细胞离心方法和原理
血细胞离心

血细胞离心血细胞离心是一种常见的实验方法,用于分离血液中的不同种类的细胞。
血液是人体内循环系统中最重要的液体之一,它由血浆和血细胞组成。
血细胞包括红细胞、白细胞和血小板,它们各自具有不同的功能和特点。
血细胞离心可以将这些细胞分离出来,以便进行更深入的研究和分析。
血细胞离心的原理是利用离心机的离心力将血液中的细胞分离出来。
离心机是一种常见的实验设备,它可以通过旋转离心管来产生高速离心力。
当血液样品被放入离心管中后,离心机开始旋转,产生的离心力会将血液中的细胞分离出来。
由于不同种类的细胞具有不同的密度和大小,它们会在离心过程中被分离到不同的位置。
这样,我们就可以通过收集不同位置的细胞来分离它们。
红细胞是血液中最常见的细胞类型,它们负责将氧气从肺部输送到身体各个部位。
红细胞具有特殊的形状和结构,可以在血液中自由流动。
在血细胞离心中,红细胞会被分离到离心管的底部。
这是因为红细胞比其他细胞更重,具有更高的密度。
通过收集离心管底部的红细胞,我们可以获得纯净的红细胞样品,以便进行相关的研究和分析。
白细胞是血液中的另一种重要细胞类型,它们负责保护身体免受病原体和其他有害物质的侵害。
白细胞分为多种类型,包括淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等。
在血细胞离心中,白细胞会被分离到离心管的上层。
这是因为白细胞比红细胞轻,具有较低的密度。
通过收集离心管上层的白细胞,我们可以获得纯净的白细胞样品,以便进行相关的研究和分析。
血小板是血液中的另一种细胞类型,它们负责促进血液凝固和止血。
血小板比白细胞更小,密度更高。
在血细胞离心中,血小板会被分离到离心管的中间层。
通过收集离心管中间层的血小板,我们可以获得纯净的血小板样品,以便进行相关的研究和分析。
血细胞离心是一种非常重要的实验方法,它可以帮助我们分离不同种类的血细胞,以便进行更深入的研究和分析。
通过血细胞离心,我们可以获得纯净的细胞样品,以便进行相关的实验和研究。
这种方法在医学、生物学和其他领域中都有广泛的应用,可以帮助我们更好地了解血液中不同种类的细胞,以及它们在身体内的作用和功能。
细胞生物学离心技术

转头类别:
垂直转头 vertical rotor
近垂直转头
固定角转头 fixed-angle rotor
水平转头 swing-out rotor
0°
<10°
短
分
24°
离 时
间
垂直转头 低 近垂直转头 固定角转头
分 离 纯 度
长 水平转头 高
90°
离心管的选用
容量 形状 最大离心力 耐腐蚀性 灭菌 透明度 能否刺穿 管盖
释放细胞核,光镜鉴定释放效果。 • 离心,光镜鉴定分离效果
(1)从组织中制备细胞核
细胞破碎:裂解缓冲液:0.25M蔗糖,
离心:
10mM Tris-HCl pH7.4, 10mM NaCl (低渗), 3mM MgCl2, 1mM DTT, 0.5mM PMSF。
组织研磨器;
肝脏组织切成1cm3小块,装入缓冲液中,倒入研磨器
6.分离细胞器的用途
(1)研究细胞器的化学组成、酶活性和代谢特点
(2)研究细胞器的功能 无细胞系统,Cell Free System
蛋白质加工、分选; 内质网、高尔基体、线粒体的功能; 染色质的包装等。
7.举例:细胞核分离
原理: 细胞核特征:体积大,沉降系数大;
密度高,可通过浓蔗糖,分离容易。
分离设计: • 细胞破碎(机械匀浆,渗透溶胀,表面活性剂),
特点: 介质密度均一; 速度由低向高,逐级离心; 优点:操作简单;倾倒法即可将上清液与沉
淀分开 缺点是:须多次离心,沉淀不纯,分离效果
差,沉淀受挤压,易变性失活。
Density gradient centrifugation (密度梯度离心法)
主要是根据被分离颗粒的密度差异。只要被分离颗粒间的 密度差异大于1% 就可用此法分离。 优点是: 分离效果好,获得较纯颗粒;适应范围广,既能 分离具有沉降系数差的颗粒,又能分离有一定浮力密度差 的颗粒;颗粒不会挤压变形,能保持颗粒活性,并防止已 形成的区带由于对流而引起混合。 缺点是:离心时间较长;需要制备惰性梯度介质溶液;操 作严格,不易掌握。
ficoll密度梯度离心法分离pbmc

ficoll密度梯度离心法是一种常用的细胞分离技术,尤其在分离外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC)时被广泛应用。
该技术通过梯度离心的原理,能够将不同密度的细胞分离开来,从而得到高纯度的目标细胞。
本文将从原理、操作步骤及应用方面对ficoll密度梯度离心法分离PBMC进行介绍。
一、原理1. ficoll密度梯度离心法的原理ficoll密度梯度离心法是基于不同细胞在不同密度梯度离心条件下会沉降到不同层级的原理。
ficoll是一种聚合物,在水溶液中形成梯度,形成浓度递增的梯度。
当混有不同密度的细胞悬液样本在ficoll梯度上离心时,密度较高的细胞沉淀到ficoll浓度较高的层次上,而密度较低的细胞则会沉淀到ficoll浓度较低的层次上,从而实现了不同细胞的分离。
2. ficoll密度梯度离心法分离PBMC的原理在分离PBMC时,PBMC是由淋巴细胞和单核细胞组成的一种混合细胞悬液。
在ficoll密度梯度离心法中,PBMC会在ficoll的适当浓度层次上形成特定的固定位置,而其他细胞则会分布在不同的ficoll浓度层次上。
通过调整ficoll梯度的浓度,即可使PBMC在特定位置上沉淀,从而实现PBMC的分离。
二、操作步骤1. 制备ficoll梯度液将ficoll粉末加入等体积的PBS缓冲液中,充分溶解并混匀,得到ficoll梯度离心所需的溶液。
2. 取样、稀释取外周血样本,加入适量的PBS缓冲液稀释,使细胞密度均匀并不超出离心设备的容量。
3. 加样将稀释后的外周血样本缓慢地加入到制备好的ficoll梯度液上,避免产生气泡并保持悬液的均匀性。
4. 离心分离将加样后的离心管放入离心机中,进行高速离心。
离心过程中,细胞会根据密度在ficoll梯度上分层沉淀,形成不同层次的细胞带。
5. 取样离心结束后,用吸管或移液器沿着管壁取下PBMC所在的ficoll层次,并转移至新的离心管中。
巨噬细胞的分离方法及其详细原理

巨噬细胞的分离方法及其详细原理巨噬细胞,这个名字听起来气势汹汹,但实际上它们就是我们身体里的“小守卫”,专门负责打击入侵者、清理垃圾的角色。
说白了,就是我们体内的“清道夫”,与那些街道清洁工一样,默默无闻却又至关重要。
但是,有时候为了研究它们怎么工作的,我们就得把它们从其他细胞中分离出来。
那么,怎么才能把这些“小清道夫”从一堆细胞中捞出来呢?好吧,今天就来聊聊几个常见的巨噬细胞的分离方法和背后的原理,听起来是不是有点像科幻片的情节呢?1. 离心法1.1 基本原理首先,离心法就是你想象中的那个旋转的绝技,只不过这不是在舞场上,而是在实验室里。
基本的理念是利用细胞的密度差,像分层蛋糕一样,把不同的细胞分开。
说白了,就是“有些细胞重,有些细胞轻”,我们要利用这种差别来分别它们。
1.2 实际操作你先得把含有各种细胞的样本放到离心管里,这时候小心别给它们搅和得太厉害哦。
然后把这个离心管放进离心机里,设定好转速和时间。
你会发现,转一转之后,细胞们就乖乖地分层了。
底下是那些重的细胞,顶上是轻的,巨噬细胞通常位置比较不错,咱们就把它们捞出来,像捞出一块好蛋糕一样。
2. 密度梯度离心法2.1 什么是密度梯度?接下来,密度梯度离心法是一种高级版的离心法,它结合了离心和密度梯度的好处。
你可以想象成你在游泳池中,不同的人因为体型不同沉浮位置也不同。
我们将样本放在一个专门的密度梯度介质中,然后再进行离心。
这种方法能准确地把巨噬细胞分出来,因为它们在特定的密度位置那儿静静地“待命”。
2.2 操作步骤先把介质倒到离心管里,然后再把样本小心翼翼地放上去,千万别搅和,让它保持层次就好。
接着放进离心机。
一段时间过去后,“哇”,巨噬细胞就会像小鸟一样,轻轻飞到它们应该呆的位置。
真是个神奇的过程呀。
3. 免疫磁珠法3.1 什么是免疫磁珠?再来聊聊免疫磁珠法,这听起来像是魔术,实际上是利用了抗体和磁珠的力量。
大家都知道,免疫系统会识别某些标记,巨噬细胞表面有特定的标记,咱们可以用这些标记去“捕捉”它们。
细胞分离方法与原理

细胞分离方法与原理细胞是构成生命的基本单位,其分离对于生物学研究、医学诊断和治疗等领域具有重要意义。
细胞分离技术是指将混合的细胞种群分离出特定类型的细胞或富含某种细胞的组织。
本文将围绕细胞分离的方法和原理展开讨论。
一、细胞分离的方法1. 机械法机械法是最早被使用的细胞分离方法之一,其原理是利用细胞的大小、形状、密度、粘附性等特性,通过物理力学的方法将不同种类的细胞分离出来。
机械法包括过滤、沉淀、离心、切碎、切割等方法。
其中,过滤法是最常用的方法,通过不同孔径的滤网筛选出目标细胞,常用的滤网孔径为0.22μm、0.45μm和0.8μm等。
2. 化学法化学法是利用化学试剂对细胞进行分离的方法。
化学试剂可以改变细胞的表面电荷、粘附性、抗体性等特性,使其与其他细胞或细胞外物质分离。
化学法包括胶体金法、磁珠法、离子交换法、免疫磁珠法等。
其中,免疫磁珠法是一种广泛应用的方法,可以利用特异性抗体对细胞进行分离,具有高效、高选择性和易操作等优点。
3. 生物学方法生物学方法是利用生物学特性对细胞进行分离的方法。
生物学方法包括细胞培养、细胞染色、细胞分选等。
其中,细胞培养是最常用的生物学方法之一,可以将细胞在培养基中生长和繁殖,使其数量达到分离的要求。
细胞染色是利用染色剂对细胞进行染色,从而得到不同形态和结构的细胞,有助于细胞的鉴定和分离。
细胞分选是利用细胞的生物学特性,如大小、形状、表面特性等,对细胞进行分离,常用的方法包括流式细胞术、激光捕获微操作等。
二、细胞分离的原理1. 物理原理细胞分离的物理原理主要包括大小、形状、密度、粘附性等特性。
不同种类的细胞具有不同的大小和形状,通过物理力学的方法可以将其分离出来。
例如,利用过滤法可以分离出大小不同的细胞;利用沉淀法可以分离出具有不同密度的细胞;利用粘附性可以分离出具有不同粘附能力的细胞。
2. 化学原理细胞分离的化学原理主要包括化学试剂对细胞表面电荷、粘附性、抗体性等特性的改变。
t细胞分离方法和分离原理

t细胞分离方法和分离原理(最新版4篇)目录(篇1)1.T 细胞的概述2.T 细胞分离的常用方法3.T 细胞分离的原理4.T 细胞分离的应用5.总结正文(篇1)T 细胞是免疫系统中的一种重要细胞类型,它在免疫应答中扮演着关键的角色。
T 细胞的分离和纯化对于研究免疫系统和疾病的免疫机制具有重要意义。
一、T 细胞的概述T 细胞,即 T 淋巴细胞,是一种重要的免疫细胞,主要参与细胞免疫应答。
根据功能和表型的不同,T 细胞可分为多种亚型,如 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、CD4+ CD25+调节性 T 细胞等。
二、T 细胞分离的常用方法目前,常用的 T 细胞分离方法主要有以下几种:1.贴壁粘附法:利用 T 细胞与特定抗原结合的能力,使 T 细胞粘附在固相载体上,从而与其他细胞分离。
2.磁珠法:通过连接有磁珠的特异性单抗与 T 细胞表面抗原结合,在外加磁场中,利用磁珠与细胞间的相互作用力,实现 T 细胞的分离。
3.流式细胞术:利用 T 细胞表面特异性抗原与荧光标记的抗体结合,通过流式细胞仪对细胞进行分选。
4.尼龙毛柱分离法:利用尼龙毛对 T 细胞的吸附能力,与其他细胞进行分离。
三、T 细胞分离的原理T 细胞分离的原理主要基于其表面抗原与特定抗体或物质的特异性结合。
通过这种结合,可以利用外力(如磁场、离心力等)使 T 细胞与其他细胞分离。
目录(篇2)1.T 细胞的概述2.T 细胞分离的必要性3.T 细胞分离的方法a.免疫磁珠法b.尼龙毛柱分离法c.贴壁粘附法d.Percoll 分层液法4.T 细胞分离的原理a.免疫磁珠法的原理b.尼龙毛柱分离法的原理c.贴壁粘附法的原理d.Percoll 分层液法的原理5.T 细胞分离的应用6.总结正文(篇2)T 细胞是免疫系统中的一种重要细胞类型,它在免疫应答中起着关键作用。
T 细胞的分离和纯化对于研究免疫系统和疾病机制具有重要意义。
本文将介绍 T 细胞分离的方法和分离原理。
三种提取质粒的方法及原理
三种提取质粒的方法及原理《三种提取质粒的方法及原理》一、离心法离心法是最常用的一种提取质粒的方法,它通过离心力的作用,使细胞或质粒(例如DNA、RNA等)从悬浮液中分离出来,从而得到提取的质粒。
分离过程如下:1.从对象(例如细胞)上提取纯化的质粒,使其形成悬浮液。
2.将所得悬浮液置于微量离心机中,加入适当的离心剂,并配置合适的离心条件(如离心速度,离心时间)。
3.根据离心力,细胞及其他悬浮液的组分会在离心机的内壁及底部形成层,质粒则聚集在中心处,形成离心质粒。
4.把离心质粒从中心处取出,即可得到纯化的质粒。
二、丙酮离心法丙酮离心法是一种以丙酮、乙醇和水作为分离剂的提取质粒方法,它可用于提取活性质粒,如抗体、RNA和DNA等,这是因为丙酮和乙醇可以良好地维持质粒的活性,并可以使悬浮液以柱状分离,有利于质粒的提取。
丙酮离心法的分离过程如下:1.将所要提取的对象加入适当的提取液(如200 ml丙酮),形成悬浮液。
2.将悬浮液置于微量离心机中,并配置合适的离心条件。
3.由于丙酮和乙醇的作用,悬浮液以柱状分离,并形成梁状质粒在柱峰中。
4.把梁状质粒从柱峰中取出,即可得到纯化的质粒。
三、超滤法超滤法是一种用于提取质粒的物理分离方法,它通过扩散作用及滤膜孔径的大小,可以有效地将非蛋白质物质等从悬浮液中分离出来,而不改变其本身的结构和性质。
超滤法的分离过程如下:1.将所要提取的对象加入适当的提取液(如水),形成悬浮液。
2.将所得悬浮液置于微量超滤器中,并配置合适的超滤条件(如超滤压力、超滤温度)。
3.根据超滤的原理,液体及其他悬浮物质会被超滤滤膜过滤,而质粒则不会被过滤,从而被滤过的液体中提取出质粒。
4.把质粒从超滤液中取出,即可得到纯化的质粒。
细胞分离密度梯度离心原理
细胞分离密度梯度离心原理自从1977 年推出以来,二氧化硅胶体PercollTM 已经成为全世界数以千计的研究人员对密度梯度介质的选择。
其近乎完美的物理特征方便它在细胞、细胞器、病毒和其他亚细胞颗粒分离中的使用。
Percoll做为第一步在进行更高分辨率分离或核酸抽提前富集细胞是非常有用的。
人们会认识到在进行其他的这些方法前使用Percoll 做为第一步可以节省大量的时间和资源。
对于生物学颗粒,理想的梯度培养基被描述为具有以下特征:涵盖了足够的对于所有感兴趣的生物颗粒的恒定密度(图1) 带范围拥有生理离子强度和pH在全部梯度中是等渗的低粘度无毒性不会渗透生物膜无菌且可以重复灭菌在适度的离心力下将自动形成梯度和生物材料相容很容易从被纯化的材料中去除不影响分析程序不会猝灭放射性分析Percoll在现有的介质中是非常特殊的,它符合上述所有的标准,幵且提供以下附加的优点:它能形成连续梯度和不连续的两种梯度。
梯度的稳定性意味着梯度可以预制以提供可重复性的结果。
使用带颜色的Density Marker Beads进行梯度分析十分简单(GE Healthcare提供)。
Percoll 不影响被分离的材料进一步的研究。
数以千计的研究人员的成功已经记录在Percoll Reference List 中。
密度梯度离心原理当颗粒悬浮液被离心时,颗粒的沉降速率和应用的离心力是成比例的。
溶液的物理性质也会影响沉降速率。
在一个固定的离心力和液体粘度下,沉降速率和颗粒大小以及它自身密度与周围介质密度之间的差别成比例。
在一个离心范围中一个球体的沉降方程为:这里v = 沉降速率d = 颗粒直径(流体力学等效球体)ρp = 颗粒密度ρI = 液体密度η = 介质粘度g = 离心力从这个方程中,可以观察到下列关系:颗粒沉降速率和它的大小成比例。
沉降速率和它自身密度与周围介质密度之间的差别成比例。
当颗粒密度等于周围培养基密度时,沉降速率为0。
利用超速离心机对细胞进行分离的原理
利用超速离心机对细胞进行分离的原理超速离心机是一种利用离心力对混合物中的不同成分进行分离的设备。
在细胞分离中,超速离心机被广泛应用于细胞的分离和纯化。
下面将详细介绍利用超速离心机对细胞进行分离的原理。
超速离心机的原理基于沉降速度的大小和离心力的大小。
离心力被定义为物体在离心机转速下受到的离心力的大小,它的大小与物体的质量、转速和离心半径有关。
普通离心机的离心力一般在几千倍重力加速度(g)左右,而超速离心机的离心力可以达到几万至几十万倍重力加速度,因此可以更好地分离细胞。
细胞的分离通常是利用细胞的大小、形状、密度和离心力的关系来实现的。
在超速离心机中,细胞悬浮在溶液中,根据细胞的密度和大小,当离心力增大时,较重的细胞会向外部离心管壁沉降,而较轻的细胞则会停留在上层。
具体而言,超速离心机分离细胞的过程可以分为以下几个步骤:1.配置离心管:首先,需要准备好离心管,并将混合物样品装入离心管中。
2.设定离心机的转速和离心半径:根据实验的需要,设定好离心机的转速和离心半径,这将直接影响到离心力的大小。
3.启动离心机:启动离心机后,离心机开始旋转,产生离心力。
4.离心分离:细胞在离心力的作用下,根据其密度和大小进行分离。
较重的细胞会向外部离心管壁沉降形成沉淀,而较轻的细胞则会停留在上层形成上清液。
5.收集分离的细胞:离心机停止后,将离心管取出,并将上清液或沉淀液中的细胞转移到其他容器中,即可得到纯化的细胞。
需要注意的是,超速离心机分离细胞的效果受到多种因素的影响,例如离心力、离心时间、离心温度等。
合适的离心力和离心时间能够更好地将细胞沉降至底部或上层,并减少混杂物的存在。
此外,为了保持细胞的活力,最好在低温条件下进行离心实验。
总之,利用超速离心机对细胞进行分离是一种高效的方法。
它利用沉降速度的差异和离心力的大小来实现细胞的分离和纯化,可广泛应用于生物医学研究、生物制药、临床诊断等领域。
细胞膜分离离心的原理
细胞膜分离离心的原理
细胞膜分离离心的基本原理是:
1. 利用差速离心机的离心力,根据不同组分的密度和分子量的差异进行分离。
2. 首先破碎细胞,然后进行低速离心,沉淀出细胞核、线粒体等细胞器。
3. 取上清液,进行超高速离心,可以沉淀出细胞膜组分。
4. 细胞膜沉淀在离心管底部形成软团状沉淀。
5. 小心吸出沉淀物,即可获得富集了细胞膜脂质、蛋白质的Fraction。
6. 根据需要,可以采用密度梯度离心更好地分离纯净的细胞膜。
7. 也可以结合降解细胞内组分的适当胶体溶液,提高细胞膜的分离纯度。
8. 离心参数需优化,包括离心速度、时间、温度等,确保细胞膜完整。
9. 离心分离获得的细胞膜,可以进行组成分析、功能研究等。
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离心方法和原理差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低,让较大的颗粒沉降到管底,小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀,改用较高的离心速度离心悬浮液,将较小的颗粒沉降,以此类推,达到分离不同大小颗粒的目的。
密度梯度离心(density gradient centrifugation)用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。
密度梯度离心常用的介质为氯化铯,蔗糖和多聚蔗糖。
分离活细胞的介质要求:1)能产生密度梯度,且密度高时,粘度不高;2)PH中性或易调为中性;3)浓度大时渗透压不大;4)对细胞无毒。
密度梯度离心原理不同颗粒之间存在沉降系数差时,在一定离心力作用下,颗粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
密度梯度离心法density gradient centrifugation method〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。
用超离心机对小分子物质溶液,长时间加一个离心力场达到沉降平衡,在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。
若在该溶液里加入少量大分子溶液,则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降,比溶剂密度小的部分就会上浮,最后在重力和浮力平衡的位置,集聚形成大分子带状物。
利用这种现象,测定核酸或蛋白质等的浮游密度,或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。
自1958年米西尔逊(M.Meselson),斯塔尔(F.W.Stahl),维诺格拉德(J.Vinograd)成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以来,该法取得许多成果。
为得到必要的浓度梯度,多采用浓氯化铯溶液,所以有时也使用氯化铯浓度梯度离心法这个名称,还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。
通常利用分析超离心机,但在将细胞颗粒成分进行分离等以纯化为目的的情况,利用密度差,使用分离超离心机,采用预先制备好的蔗糖等的密度梯度。
〔2〕采用蔗糖等一些小分子溶液,预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度,在其上面再加上一层少量的大分子溶液后,离心,大分子就形成层状而沉降。
若含有沉降系数不同的许多成分,就会出现许多层。
这种情况采用适当的编排号码,取出样品池内的溶液,然后进行研究。
这是与〔1〕不同的一种沉降速度法,除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外,在能取出分离物这点上是有优越性的。
因多采用蔗糖密度梯度,所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。
按同样原理,也可使用分析超离心机进行测定。
差速离心法是根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别,分级增加离心力,从试样中依次分离出不同组分的方法。
差速离心法是交替使用低速和高速离心,用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。
此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。
密度梯度离心法是在密度梯度介质中进行的依密度而分离的离心法。
各组分会依其密度分布在与其自身密度相同的液层中。
密度梯度可以离心前预先制备或在离心中自然形成。
可用于分析型或制备型的离心分离。
1:密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的;差速离心法是用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离。
2:密度梯度离心只用一个离心转速,而差速离心用两个甚至更多的转速。
3:密度梯度离心的物质是密度有一定差异的,而差速离心是适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分。
二者都是依靠离心力对细胞匀浆悬浮扔中的颗粒进行分离的技术。
差速离心是一种较为简便的分离法,常用于细胞核和细胞器的分离。
因为在密度均一的介质中,颗粒越大沉降越快,反之则沉降较慢。
这种离心方法只能将那些大小有显著差异的组分分开,而且所获得的分离组分往往不很纯;而密度梯度离心则是较为精细的分离手段,这种方法的关键是先在离心管中制备出蔗糖或氯化铯等介质的浓度梯度并将细胞匀浆装在最上层,密度梯度的介质可以稳定沉淀成分,防止对流混合,在此条件下离心,细胞不同组分将以不同速率沉降并形成不同沉降带。
沉降系数(sedimentation coefficient)用离心法时,大分子沉降速度的量度,等于每单位离心场的速度。
或s=v/ω2r。
s是沉降系数,ω是离心转子的角速度(弧度/秒),r 是到旋转中心的距离,v是沉降速度。
沉降系数以每单位重力的沉降速度表示,(the velocity per unit force)并且通常为1~200×10-13秒范围,10-13这个因子叫做沉降单位S,即1S=10-13秒.沉降系数越大在离心时候越先沉降。
如血红蛋白的沉降系数约为4×10-13秒或4S。
大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间,核糖体及其亚基在30S和80S之间,多核糖体在100S以上。
定义沉降系数(sedimentation coefficient,s)根据1924年Svedberg(离心法创始人--瑞典蛋白质化学家)对沉降系数下的定义:颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。
To call the parameter which characterizes the movement of the particle at the centrifugal force place。
沉降系数是以时间表示的。
蛋白质,核酸等生物大分子的S实际上时常在10的-13次秒左右,故把沉降系数10的-13次秒称为一个Svedberg单位,简写S,量纲为秒。
[ Adopted unit ] second [ Another unit ] 1 svedberg = 1E(-13) sec [ SI unit ] second 因随溶剂的种类、温度的变化而变化,所以通常是换算成20℃纯水中的数值,进一步算出分子间无作用力和浓度为零时的外插值。
沉降系数是以分子量、分子形状和水等情况来决定,其作为生物体大分子的一个特征是很重要的。
编辑本段测定沉降系数通过分析离心机测定。
通常只需要几十毫克甚至几十微克样品,配制成1~2毫升溶液,装入分析池,以几小时的分析离心,就可以获得一系列的样品离心沉降图。
根据沉降图可以作样品所含组分的定性分析,亦可以测定各组分的沉降系数和估计分子大小,作样品纯度检定和不均一性测定,以组分的相对含量测定。
编辑本段测定原理沉降系数的测定原理就是在恒定的离心力场下测定样品颗粒的沉降速度。
因为样品颗粒很小,不能直接看到它们的沉降运动,所以把离心时样品颗粒的界面移动速度看作是样品颗粒的平均沉降速度。
通常使用Schlieren和吸收光学系统来记录界面沉降图。
在沉降图中样品界面一般表现为一个对称的峰,峰的最高点代表界面位置。
通常沉降系数测量精度为±2%,但是如果面界图型表现为不对称峰型,或希望沉降系数测量精度达到±1%或更小的情况时,按峰的最高点作为界面位置就不够了这时应该使用二阶距法计算界面位置。
基本原理物体围绕中心轴旋转时会受到离心力F的作用。
当物体的质量为M、体积为V、密度为D、旋转半径为r、角速度为ω(弧度数/秒)时,可得:F=Mω2r 或者F=V.D.ω2r (1)上述表明:被离心物质所受到的离心力与该物质的质量、体积、密度、离心角速度以及旋转半径呈正比关系。
离心力越大,被离心物质沉降得越快。
在离心过程中,被离心物质还要克服浮力和摩擦力的阻碍作用。
浮力F‘和摩擦力F’‘分别由下式表示:F’=V.D’.ω2r (2)F’’=f dr/dt (3)其中D}为溶液密度,f为摩擦系数,dr/dt为沉降速度(单位时间内旋转半径的改变)。
基本原理在一定条件下,可有:F=F’+F’’V.D. ω2r =V.D’ω2r + f. dr/dt dr/dt =Vω2r (D-D’)/f (4) 式(4)表明,沉降速度与被离心物质的体积、密度差呈正比,与f成反比。
若以S表示单位力场(ω2r=1)下的沉降速度,则S=V (D-D’)/f S即为沉降系数。
沉降系数对于生物大分子来说,多数在(1~500)×10-13秒之间。
为应用方便起见,人们规定1×10-13秒为一个单位(或称1S)。
一般单纯的蛋白质在1~20S之间,较大核酸分子在4~100S 之间,更大的亚细胞结构在30~500S之间。
以蛋白质为例溶液中的蛋白质在受到强大的离心作用时,如果蛋白质溶液的密度大于溶剂的密度,蛋白质分子就会下沉,在离心场中,蛋白质分子所受到的净离心力(离心力减去浮力)与溶剂的摩擦力平衡时,每单位离心场强度定值,这个定值即为沉降系数(sedimentation coefficient)。
沉降速度用每单位时间内颗粒下沉的距离来表示。
测定方法⑴样品:蛋白质⑵样品溶液与离心:将样品溶于缓冲液中,用一定规格的双槽分析池,一边加入溶液一边加入溶剂。
分析池与平衡池平衡重量,使平衡池比分析池轻0.5g 以内,然后分别装入分析转头。
抽真空。
开Schlieren光光源,选择工作速度,室温离心。
转动腔达到真空后离以机开始运转加速,此时在观察窗口可以看到离心图型。
达到工作速度后恒速离心。
以蛋白质为例待看到样品峰的尖端后即可以间隔照相。
照完相即可关机,取出样品液,清理转头和分析池。
照相用强反差显影冲洗后即得Schlieren光路沉降图形照片。
⑶沉降图像测量:Schlieren沉降图可以用比长仪,读数显微镜,或投影仪测量。
测量时把沉降图像的底片放于测量仪器上,使液面的垂直线与测量仪中的垂直线重合,然后用十字标线依次测量内参孔,液面,界面峰尖,和外参考孔的位置,每个图像至少读测三次,取平均值。
依次把每个图像依同样方法测量,把数据列成表。
(4)沉降系数S的计算:代入公式计算。
编辑本段图像分析当离心刚开始时如果见到有快速沉降的峰,几分钟内就到达分析池底部,一般多是由于样品发生部分聚合形成快速沉降的高聚物。
离心达速后样品的的记心图像显示一个对称的峰形,一般可以认为样品是离心均一的。
但是对样品的真正均一性还应用其他方法进一步检测,如电泳,层析等。
某些混合样品偶然亦会给出一个对称峰的。
峰形通常会随时间而扩展,这是由于样品扩散的结果。
但如果峰形扩展很快,则该样品可能是多分散性的。
如果离心图像中表现几个峰,说明样品中有几个组分,每一个峰代表相应组分的沉降界面,因此可以测定每一个组分的沉降系数值。
根据峰的面积可以测量组分的浓度值。
有时离心的图像表现出一个不对称的峰,这可能是由于下列几种情况所致。
①几个沉降系数接近的组分峰形重叠,②样品是多分散性的,其分子量分布不均匀,③某些相互作用强的高分子,其沉降速度对浓度依赖很大。
若测定于高浓度,在界面区由于浓度变化造成沉降速度不一致而致峰形呈不对称分布扩展阅读:1/question/3142112.html?si=12《生物化学实验》。