紫花苜蓿油菜素内酯基因DWF4的生物信息学分析Bioinformatics-abc
拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建
^8S^•研究报告・拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建韦春，杨莉琴，秦利军(贵州大学农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/生命科学学院,贵阳550025)摘要BRs(Brassinostcroids)是植物体内一种重要的类固醇激素，具有十分重要的生理功能。
DWF4是BRs生物合成的关键限速酶，显著影响BRs在植物体中的含量。
本研究以拟南芥(Araiidopsis thaliana)为材料，利用同源克隆技术从A.thaliana cDNA中克隆到全长为1542bp的特异性条带，测序结果表明该条带为ADWF4基因；生物学信息分析显示该基因可编码513个氨基酸(amino acid,aa),Proscalc在线预测该蛋白为亲水性蛋白，且SOPM分析表明DWF4蛋白含有c-螺旋(alpha-helix)、/?-折叠(beta-fold)、/?-转角(beta-angle)等多个二级结构。
同时，研究还构建了含AtDWF4基因的超量表达载体pRI201-RdI)wf4,并遗传转化烟草K326,已获得抗性愈伤组织及抗性芽。
本研究为进一步探究过表达ADWF4基因对烟草形态及抗逆胁迫能力的影响提供理想的实验材料。
关键词：拟南芥；BRs；DWF4基因；过表达载体构建DOI：10.16590,/ki.1001-4705.2021.01.001中图分类号：Q943.2文献标志码：A文章编号：1001-4705(2021)01-0001-06Cloning and Bioinformatics Analysis of Arabidopsis thaliana DWF4Gene and Construction of ADWF4-Overexpression VectorWEI Chun,YANG Liqin,QIN Lijun(Institute of Agro-Bioengineering,Key laboratory of Plant.Resources Conservation andGermplasm Innovation in Mountainous Region(Ministry of Education)and College ofLife Sciences,Guizhou University,Guiyang550025,China)Abstract：BRs(Brassinosteroids)is an important steroid hormone in plants,which has very importantphysiological functions.The DWF4is a key rate-limiting enzymein BRs biosynthesis,which significantly affects the content of BRs in plants.In this study,Arabidopsis thaliana was used as the material to clone the objective band.The results showed that a1542bp band from A.thaliana cDNA wascloned and the sequencing results showed that the band was AtDWF4gene.Bioinformatics analysisshowed that this gene encoded513amino acid(aa),and Proscale online predicted that this proteinwas a hydrophilic protein,and SOPM analysis showed that DWF4protein contained multiple secondary structures,including tough-helix,format-fold,and format-angle,etc.Meanwhile,the overexpression vector pRI201-RdDwf4containing AtDWF4gene was also constructed,and the resistant callus and resistant buds were obtained after the genetic transformation of tobacco variety K326.ThispaperprovidesanidealexperimentalmaterialforfurtherstudyingtheinfluenceofoverexpressionofAtDWF4on tobacco morphology and stress tolerance.Key words:Arabidopsis thaliana;BRs;DWF4gene;overexpression vector construction收稿日期2020-08-26基金项目贵州省科技计划项目“因草钾离子通道蛋白及BR对植株抗非生物胁迫研究”(黔科合LH：2016]7449号)；贵大人才培育项目“由菜素内酯介导的烟草抗TMV机理研究”(黔科合平台人才：2018]5781号)作者简介：韦春(1995—),女(壮族)广西河池人；在读硕士，主要从事植物基因工程相关研究(E-mail：*****************).通讯作者：秦利军(1982—)男(汉族)贵州遵义人；博士，副教授，硕士生导师，研究方向：植物生物技术与植物基因工程(E-nail：leequine_chin@126.com)。
油菜素内酯调控植物生长发育及产量品质研究进展
油菜素内酯调控植物生长发育及产量品质研究进展
油菜素内酯（BRs）是一类植物内源生长素内酯，对植物的生长发育及产量品质有重要影响。
本文综述了近年来有关BRs调控作物生长发育与产量品质的研究进展。
BRs具有调节植物生长发育和对逆境胁迫的响应的重要作用。
通过反式细胞质转运过程，BRs能够促进植物的细胞伸长和分裂。
此外，BRs还可以调节植物根系发育和植物的光合作用。
最近的研究还发现，BRs在植物的寿命和老化过程中也起着重要作用。
BRs在作物生产中的应用具有重要的价值。
BRs能够促进作物生长，增加氮素的吸收和利用，提高根系的生长和光合活性，从而提高作物的产量和品质。
研究表明，BRs的使用可以提高农作物的耐受性和抗逆性，改善作物的免疫功能。
通过基因工程技术和代谢工程技术，可以调节BRs的代谢和信号转导途径，从而调控植物的生长发育和产量品质。
例如，研究人员通过转基因技术将BRs合成途径的基因导入水稻中，增加了水稻的产量和氮素吸收能力。
此外，代谢工程技术可以通过调节BRs的代谢途径，从而优化农作物的产量和品质。
总之，BRs是一种重要的植物内源物质，对作物的生长发育和品质具有重要的影响。
通过基因工程技术和代谢工程技术，可以进一步研究BRs的调控作用，从而提高作物的产量和品质，为农业生产做出贡献。
油菜素内酯调控植物生长发育及产量品质研究进展
油菜素内酯调控植物生长发育及产量品质研究进展摘要：油菜素内酯（brassinosteroid, BR）是一类新型植物生长素，通过调控植物生长发育及产量品质发挥着重要的生物学作用。
本文综述了油菜素内酯的生物合成途径、信号转导途径，以及油菜素内酯参与植物生长发育、产量品质调控的研究进展。
研究发现，油菜素内酯通过诱导表达生长调节基因（Growth-regulating factors, GRFs）、增强省慧芝蛋白（proline-rich EXT-like receptor kinase, PERK）的活性等途径，促进茎秆和叶片的早期生长、侧枝分生、花荚的发育和产量的提高。
同时，油菜素内酯还能够提高品质指标（如粗草酸含量、芥酸含量等）和抗逆性，通过调节植物雄性生殖器官发育，可以改善花粉活力和花粉管长度，从而提高花粉对不利环境的适应能力。
Abstract:Brassinosteroids (BRs) are a novel type of plant growth hormone, which plays an important biological role in regulating plant growth and development, and improving yield and quality. This paper reviews the research progress of BR biosynthesis pathway, signal transduction pathway, and the involvement of BR in regulating plant growth, yield and quality. It was found that BR could promote the early growth of stems and leaves, lateral branch generation, pod development and yield improvement by inducing gene expression of growth regulating factors (GRFs), and enhancing the activity of proline-rich EXT-like receptor kinases (PERKs). At the same time, BR could improve quality indexes (such as crude oil acid content, erucic acid content, etc.) and stress resistance. Through regulating the development of male reproductive organs, it could improve the vitality of pollen and the length of pollen tubes, and thus enhance the adaptability of pollen to adverse environments.Key words: brassinosteroid; growth and development; yield and quality; regulation; pathway1. 引言油菜素内酯是植物体内一类新型的甾体激素，可以促进植物生长发育及提高产量品质，同时还具有提高植物抗逆性等生理效应（Wang et al., 2016）。
10_油菜素内酯生物合成与功能的研究进展zhuzq
植物学通报 2006, 23 (5): 543￣555* Author for correspondence. E-mail: hwxue@油菜素内酯生物合成与功能的研究进展储昭庆，李李，宋丽，薛红卫＊中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所植物分子遗传国家重点实验室, 上海 200032摘要 植物激素油菜素内酯广泛调节植物的生长发育及对外界环境因子变化的反应, 在作物上的应用也已引起人们的广泛兴趣。
通过遗传学等手段对相关突变体及功能基因的研究为其生物合成与功能研究提供了基础。
本文总结了油菜素内酯在植物各组织内的分布、生物合成、相关合成突变体及其编码基因的性质、生理功能以及与其它激素间的相互作用等。
关键词 油菜素内酯, 植物生长发育, 生物合成Advances on Brassinosteroid Biosynthesisand FunctionsZhaoqing Chu, Li Li, Li Song, Hongwei Xue *State Key Laboratory of Plant Molecular Genetics, Institute of Plant Physiology and Ecology, ShanghaiInstitutes for Biological Sciences, Chinese of Academy of Sciences, Shanghai 200032, ChinaAbstract Plant hormone brassinosteroid (BR) acts as an important regulator in plant growth and development,and responses to environmental stimuli. BR also regulates the agritraits of many crops. Analyses on mutant phenotypes and gene functions provide the information on BR biosynthesis and physiological roles. This review focuses on the BR recent progresses of BR biosynthesis and metabolism, the underlying signaling pathways, and further the interplay with other hormones.Key words brassinosteroids, plant growth and development, biosynthesis多羟基化的甾醇类激素(steroid hormones)广泛存在于真菌类、动物和植物中。
2,4-表油菜素内酯对盐胁迫下紫花苜蓿生理指标及根系离子积累的影响
Table 1 Effects of exogenous EBR on the growth of Alfalfa seedlings under salt stress
处理
根粗
根长
茎粗
பைடு நூலகம்
芽长
Treatment CK （对照，营养液） M1 (150 mM NaCl + 0.3 卩M EBR) M2 (150 mM NaCl +0. 6 卩M EBR) M3 (150 mM NaCl +1. 2 卩M EBR) NaCI (150 mM NaCl)
在农业生产中由于大量施用化肥、大水漫灌以 及气候等因素的变化，使得全球盐碱化土壤面积不 断扩增［1］o盐胁迫会导致渗透胁迫、离子毒害及离 子分布不平衡，阻止植物对矿质营养的吸收和摄取、 损害细胞的结构、扰乱细胞的生理代谢，严重影响植
物的生长发育［6］。同时盐胁迫影响植物叶片的光 合作用和呼吸作用，降低植物吸水性［］，抑制根系对 植物必需营养元素的吸收，造成植株营养亏缺［］,生 育期变短，最终导致作物减产［］。由于盐碱胁迫对 植物生长造成的巨大危害，寻找对盐碱胁迫具有抑
(宁夏大学西北土地退化与生态系统恢复省部共建国家重点实验室培育基地/西北退化生态系统恢复与重建 教育部重点实验室，宁夏银川750021)
摘要：为探讨2,4 -表油菜素内酯(2,4 - EpbrassiiolidCBR)对紫花苜蓿受盐胁迫的影响，本试验以紫花苜蓿'阿迪
娜'为材料，采用人工气候室水培试验，研究盐胁迫条件下喷施不同浓度的外源激素EBR对紫花苜蓿生理指标和
第6 期
王文静等：2,4-表油菜素内酯对盐胁迫下紫花苜蓿生理指标及根系离子积累的影响
1365
油菜素内酯调控植物生长发育及产量品质研究进展
油菜素内酯调控植物生长发育及产量品质研究进展油菜素内酯（Brassinosteroids，以下简称BRs）是一类植物类固醇内源性激素，通过调控植物生理生化过程来影响植物的生长发育和产量品质，是研究植物生长发育及育种领域的热点之一。
本文将综述BRs的生物学功能及其调控植物生长发育和产量品质的作用，为今后的研究提供参考。
一、BRs的生物学功能BRs是由甾体骨架构成的小分子化合物，具有生理活性，是植物体内内源性激素之一。
BRs可以调控植物的生长发育、抗逆性和产量品质等生物学功能，最早发现于端粒酶突变体DWARF中引起的半矮化现象，其后在许多植物物种中被发现存在，并显示出重要的生长调节作用。
除此之外，BRs还具有以下生物学功能。
（1）促进幼苗生长。
BRs能够促进幼苗生长和发育，加速种子萌发和幼苗生长，提高植株高度和生长速率，增加叶片面积和根系发育。
（2）抗逆性能。
BRs能够提高植物的逆境适应性，增加植物对逆境的耐受性。
在逆境条件下，BRs能够降低植物对干旱、盐碱、低温、高温等逆境的敏感性，增加植株的生存率。
（3）抗病性能。
BRs能够增强植物的抗病性能，提高植物对病原体的免疫能力，从而减少病害发生。
（4）调节花期和果实品质。
BRs能够调节花期和果实品质，提高果实的产量和品质。
在育种方面，将BRs作为生长调节剂使用能够增加单株产量和品质。
二、BRs调控植物生长发育和产量品质的作用BRs能够通过多个信号转导通路和调控因子，调节植物的生长发育和产量品质。
下面主要介绍BRs影响植物生长发育和产量品质的调控机制。
BRs能够调控植物生长发育的根系、茎干、叶片、芽和花部分的生长和发育。
主要表现为增加植株高度、增加叶面积、促进芽生长、缩短花期和延长生长期等特征。
其中，BRs通过调节植物的生长素信号转导通路，促进细胞分裂和伸长，从而促进植物的生长发育。
BRs对植物产量和品质具有重要作用。
在保证植物足够的营养和光照条件下，添加BRs 能够显著提高植物的产量和品质，主要表现为增加单株产量、提高品质等特征。
油菜素内酯的生物合成及信号转导研究进展
胞在形 成层 以外形 成 ， 与拟南芥 ｄ ｗ ｆ ７ — １ 突变体 的表型
种子发 芽 、 根茎 伸长生长 、 光形态 建成 、 维管束 分化 、 向性建 成和生殖 发育等发 育和生 长过程 中起 到重 大 的作用 ， 同时Ｂ Ｒ 还 具有增强植物抵 抗高温 、 低温和 高 盐等不 利生长条件 的功能 。
关键词 ： 油菜素 内酯； 生物合成 ； 信号转导 ； 进展 中图分类号 ： Ｑ９ ４ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ： １ ６ ７ ４ — ９ ３ ２ ４ （ ２ Ｏ １ ５ ） １ ９ － ０ １ １ １ － ０ ２
油 菜 素 内酯 （ ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｎ ｏ ｓ ｔ ｅ ｒ ｏ ｉ ｄ ｓ ， Ｂ Ｒ） 作 为 一类 甾醇 类 激素 ， 在植物体 内广泛分布 。油菜 素内酯在植物 的
一
相 同。 另外突变体维管束 的数 目减少到６ 个， 而野生型 有８ 个。 Ｃ ａ ｎ ｏ — Ｄ ｅ ｌ ｇ ａ ｄ ｏ 等报道两个Ｂ Ｒ 受体Ｂ Ｒ Ｌ １ 和Ｂ Ｒ Ｌ ３ 在 导管组 织 中特异性表达 ，而且 突变体ｂ ｒ ｌ ｌ 表 现出异 常 的韧皮部／ 木质部分化 比率 。
１ ． 细胞伸长 。Ｂ Ｒ 可促进黄瓜 的下胚 轴 、 豌豆和绿 豆的上胚轴 、 单子 叶植物 的中胚轴 和胚 芽鞘及幼苗茎 的伸长 ， 植物幼嫩 的营养器官对Ｂ Ｒ 响应尤其 明显 。 Ｂ Ｒ
通 过调控植物细胞液泡膜Ｈ ＋ － Ａ Ｔ Ｐ ａ ｓ ｅ 的组装 ，促进液 泡吸收水分 ， 从而引起细胞 的快速伸 长生长 。Ｙ ａ ｎ ｇ 等
的研究 表明 ， 油菜素 内酯 的转 录因子 Ｂ Ｅ Ｓ １ 可直接与全 部 的拟南芥纤维素合成酶基 因的启 动子区域结合 ， 开
启这些基 因表达 。
油菜素内酯在植物生长发育中的作用机制研究进展_郑洁
2． 1 对叶片扩张的影响 细胞的扩张与增殖的协调是保持器官正常生
长的必要条件，二者是由基因与环境因素共同影 响的。大量的研究结果表明油菜素内酯可以促进 植物细胞的伸长，但是关于油菜素内酯在细胞分 裂方面的作用一直存在争议。为了探究 BＲs 在 调节细胞分裂方面的作用，2000 年，Hu 等［25］发 现油菜素内酯处理可以上调周期蛋白 CycD3 的 表达，表明油菜素内酯可能对细胞分裂有所影响。
研究表明，油菜素内酯不仅可以通过对细胞 壁进行修饰来调节细胞的伸长，也可以通过对细 胞壁合成基因进行调控从而影响细胞壁的合成。 2011 年，Xie 等［12］ 以 拟 南 芥 BＲ 相 关 的 突 变 体 det2-1 和 bri1-301 为材料，利用染色质免疫共沉 淀的方法，证明油菜素内酯通过转录因子 BES1 结合纤维素合成酶基因（ 尤其是涉及初级壁合成 的基因） 的上游元件来调节纤维素的合成，从而 调控细胞的伸长。最近，Bai 等［13］将光、温度、BＲ 及 GA 的下游元件 PＲE、IBH1、HBI1 联系起来，证 明 PＲEs 可以通过抑制 HBI 的抑制子 IBH 发育中的作用机制研究进展
53
该酶缺失会导致植株的矮小，外施 BＲ 或者过表 达 CPD 的 cDNA，都 可 以 使 其 恢 复 野 生 型 的 表 型［5］。dwf4 突变株同样属于 BＲ 合成缺陷型矮化 突变体，除了油菜素内酯外任何激素都不能恢复 其矮小的表型［6］。水稻 BＲ 缺陷突变体 brd1（ BＲdeficient dwarf1） 具有节间几乎不能伸长、叶鞘缩 短、叶片短小且卷曲严重、分蘖少且不育的表型， 是水稻中第一个被发现的 BＲ 缺陷型的突变体。 外源施加 BＲ 后该突变体可以恢复表型。BＲD1 基因编码一个 C-6 氧化酶，属于早期的 C-6 氧化 途径，基因发生突变后部分有生物活性的 BＲ 成 分如香蒲兹醇、油菜素兹酮以及茶兹酮的含量会 降低，导致水稻植株矮化［7］。类似的 BＲ 缺陷型 突变株还有 bul1-1，该突变体细胞的伸长同样受 到了抑制，利用显微镜对其细胞进行观察发现与 野生型相比突变体中平行微管组织明显减少。该 基因编码一个 Δ7-甾醇-C-脱氢酶，该酶的缺失通 过影响植株体内油菜素内酯的含量从而影响了细 胞的结构，造成矮小的表型［8］。
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al.1998）
研究背景——DWF4基因功能
DWF4基因在模式植物拟南芥当中是编码细胞色素氧化酶CYP90B 1，
是BR（油菜素内酯）合成限速酶基因。
Campestanol和6-deoxo cathasterone能够使突变体表型恢复，其他中间产物 和植物激素都不可以，该试验说明DWF4基因所编码的细胞色素氧化酶在BR合
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Science
紫花苜蓿油菜素内酯基因DWF4的生物 信息学分析 Bioinformatics analysis of brassinolide DWF4 in Medicago Sativa
汇报人：刘文文 日 期：20180623
登录号
G7KDI9 A0A1S2YYQ0 A4PBE7 蛋白名称 Cytochrome P450 family protein cytochrome P450 90B1-like Cytochrome P450 enzyme
物种
蒺藜苜蓿 鹰嘴豆 豌豆
拉丁名 Medicago truncatula Cicer arietinum Pisum sativum
BR作为是一种发现较晚的一种植物激素，对其在植物体内的功能的重要
性是目前公认的，但其一些功能的具体作用机制还不甚清楚。
植物BR的研究主要集中于产量、品质以及植物性状的改良等。 由于对
BR的合成过程的研究己经较为明朗，目前对BR的研究主要集中在BR生物合成的 调控和信号转导上，且研究对象多是集中在模式植物拟南芥、水稻等，而对于
成路径中催化的是C-22经化反应(Choe etaL 1998)。
在拟南芥DWF4突变体中定量检测到有较高含量的C-22羟化反应的前体物质 的累积，表明CYP90B 1主要是用来催化C-22羟基化反应过程的。 DWF4基因通过异位表达能够显著提高植物体内羟基化BR（油菜素内酯）的 含量.
研究目的及意义
紫花苜蓿的BR合成及信号转导方面的研究较少。
紫花苜蓿具有高产、优质、抗逆性强、蛋白质含量高和适口性好等特点，因 此，对紫花苜蓿进行BR的分子生物学研究意义十分重大。
2
基因分析
DWF4基因的基本信息：紫花苜蓿中没有该基因登录号
物种
GeneID
拉丁名
登录号
长度
拟南芥
824229
Arabidopsis thaliana
紫花苜蓿
Medicago sativa
2302
2
基因分析
DWF4基因的基本信息（因紫花苜蓿基因组尚未发表，以蒺藜苜蓿为例） 以紫花苜蓿DWF4蛋白序列在蒺藜苜蓿基因组中进行BlastP比对（Ensemble数据 库中进行）
2
基因分析
将紫花苜蓿DWF4蛋白序列在Uniprot数据库中进行BlastP比对，结果如下：
2
基因分析
进化树及motif综合结果如下：
3
蛋白结构分析
• 一级结构分析
• 二级结构分析
• 亚细胞定位
• 三级结构分析
3
蛋白结构分析——一级结构分析
紫花苜蓿中的DWF4蛋白分子式 为 C2544H3946N674O695S20。
总共有 489 个氨基酸，相对分子 质量为 55.73kDa，理论等电点为 9.0，带负电的残基数( Asp + Glu) 为 48，带正电荷的残基数( Arg + Lys) 为 57。 DWF4蛋白出现频率较高的氨基 酸残基为 Leu( 11.7% ) 、 Lys( 7.4% ) 、ILe( 7. 0% ) ，且不具 有 Sec 与Pyl。 不稳定系数 40.87，可以推测此 蛋白质不稳定。 https:///protparam/
主要内容
1
目的及背景 基因功能分析 蛋白结构分析 总结
2
3 3
4
研究背景——紫花苜蓿
紫花苜蓿被誉为“牧草之王”, 是世界上分布最广、
最古老的栽培牧草, 也是我国种植面积最大的人工牧草。 而产量是紫花苜蓿长期以来的主要育种目标之一。
研究背景——DWF4基因的发现
1998年，Choe等人就从一个拟南芥T-DNA插入突变体中鉴定得到
NM_001339479.1
2092
玉米
100191562
Zea mays
XM_008669815.3
2052
胡杨
105110409
Populus euphratica
NM_001304313.1
1672
陆地棉
107896149
Gossypium hirsutum
NM_001326836.1
1565
Identity 96.5% 90.7% 89.3%
A0A151TI98
Cytochrome P450 90B1
木豆
Cajanus cajan
85.1%
细胞色素P450(CYP450)是一类超基因家族编码的血红素单加氧酶，参与
生物体内多种催化反应，主要分为生物合成和生物解毒两大类功能｡ 单家族簇：CYP51、CYP74 、CYP97、CYP710、CYP711、 CYP727和CYP746七个家族。 CYP72 多家族簇 CYP71 CYP85 CYP86
物种 拟南芥 玉米 胡杨 陆地棉 亚麻
拉丁名
Arabidopsis thaliana Zea mays Populus euphratica Gossypium hirsutum Linum usitatissimum
将以上蛋白序列下载并进行多序列比对和进化树分析，在MEME网站 （ ）中对其进行保守结构域分析，发现其有5个比较 保守的结构域， motif如下
CYP450
2
基因分析
CYP450存在保守的血红素结合域(Heme-binding region)FxxGxRxCxG， 同时也是判断一个基因是否属于CYP450家族的依据。
2
基因分析
同时以DWF4为基因名搜索，搜索其他物种 中相关同源基因，结果如下:
登录号
O64989 D7EYE5 G8D3C4 A0A1W4 A0A2D1GVF1 蛋白名称 Cytochrome P450 90B1 Steroid 22-alpha-hydroxylase protein Steroid 22-alpha hydroxylase Steroid 22-alpha-hydroxylase Cytochrome P450 monooxygenase