课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
专题2课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
➢实验目的 从土壤中分离分解尿素的细菌并计数
培养基中以尿素为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生
➢实验原理 物才能分解尿素，缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿
素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所 以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
➢实验材料 小铁铲、培养皿、试管、移液管、锥形瓶等
（二）制备培养基 实验组：制备选择培养基 （尿素为唯一氮源的培养基）
筛选出能够分解尿 素的细菌
对照组：制备完全培养基 （牛肉膏蛋白胨培养基）
与选择培养基做对照， 检测选择培养基是否具 有选择作用
➢实验步骤——【3】样品稀释与涂布
判断选择培养基是否 具有筛选作用
选择培养基 完全培养基
➢实验步骤——【3】样品稀释与涂布
（3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液
第一次做该实验时，可以将稀释的范围放宽一点，如可 以将103 ~ 107分别涂布到平板上培养。保证获得菌落数 在30～300之间、适于计数的平板
➢4】微生物的培养与观察
培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
➢实验步骤 实验结果
实验流程：
土壤取样 制备培养基 样品稀释涂布平板 微生物的培养与观察
菌落计数
（一）土壤取样 从富含有机物、潮湿、酸碱度适中的土壤中取样。铲 去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的
信封中。 铁铲和信封都要灭菌
“微生物的天然培养基”
数量最大、种类最多
大约70%—90%是细菌 细菌适宜在富含有机质，酸碱度接近中性的潮湿土壤 中生长，绝大多数分布在约3~8cm的土壤层。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
计算公式： 每毫升原液含菌数=400×104×每小格平均菌体数×稀释倍数
2.间接计数法（活菌计数法-菌落） （1）常用方法：稀释涂布平板法。 （2）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的 一个菌落是由一个活菌繁殖而成的。
培养基类型 实验组 以尿素为唯一
氮源的培养基
是否接种 目的
分离尿素
是
细菌
结果 只生长尿素细菌
对照组 牛肉膏蛋白胨
是
判断该培养基 生长多种微生物
培养基
有无选择性
二、研究思路 （一） 筛选菌株 （二）统计菌落数目 （三）设置对照
（二）统计菌落数目
1、显微镜直接计数： 利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里 样品中微生物的数量。
不加有机碳源 不加氮源 加入青霉素 加高浓度食盐 不加C、N源 石油是唯一碳源
自养微生物 固氮微生物 酵母菌和霉菌 金黄色葡萄球菌
自养固氮菌 能消除石油污染的微生物
4、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：
①从物理性质看此培养基属于哪类？ 固体培养基
②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
4、课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
二、研究思路
（一） 筛选菌株 （二）统计菌落数目 （三）设置对照
（一）筛选菌株
1、 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶 PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温 （930C）的DNA聚合酶。
3、例如： ①判断培养基中是否有杂菌污染：
2.2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课)
洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95%的乙醇、无水乙 醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格 内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清 洗直到干净为止。
例题
• 例1：用血球计数板对培养液中酵母菌进行计数，若 计数室为1mm×1mm×0.1mm方格，由400个小方 格组成，如果一个小方格内酵母菌过多，难以计数， 应先 稀释 后再计数。若多次重复计数后，算得每 个小方格中平均有5个酵母菌，则10mL该培养液中酵 母菌总数有 2×108 个。
解析 ：根据公式：5×400×10000×10＝2×108
• 例3（2008江苏高考31．）
（4）在整个实验过程中，直接从静置的培养瓶中取培 养原液计数的做法是错误的，正确的方法是 _和 培养后期的样液稀释后再计数 摇匀培养液后。再取样
（5）实验结束后，用试管刷蘸洗涤剂擦洗血球计数板
的做法是错误的，正确的方法
培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微 生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶 的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生 长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基（选 择培养基）就能够选择出分解尿素的微生物。
（二）统计菌落数目
1.显微镜直接计数 利用血球计数板，在显微镜下计算一定容
积里样品中微生物的数量。
尿素
1.0g
琼脂
15.0g
①从物理性质看此培养基属于哪类？ 固体培养基
②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
〖思考2〗该培养基对微生物 具有 （具有， 不具有）选择作用。如果具有，其选择机
制是 只有能够以尿素作。为氮源的微 生物才能在该培养基上生长
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
2.制备培养基：
制备两种培养基： 牛肉膏蛋白胨培养基（完全培养基）—对照组 尿素为唯一氮源培养基（选择培养基）-实验组
将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨 培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养 基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以 作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选 择作用。
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征 大肠杆菌的菌落呈黑色,有或无金属光泽
六.结果分析与评价
（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是 否筛选出菌落
对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明 培养基没有被杂菌污染；
牛肉膏蛋白胨培养基(完全培养基)中菌落数目 明显多于选择培养基，说明选择培养基已筛选出一 些菌落。
因此，还需借助生物化学方法对分离的细菌 作进一步的鉴定。(筛选后必鉴定)
五、课外延伸
1、对分离的菌种作进一步的鉴定，还 需要借助 生物化学 的方法。
2、在细菌分解尿素的化学反应中，细 菌合成的 脲酶 将尿素分解成了 氨 。 氨会使培养基的碱性 增强 ，PH 升 高 。因此，我们可以通过检测培养 基 pH 变化来判断该化学反应是否发 生。
以防被
致病微生物
感染，实验
后一定要洗手。
当堂训练
1.使用选择培养基的目的是（ C ） A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加
以区别
2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分
别是( D )
A.CO2和N2 C.CO2和尿素
B.葡萄糖和NH3 D.葡萄糖和尿素
（二）统计菌落的数目
采用什么方法可以统计每克土壤样品中究 竟含有多少这样的细菌呢？
2-2课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数研究思路（一）筛选菌株1、尿素是一种重要的氮肥，农作物（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为，这是因为细菌能合成。
2、PCR技术中使用的耐高温的酶是，它是从中分离出来的。
科学家能从中把筛选出来是因为，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是_ 。
点评：生物适应一定环境，环境对生物具有作用。
所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。
〖本课题使用的培养基——见旁栏资料〗〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是，提供氮源的的是，琼脂的作用是。
〖思考2〗该培养基对微生物（具有，不具有）选择作用。
如果具有，其选择机制是。
3、选择培养基是指特定种类的微生物生长，同时其他种类微生物生长的培养基（二）统计菌落数目1、在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是。
除此之外，也是测定微生物数量的常用方法。
【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。
公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量2、统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够时，_ 。
通过统计，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
因此，恰当的是成功地统计菌落数目的关键。
3、．为保证统计结果准确，通常将都涂布在平板上，培养后再选择的平板进行计数。
4、在设计实验时，一定要涂布至少个平板作为重复组，才能增强实验的说服力和准确性。
在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果，结果，意味着操作有误，需要重新实验。
〖思考3〗统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是_ 〖思考4〗第位同学的结果接近真实值。
你认为这两位同学的实验需要改进的操作是第一位同学需；第二位同学_ 。
5、统计的菌落数比活菌的实际数目。
因为当两个或多个细胞时，平板上观察到的只是菌落。
因此，统计结果一般用来表示。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【土壤中分解尿素的细菌的分离和计数】一、研究思路1．筛选菌株尿素是一种重要的肥，农作物不能直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为和CO2，才能被植物利用，土壤中的这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成。
可以利用这一特点，将其从土壤中筛选出来。
(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于_____ _生长的条件(包括营养、、pH等)，同时____ _或其他微生物生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
2．统计菌落数目(1)常用来统计样品中数目的方法是__________ _______。
即当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中。
通过统计平板上的，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。
例如每克样品中的菌株数= ,C代表 ,V代表 ,M代表。
通常统计出的菌落数比活菌的实际数目。
这是因为。
因此，统计结果一般用而不是活菌数来表示。
(2) 也是测定微生物数量的常用方法。
(3)细菌的数目还可以通过法来测定。
例如，测定饮水中大肠杆菌的数量，可将的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现色，可以根据培养基上的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。
在该实验中至少应取___个水样。
3．设置对照(1)设置对照的主要目的是排除实验组中___________对实验结果的影响，提高实验结果的。
例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需用______________________________ 作为空白对照。
(2)对照实验是指除了的条件外，其他条件都的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。
二、实验设计实验设计包括对实验方案，所需仪器、材料，用具和药品，具体的以及时间安排等的综合考虑和安排。
关于土壤中某样品细菌的分离与计数的实验操作步骤如下：1．土壤取样土壤微生物约70%～80%为，主要分布在距地表的近性土壤中。
人教版教学课件土壤中分解尿素的细菌的分离与计数定
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与记数
一、课题背景
1、尿素的利用
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。
2、细菌利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶
CO(NH2)
脲酶
+ H2O
+ CO2
NH3
.筛选菌株
1
.统计菌落数目
A
C
D
4.下列说法不正确的是（ ） A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。 5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（ ） A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐
[三]样品的稀释
应在火焰旁称取土壤10g。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板
为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。
《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》教案
课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、课题背景尿素是一种重要的氮肥，农作物不能（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为氨和CO2 ，这是因为细菌能合成脲酶。
二、研究思路（一）筛选菌株1、实验室中微生物的筛选，原理是人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
2、选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
3、配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。
例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养型微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养固氮微生物的微生物.加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。
（二）统计菌落数目1、常用方法：法当样品的稀释度足够时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中个活菌。
通过统计平板上的，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
1）注意问题①为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。
②统计的菌落数比活菌的实际数目。
这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是菌落。
因此，统计结果一般用来表示。
③利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是。
2）怎样计算2、也是测定微生物的常用方法。
（三）设置对照对照实验是指除了的条件外，其他条件都的实验。
满足该条件的称为对三、实验设计①土壤取样----土壤微生物主要分布在距地表 cm的近中性土壤中，约70％～90％为。
从富含、湿润的土壤中取样。
先铲去表层土 cm左右，再，将样品装入事先准备好的信封中。
②样品的梯度稀释-------分离不同的微生物采用不同的稀释度，③涂布平板与培养-----稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在间的平板进行计数。
将涂布好的培养皿放在适宜温度下培养。
培养不同微生物往往需要不同培养温度。
细菌一般在30～37℃培养1～2d，放线菌一般在25～28℃培养5～7d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d。
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课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【学习目标】
了解有关选择培养基的基础知识。
【预习案】
（一）筛选菌株
1.实验室微生物的筛选原理
2.选择培养基
（1）概念：
（2）作用：加入青霉素的培养基：不生长，等真菌能生长。
不加含碳有机物的无碳培养基：分离型微生物。
（二）统计菌落数目
1.显微镜直接计数
（1）原理：利用特定的或，在下计算一定容积的样品中微生物的数量。
（2）做法：每一个大方格边长为1mm ，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。
（3）优缺点：
优点：
缺点：
2.间接计数（活菌计数法）
（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
（2）计数：
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(m Ｌ)，M代表稀释倍数。
计算公式：每克样品中的菌落数＝
【探究案】
（一）实验设计
土壤中分解尿素的细菌的分离与记数步骤：1. ；
2. ；
3. ；
4. ；
5. 。
（二）操作提示
1.无菌操作
（1）取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要。
（2）应在旁称取土壤。
在附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
（3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在旁操作。
2.做好标记
注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。
3.规划时间
提高效率，在操作时更加有条不紊。
【练习案】
1．下列生物学实验操作，能够顺利达到实验目的的是（）
A．在固体培养基上涂布稀释的大肠杆菌培养液获得单菌落
B．在接种酵母菌的新鲜葡萄汁中通入无菌空气制作果酒
C．土壤浸出液接种于牛肉膏蛋白胨培养基上筛选分解尿素的细菌
D．在分离土壤中的尿素分解菌实验中，采集的土样经高温灭菌后，可以用于制取土壤稀释液
2．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是（）
①加尿素②不加尿素③加琼脂④不加琼脂⑤加葡萄糖
⑥不加葡萄糖⑦加硝酸盐⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦B．①③⑤⑧
C．②④⑥⑧D．①④⑥⑦
3.稀释涂布平板法分离分解尿素的细菌时使用的涂布器应保存在体积分数为70%的酒精中,取出后又要放在酒精灯火焰上引燃,这两步分别属于什么技术?（）
A．灭菌、灭菌B．消毒、消毒
C．灭菌、消毒D．消毒、灭菌
4.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌,下列实验操作不正确的是（）
A．将土壤用无菌水稀释,制备103～105稀释倍数的土壤稀释液
B．将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上
C．用加入刚果红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌
D．从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株。