物，分别衡量纤维素的总体酶活性（FPA）、C1、Cx、Cb酶活性。
将底物水解后释放还原性糖（以葡萄糖计）与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应产生颜色变化,这种颜色变化与葡萄糖的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。
通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。
纤维素酶类活性的定义Ⅰ 1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解1×6cm的滤纸（FPA）产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个FPA酶活力单位。
纤维素酶活力的测定
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（一）导入新课
通过阐述纤维素酶是一种重要复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。
纤维素酶反应和一般酶反应不一样，其最主要的区别在于纤维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。
由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶与底物形成的ES复合物过程。
纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖。
酶作用的最适温度为40～50℃，最适pH在4.0～6.0.
常见的激活剂有：氟化钠、Mg2+、氯化钴、Ca2+、磷酸钙等，纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力。
提出其活力测定的重要性。
生产纤维素酶的微生物菌种较多的是有细菌、放线菌、真菌等，其中酶活力较强的菌种为木霉属（Trichoderma）、曲霉属（As pergillus）和青霉属（Penicillium）,特别是绿色木霉（Trichoder mavirde）及其近缘菌株等较为典型，是目前公认的较好的纤维素酶生产菌。
现已制成制剂的有绿色木霉、黑曲霉、镰刀霉等纤维素酶。
同时，反刍动物依靠瘤胃微生物可消化纤维素，因此可以利用瘤胃液获得纤维酶的粗酶制剂。
另外，也可利用组织培养法获得所需要的微生物。
（二）纤维素酶的生产流程？
斜面培养。
纤维素酶活力的测定(sdu)
纤维素酶活力的测定高熹 168615140001一、实验原理纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3、5-二销基水杨酸中销基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。
酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。
因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
二、实验试剂1、3、5—二销基水杨酸显色液：称取10克3、5-二销基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20克分析纯氢氧化钠，200克酒石酸钾钠，加水500毫升，升温溶解后，加入重蒸酚2克，无水亚硫酸钠0.5克。
加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000毫升。
存于棕色瓶中，放置一周后使用。
2、0.1摩尔PH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液。
3、0．5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。
使用前摇匀。
4、标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100毫克，溶解后定容至100毫升，此溶液含葡萄糖1.00毫克/毫升。
三、实验器材1、紫外可见分光光度计2、胶头滴管3、水浴锅4、试管5、移液管四、实验步骤1、标准曲线的绘制：分别吸取0.2、0.4、0.6 、0.8.0、1.0毫升的葡萄糖于5支试管中,均用蒸馏水稀释至1毫升,加3.5-二销基水杨酸显色剂3毫升,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,加蒸馏水21毫升,摇匀.以1毫升蒸馏水代替糖作空白管,在550nm处比色。
以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线。
2、样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3毫升，酶液1毫升,于50度水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化液。
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β-糖苷酶活力的测定(CＭC)
一目的:
掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。
原理:
纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠(CMＣ-Nａ)中分解出还原糖,还原糖又同3,５－而硝基水杨酸发生反应,产生一种黄橙混合色,用分光光度计可测定其色度,计算酶活力。
二试剂:
1.3,5-而硝基水杨酸显色剂(又称DNS试剂): 称取10g3,5-而硝基水杨酸,溶于蒸馏水中,加入20g分析纯NaOH,２00g酒石酸钾钠,加税5０0mｌ,升温溶解后,加入重蒸酚2ｇ,无水亚硫酸钠0、5g,加热搅拌,待全部溶解后,定容至1000mｌ。
贮存于棕色瓶中,室温保存,放置一周后使用。
２.０、1moｌ／ＬｐH4、5醋酸－醋酸钠缓冲液:称取结晶醋酸钠(CＨ3COOＮａ、3 Ｈ2Ｏ)13.６１g,醋酸(ＣH３COOH)6、０0g,用蒸馏水溶解,并定容至1００0 ml,配好后用pH计矫正。
3、1mg/ml葡萄糖标准溶液:准确称取10０mｇ分析纯葡萄糖(预先在70℃、60０nm汞柱下干燥5h至恒重),用少量蒸馏水溶解并定容至100ｍl,冰箱中保存备用。
４.代测酶液:称取酶粉1、0ｇ(或吸取酶液1、０0ml),先用少量的０、05ｍoｌ／L pＨ４、5醋酸-醋酸钠缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中,沉渣部分再加上述缓冲液溶解,如此反复捣研３－4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度,４0℃水浴锅中浸提1h,用四层纱布或脱
脂棉过滤,滤液供测定用。
5、底物:０.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液,配制方法为城区0、5000g 羧甲基纤维素钠(Ｓigmａ公司生产),准确至０、0０1g,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存,有效期3d。
三仪器:
分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。
四方法步骤:
1．标准曲线的绘制
分别吸取0.２, 0.４, 0、6, ０、8, 1.0, 1.2, １.4ｍl的1ｍg／ml葡萄糖液于７支20ｍl的比色管中,分别用蒸馏水补充体积至2、ｏml,各加３,５-而硝基水杨酸1、5ml,在沸水浴中煮沸5ｍiｎ,冷却后分别用蒸馏水定容至２0ｍl,摇匀。
以2ml蒸馏水加DNS溶液１、5mｌ,按上述同样操作为空白调零,在５40ｎm处比色。
标准曲线绘制个试管所含物质的体积见下表。
以吸光度A值为纵坐标,葡萄糖毫克数Ｗ(mg)为横坐标绘制出标准曲线(理论上此线应过原点)。
标准曲线绘制各试管所含物质的体积
2．酶样测定
取20mｌ比色管１支,加入0、５ｍol/L pＨ４、5醋酸-醋酸钠缓冲液1、5ｍl与６小片1cｍ×1cm滤纸后,再加适当稀释的酶液0、5ml,于40℃下保温1h后,再加适当稀释的酶液0、5ml,于40℃下保温1h后,加DNS液１.5ml,在沸水煮沸5ｍin显色,流水冷却,用蒸馏水定容至２0ml,摇匀;另取一支试管,加缓冲液与滤纸后,先加DNS液,再加缓冲液0、５ml,同样显色、冷却、定容作为空白,在波长540nm比色,测定Ａ值,查标准曲线得出相应的葡萄糖含量W。
五计算
酶的比活力定义:在４0℃,pH4、5条件下,每小时催化滤纸产生相当于1ｕg 分子葡萄糖的还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位,以U／g表示。
W×1０00×n
Ｘ= －-－-－---－-－
０、5×１８０×30
式中,X-－--样品酶的活力,U/g(ug／ml);
W--－-查标准曲线得出相应的葡萄糖含量,ｍg;
1０００--－-mg换算成ｕg的换算系数;
０、5-－－-吸取酶液的量,mｌ;
180－---葡萄糖分子量;
ｎ-－-－稀释倍数;
３０----反应时间,ｍin。