硝酸盐对硝酸还原酶活性的诱导及硝酸还原酶基因的克隆
硝酸还原酶活性测定实验报告
硝酸还原酶活性测定实验报告硝酸还原酶活性测定实验报告引言：硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内负责将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
硝酸还原酶活性的测定对于研究生物体对硝酸盐的代谢和环境污染物的检测具有重要意义。
本实验旨在探究硝酸还原酶的活性测定方法，并通过实验验证其可行性和准确性。
材料与方法：1. 实验材料：- 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 mol/L 硝酸钠溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵溶液- 1% 硫胺素溶液- 10% 硝酸盐还原酶提取液- 10% 硝酸盐还原酶抑制剂- 2% 硝酸盐还原酶底物溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵铵铁硫氰化物溶液- 0.1 mol/L 醋酸溶液- 蒸馏水2. 实验仪器：- 分光光度计- 定量移液器- 离心机- 恒温水浴槽- 试管架- 显微镜实验步骤：1. 提取硝酸盐还原酶：a. 取一定量的样品（如细胞或组织），加入磷酸盐缓冲液，用搅拌器充分破碎。
b. 将破碎后的样品转移至离心管中，以12000 rpm离心10分钟。
c. 取上清液，即为硝酸盐还原酶提取液。
2. 硝酸还原酶活性测定：a. 准备一组空白对照组，加入相同体积的磷酸盐缓冲液代替硝酸盐还原酶提取液。
b. 准备一组实验组，加入一定体积的硝酸盐还原酶提取液。
c. 分别加入一定体积的硝酸钠溶液、硫酸铵溶液、硫胺素溶液和硝酸盐还原酶底物溶液。
d. 在恒温水浴槽中，将反应体系恒温30分钟。
e. 加入硝酸盐还原酶抑制剂停止反应。
f. 加入硫酸铵铵铁硫氰化物溶液，使反应产生红色沉淀。
g. 加入醋酸溶液，混匀后离心10分钟。
h. 取上清液，以分光光度计测定其吸光度。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了一组吸光度数据。
根据吸光度与硝酸还原酶活性之间的关系，我们可以计算出样品中硝酸还原酶的活性。
在本实验中，我们采用了硫酸铵铵铁硫氰化物法测定硝酸还原酶活性。
该方法利用硝酸还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐，再与硫酸铵铵铁硫氰化物反应生成红色沉淀。
实验二 植物体内硝酸还原酶活力的测定
实验二 植物体内硝酸还原酶 活力的测定
NO3-和NH4+是能被植物利用的最主 要的氮源。在一般田间条件下， NO3- 是植物吸收的主要形式。
硝酸盐的还原
硝酸盐
硝酸还原酶
亚硝 酸盐
亚硝酸还原酶
氨
硝酸还原酶是一种诱导酶，在植酸还原酶。
V3——与磺胺等发生颜色反应的总体积（mL）； 5-1g 鲜样（诱导组和非诱导组分别进行），剪碎置冰箱冰冻30min，取出置研钵中，冰浴研磨成匀浆，转移入离心管中，洗研钵2-3次， 将液体转入离心管中，共用提取液6 mL，4℃ 8000rpm离心15min，上清液即为粗酶提取液。 植物生物学实验-植物生理部分 根据标准曲线计算出反应液中亚硝态氮浓度（µg/mL ）。 小麦的新鲜叶片（诱导组和非诱导组）
W ——样品质量（g）； 取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入试剂，配成0-0.
取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入试剂，配成0-0.
NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步 植物生物学实验-植物生理部分
NR的测定可分为活体法和离体法。
⑼移液管(5、2、1mL) ；
骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂， NO3- +NADH + H+
【实验步骤】
标准曲线制作
取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺 序加入试剂，配成0-0.20µg/mL的系列标准亚 硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min，然 后在540nm下比色测定。以亚硝态氮浓度 （µg/mL）为横坐标（X），吸光值为纵坐标 （r）建立回归方程。
管号
1234567
试剂 取量 mL
样品中酶活性（µg ·g-1·h-1）=
实验三 硝酸还原酶活性测定
3. 材料与试剂
两种处理的小麦： 两种处理的小麦：水 (ck)， KNO3（N） ， ） A液：磷酸缓冲液: 水: DNP溶液 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 液 磷酸缓冲液 溶液: 溶液 B液：磷酸缓冲液: KNO3: DNP溶液: 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 液 溶液
磷酸缓冲液(pH7.5): 0.2mol/L； KNO3溶液 0.2mol/L 溶液: 磷酸缓冲液 ； DNP (2-4-二硝基苯酚 溶液 1mmol/L； 蔗糖溶液 2.5mmol/L 二硝基苯酚)溶液 二硝基苯酚 溶液: ； 蔗糖溶液:
NO2-含量测定（磺胺比色法） 含量测定（磺胺比色法）
在酸性溶液中， 与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与α在酸性溶液中，NO2-与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与 萘胺偶联，形成紫红色的偶氮化合物。该偶氮化合物在 540nm有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（OD540）。 有最大吸收峰， 有最大吸收峰 可以用分光光度计测定（
酶反应要在暗条件下进行的原因是叶绿体在光合作用时可产生 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白， 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白，与亚硝酸还原酶同时存在时 可还原NO2- ，所以在暗条件下进行反应可阻止 所以在暗条件下进行反应可阻止NO2- 的继续反 可还原 以保证测定结果的准确。 应，以保证测定结果的准确。
处 理 A液 吸光度 [ NO2- ] NR活性 活性 B液 吸光度 [ NO2- ] NR活性 活性
（uMol/ml）（uMol/h•gfw） ） ）
（uMol/ml）（uMol/h•gfw） ） ）
H2 O KNO3 对照 [ NO2- ] （uMol/ml）= 0.0026＋0.359OD520 ） ＋ NR活性（ NO2- , uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重 ×0.5h） 活性（ 鲜重g× 活性 ） ）
植物体内硝酸还原酶活性的测定
植物体内硝酸还原酶活性的测定目的意义：硝酸还原酶是植物氮代谢中十分重要的一个酶，植物从土壤吸收硝酸盐后，首先催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，才能进一步转化变成有机含氮化合物。
在生产中可根据植物体内硝酸还原酶的活性变化，来确定氮肥的合理用量以及植物的氮素营养状况。
一、实验原理在酸性条件下，亚硝酸盐与重氮试剂对—氨基苯磺酸（或对—苯磺酰胺）及偶联试剂α-萘基乙烯二胺反应生成红色偶氮化合物。
红色偶氮化合物的颜色在2~3h内稳定，并在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
二、材料、设备及试剂1、材料川芎叶片、根茎和根。
2、设备冷冻离心机、分光光度计、天平、冰箱、恒温水浴锅、研钵、移液管、剪刀、离心管。
3、试剂(1) 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液称取30.0905g Na2HPO4·12H2O和2.4965g NaH2PO4·2H2O 加去离子水溶后，定至1L；0.1mol/L KNO3溶液称取2.5275g KNO3溶于250mL 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液中；（避光保存）0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液称取8.8640g Na2HPO4·12H2O和0.0570g K2HPO4·3H2O（很易吸水变潮）溶于1L去离子水中；(2) 亚硝酸钠标准溶液：准备称取分析纯NaNO20.9857g 溶于无离子水后定容至1000mL，然后再吸取5ml 定溶至1000mL，即为含亚硝态氮的1μg/mL的标准液。
(3) 1%磺胺溶液：1.0g无水对氨基苯磺酸溶于100mL 3mol/L HCl 中(25mL浓盐酸加水定容至100mL即为3mol/L HCl)；（注：磺胺比较难容，定容后最好用超声波促进溶解。
应避光保存！）(4) 0.02%萘基乙烯胺溶液：0.02g萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。
(5) 提取缓冲液：0.1211g半胱胺酸、0.0372g EDTA溶于100mL 0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液中。
硝酸还原酶的诱导与活体测定
植物生理研究技术实验报告实验二硝酸还原酶活性的测定硝酸还原酶的诱导与活体测定硝酸还原酶的诱导与活体测定一、实验目的硝酸还原酶是一种诱导酶，广泛地存在于高等植物的根、茎、叶等组织中，它是植物氮素代谢中一个非常重要的酶，此酶还直接影响到土壤中无机氮的利用率，从而对植物的生长、发育以及产量和品质产生影响。
所以，作物栽培中，有人认为此酶活性的大小，可作为作物产量的生理指标。
本实验通过磺胺(或对氨基苯磺酸)比色法测定硝酸还原酶的活性，来了解植物生长发育期间氮素的营养水平，为合理施肥提供科学依据。
二、实验原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中的关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关。
它作用于N03-使之还原为NO2-：N03-+NADH+H+→NO2-+NAD++H20产生的NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO2-含量的增加，即表现该酶活性的大小。
这种方法简单易行，在一般条件下都能做到。
NO2-含量的测定用磺胺比色法。
在酸性条件下，对氨基苯磺酰胺与NO2-形成重氮盐，再与a一萘胺形成红色的偶氮染料化合物。
反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。
增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。
这种方法非常灵敏，能测定每毫升含0.5µg的NaNO2。
硝酸还原酶活性的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
本次实验学习活体法对硝酸还原酶进行测定。
三、实验材料、设备和试剂1．实验材料小麦叶片2．设备(1)分光光度计(2)真空泵(或注射器) (3)天平(4)移液管(5)试管(6)离心管3．试剂(1)0．1 mol·L-1磷酸缓冲液，pH7.5。
贮备液A：称分析纯磷酸二氢钠(NaH2PO4)2.78 g，配成100mL，即成0.2 mol·L-1NaH2P04溶液；贮备液B：称Na2HPO4·12H2O 7.17 g，配成100 mL，即成0.2 mol·L-1 Na2HPO4溶液；用时取贮备液A 16 mL，贮备液B 84 mL混合，用蒸馏水稀释至200 mL，即成为0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液。
硝酸还原酶研究进展探索
硝酸盐对硝酸还原酶活性的诱导及硝酸还原酶基因的克隆_王利群
2 结 果
211 硝酸盐诱导对 NR 活性的影响 21111 诱导时间对植物幼苗不同组织 NRA 的影响 :适龄的 豌豆 ( Pisum sativum L . ) 、油菜 ( Brassica campestris L . ) 和番茄 (Lycopersicon esculentum Mill . ) 幼苗在光周期开始 2h 时用含 50mmolΠL 硝酸钾的 MS 培养基诱导 ,分别在诱导后 0 、2 、5 、8 、 11h 时采样 ,测定了不同组织的 NRA ,见图 1 。
将上述 PCR 扩增得到的 3 个片段用胶回收试剂盒回收 后 ,直接与 pUCm2T 载体连接 ,白色单菌落挑出扩增 ,抽提质 粒后酶切鉴定 ,各选择一个鉴定正确的菌落进行序列测定 , 得到全长为 2736bp 的 cDNA 序列 (测序结果未列出) 。
硝酸钾诱导 2h 对 NRA 已有明显影响 ,因此 ,选择 2h 的诱导 时间 ,用含 0 、10 、30 、50mmolΠL 硝酸钾的 MS 培养基来诱导矮 脚黄 ( Brassica chinensis L . cv. AJ H) 、小白菜 ( Brassica chinensis L . cv. XBC) 、抗热 605 青菜 ( Brassica chinensis L . cv. KR2605) 和番茄幼苗 ,测定了各种植物幼苗叶中的 NRA ,结果如图 2 所示 。几种植物幼苗经不同浓度的硝酸钾诱导后 ,叶中 NRA 均有所增加 。其中矮脚黄在硝酸钾浓度为 10mmolΠL 时 ,叶 中 NRA 达到最高 ,30mmolΠL 时基本相等 ,50mmolΠL 时有所下 降 。小白菜在 KNO3 浓度为 30mmolΠL 时 ,叶中 NRA 达到最 高 ,50mmolΠL 时也有所下降 。抗热 605 在三种诱导浓度下 , 叶中 NRA 都较高 , 没有显著差异 。番茄幼苗叶中 NRA 在 KNO3 浓度为 10mmolΠL 时最高 ,30mmolΠL 时略下降 。
硝酸还原酶活性的测定实验报告
硝酸还原酶活性的测定实验报告一、实验目的硝酸还原酶（NR）是植物氮代谢中的关键酶之一，其活性的高低与植物氮素利用效率密切相关。
本实验旨在掌握硝酸还原酶活性的测定方法，了解不同植物材料或不同处理条件下硝酸还原酶活性的差异，为进一步研究植物氮代谢机制和氮素营养调控提供依据。
二、实验原理硝酸还原酶能够催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐。
在一定条件下，产生的亚硝酸盐量与硝酸还原酶活性成正比。
通过测定反应体系中亚硝酸盐的含量，可以间接反映硝酸还原酶的活性。
本实验采用磺胺比色法测定亚硝酸盐含量。
在酸性条件下，亚硝酸盐与磺胺发生重氮化反应，生成重氮盐，再与 N（1-萘基）乙二胺盐酸盐（NED）偶联，形成红色偶氮化合物。
该化合物在 540nm 波长处有最大吸收峰，其吸光度与亚硝酸盐含量成正比。
三、实验材料、仪器与试剂1、实验材料选取新鲜的植物叶片，如小麦、玉米、大豆等。
2、仪器分光光度计、离心机、恒温水浴锅、移液器、研钵、容量瓶、刻度试管等。
3、试剂（1）01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液；（2）02mol/L KNO₃溶液；（3）1%磺胺溶液（磺胺溶于 30%乙酸中）；（4）002% N（1-萘基）乙二胺盐酸盐溶液（NED）；（5）5μg/mL 亚硝酸钠标准溶液。
四、实验步骤1、酶液提取称取新鲜植物叶片 05g，剪碎后放入研钵中，加入 5mL 01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液，在冰浴中研磨成匀浆。
将匀浆转移至离心管中，在4℃下以 10000r/min 离心 15min，上清液即为酶提取液。
2、反应体系设置取两支刻度试管，分别标记为对照管（CK）和测定管（T）。
对照管：加入 1mL 01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液和 1mL 02mol/L KNO₃溶液。
测定管：加入 1mL 酶提取液和 1mL 02mol/L KNO₃溶液。
将两支试管置于 30℃恒温水浴锅中保温 30min。
3、终止反应保温结束后，向对照管和测定管中分别加入 1mL 磺胺溶液和 1mL NED 溶液，摇匀，以终止反应。
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质体中被亚硝酸还原酶还原成 +TR 后， 才能被植物体利用
U
以合成氨基酸。+I 是这个代谢过程中的关键酶， 也是限速
［$］ 酶 ， 提高蔬菜中 +I 的活性， 不仅可降低蔬菜硝酸盐的含
量， 还可增加同等施肥条件下蔬菜的产量， 即提高肥料的利 用率。 本研究比较了硝酸盐诱导对不同蔬菜 +I 活性 （+IN） 的 影响， 确定了 +IN 较高时的外界条件， 用 I93OPI 方法从番 茄根和叶中分离出目的片段。克隆后测序结果表明， 获得了 为后续通过基因工程手段提高蔬菜 +IN +I 的全长 H8+N， 的研究打下基础。
!" 卷 # 期 $%%& 年 " 月
生 物 工 程 学 报 !"#$%&% ’()*$+, (- .#(/%0"$(,(12
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［&］ （根、 茎或） 进行 +IN 的测定， 测定方法参照陈薇等 +IN
中图分类号
硝酸盐是强致癌物亚硝胺的前体， 过量摄入会诱发动物
［!］ 。蔬菜作为硝酸盐的最主要摄入源， 其硝酸 消化器官癌变
盐污染引起了国内外学者的普遍关注。 硝酸盐被植物体吸收后， 首先必须在根或叶肉细胞质中 由硝酸还原酶 （+I） 还原成 +L$ ， 在 +L$ 被迅速运进质体，
硝酸盐对硝酸还原酶活性的诱导及硝酸还原酶基因的克隆
王利群 王 勇 董 英 王文兵"
（江苏大学生物与环境工程学院生命科学研究院， 镇江 $!$%!&）
摘
要
硝酸盐在植物体内的积累过多已成为影响蔬菜品质并影响人类健康的重要因素。硝酸还原酶 （ +I） 是硝
用活体测定法检测了 酸盐代谢中的关键酶， 提高其活性有利于硝酸盐的降解。为了解植物不同组织中 +I 的活性， 经 #%00()JK 的 6+L& 诱导不同时间后的油菜、 豌豆和番茄幼苗根茎叶中 +I 活性， 同时为了明确外源诱导剂浓度与 植物体内 +I 活性的关系， 检测了经不同浓度 6+L& 诱导 $M 后的矮脚黄、 抗热 5%#、 小白菜和番茄叶片中的 +IN。结 叶中 +I 活性较高， 根其次， 茎最低； 不同植物的 +I 活性随诱导时间呈 果表明， 不同植物组织 +I 活性有很大差异， 不同植物叶片 +IN 为最高时 6+L& 浓度不同。用 不同的变化趋势， 相同植物不同组织的 +I 活性变化趋势相似； 从番茄根和叶中提取总 I+N， 用 I93OPI 方法获得 +I H8+N， 全长 $4&51.， 编码 &%00()JK 的 6+L& 诱导番茄苗 $M 后， "!! 个氨基酸。为进一步利用该基因提高植物对硝酸盐的降解能力打下基础。 关键词 硝酸还原酶，OPI，克隆，序列分析 Q4:! 文献标识码 N 文章编号 !%%%3&%5! （$%%&） %#3%5&$3%R 光灯， 光强 !#%% )=， 光周期为 !RMJG， 约 $ 周后作为实验材料。 !"# 试剂 9IZ[LK 购 自 \?1H( ]IK 公 司。 3+4 酶、 56 3+4 酶 购 自 9<6<I< 公 司。 ,D.-2,H2?./9Y 逆 转 录 试 剂 盒 购 自 ZA^?/2(B-A 公 司。胶回收试剂盒购自上海华舜公司。 ._P039 载体购自上 海生工公司。8T# !为本实验室保存。 !"$ 引物设计与合成 根据 +P]Z 数据库中的 +I H8+N 序列设计了 & 对引物， 引物 由 上 海 生 工 公 司 合 成。 （ !） 上 游 引 物 O! ： #‘3NPP N9\ 下 游 引 物 O$ ： \P\ \PN 9P9 \9\ \NN3&‘， #‘39NP PNN 9P9 （$） 上游引物 O& ： P9P PP9 9\9 \N3&‘。 #‘’ 39NP P\N 9\N \NP 下游引物 OR ： PP9 PNN PN3&‘， #‘399N \NN PNP PNN 9N\ 99P （&） 上游引物 O# ： P93&‘。 #‘3N99 P9\ PN\ N9\ \P\ \PN 9P9 下 游 引 物 O5 ： \9\3&‘， #‘3\N\ 9P9 N\N 99N \NN PNP PNN 9N\3&‘。O!、 O$ 和 O&、 OR 是为方便测序而设计的分段引物， O#、 O5 是为全长 H8+N 设计的引物。 !"% &’( 的测定 将适量的幼苗根部浸泡在含 +L& S 的 Y, 培养基中进行 诱导， 一定 时 间 后 取 样， 冲 洗 根 部， 吸 干 水 分， 取不同组织
图+ 诱导时间对不同植物幼苗根和叶中 !"# 的影响 P8*O + 0HQ)35H75 (Q 8HD378H* 98’5 (H !"# 8H )5RQ RHD 6((9 (Q D8QQ565H9 4)RH9 E55D)8H*E … O "((9； & O .5RQ； ! O >()5； " O =5R； # O /(’R9(
- 结
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果
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硝酸盐诱导对 %$ 活性的影响
豌豆 （ &’()* ("+’,)* $ O ） 、 油菜 （ -."((’/" /"*01(+.’( $ O ） 和番茄 幼苗在光周期开始 %, 时用含 （ $2/301.(’/34 1(/)514+)* 6’55 O ） 分别在诱导后 -、 ?-’’()A. 硝酸钾的 :2 培养基诱导， %、 ?、 J、 测定了不同组织的 !"#， 见图 +。 ++, 时采样， 不同植物的 !"# 差异较大。 !"# 还具有组织特异性， （数据未列出） 。叶和根的 在这几种植物中， 茎的 !"# 最低 叶和根的 !"# 随植物种的不同有较大差别。在豌豆幼苗中， 总体上叶的 !"# 稍高； 油菜叶中 !"# 远高 !"# 相差不大， 于根； 番茄在未诱导时叶中 !"# 较高， 诱导后根中 !"# 增加 较快， 根和叶中 !"# 差距较小。不同植物的 !"# 随诱导时 间的增加呈现不同的变化规律。在试验时间内， 豌豆的根和 叶中 !"# 逐渐增加并达到峰值， 随后有所下降， 峰值时间为 J ,。油菜的根和叶中， !"# 随时间的增加一直升高， ++ , 仍 无下降趋势。而番茄幼苗诱导 % , 后， 根和叶的 !"# 分别达 随后又逐渐上升。这为在 到最高和较高， ? , 降至较低水平， 后续试验中选择诱导时间以提高 !" ’"!# 丰度并克隆该基 因提供了依据。 -"!"诱导剂浓度对植物叶中 !"# 的影响： 根据以上实验， -"图% P8*O % 诱导剂浓度对植物幼苗叶片 !"# 的影响 0HQ)35H75 (Q 7(H75H96R98(H (Q S!$< E()398(H (H !"# 8H )5RQ (Q D8QQ565H9 4)RH9 E55D)8H*E
硝酸钾诱导 %, 对 !"# 已有明显影响， 因此， 选择 %, 的诱导 时间， 用含 -、 +-、 <-、 ?-’’()A. 硝酸钾的 :2 培养基来诱导矮 脚黄 （ -."((’/" /7’414(’( $ O /, O %89 ） 、 小白菜 （ -."((’/" /7’414(’( 、 抗热 K-? 青菜 （ -."((’/" /7’414(’( $ O /, O <=M K-?） $ O /, O :-;） 和番茄幼苗， 测定了各种植物幼苗叶中的 !"#， 结果如图 % 所示。几种植物幼苗经不同浓度的硝酸钾诱导后， 叶中 !"# 均有所增加。其中矮脚黄在硝酸钾浓度为 +-’’()A. 时， 叶 中 !"# 达到最高， <-’’()A. 时基本相等， ?-’’()A. 时有所下 叶中 !"# 达到最 降。小白菜在 S!$< 浓度为 <-’’()A. 时， 高， ?-’’()A. 时也有所下降。抗热 K-? 在三种诱导浓度下， 叶中 !"# 都 较 高， 没 有 显 著 差 异。番 茄 幼 苗 叶 中 !"# 在 S!$< 浓度为 +-’’()A. 时最高， <-’’()A. 时略下降。
收稿日期： 修回日期： $%%&3%&3!4， $%%&3%53!&。 基金项目： 江苏省教委自然科学研究项目基金资助 （ +(* %!678##%%%!） 和国家教育部重点项目基金资助 （ +(* %$%#4） 。 " 通讯作者。 9-)：:53#!!3:4"45%4；;<=：:53#!!3:4"!"$&；>30<?)： @-A1?AB@<ABC DEF* -GD * HA