四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化机理研究

四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化
机理研究
【摘要】目的观察四氯化碳腹腔注射制作大鼠肝纤维化模型时相关细胞因子
的变化，初步探讨四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化的机理。

方法以四氯化碳腹腔注射的方法[四氯化碳 mL (用花生油1∶6稀释)/次，每周3次，共14周]制作大鼠肝纤维化模型，设立正常、溶剂对照组，检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原含量;ELISA法检测转化生因子ββ1)、肿瘤坏死因子α);化学法检测血清氧化亚
氮(NO)。

肝行HE和Masson胶原染色，光镜下观察病改变，并按SSS计分系统进行评分。

免疫组化染色观察肝组织血小板源生长因子的变化，专业像分析进行图像分析。

结果与正常对照组、溶剂对照组比较，模型组血清ALT、AST、HA、LN、、NO、β1 、α明显升高
()，大鼠肝组织肝纤维化评分明显升高()，肝组织表达明显增多()。

结论促进相关细胞因子的表达可能是四氯化碳腹
腔注射致大鼠肝纤维化的机理之一。

【关键词】四氯化碳;肝纤维化;细胞因子
Abstract:Objective To investigate the variation of correlated cytokine when the rat models of hepatic fibrosis were induced by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride,and to the relevant molecular mechanism. Methods Rat models of hepatic fibrosis were made by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride at mL(diluted 1∶6 with peanut oil),three times a week,a total of 14 weeks. The normal and dissolvent groups were prepared as controls. Serum
β1 and α were detected by ELISA method. Serum levels of NO were detected by
chemical method. HE and Masson staining were conducted in hepatic tissues to observe pathological variations. Grades of hepatic fibrosis were evaluated
histological scoring system (SSS system). Immunohistochemical staining wa
liver,and professional software for image analysis was used. Results Carbon tetrachloride could increase obviously serum levels of ALT,AST,HA,LN,and
normaland dissolvent groups. The score of hepatic fibrosis in the model group increased significantly (). Carbon tetrachloride could increase the
The correlated cytokines was increased when the rat models of hepatic fibrosis were induced by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride.
Increasing the expression of correlated cytokines may be one of the molecular mechanisms of hepatic fibrosis in rat models induced by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride.
Key words:carbon tetrachloride; hepatic fibrosis; cytokine
肝纤维化(hepatic fibrosis)是肝脏对各种慢性损伤的一种修复反应，其特征是以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝内过多沉积。

在肝纤维化
的发生过程中，一系列的细胞因子被激活，在疾病的进程中发挥重要的作用。

常见的细胞因子有转化生因子ββ)、血小
板源生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子
α)、表皮生长因子(EGF)与ROS(过氧化氢、超氧游离基)等。

研究表明，相关细
胞因子的表达，可以引起肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化，促进肝纤维化的发生发展。

四氯化碳(CCl4)腹腔注射是制作肝纤
维化模型的经典方法，在前期的系列研究中
曾多次采用该方法成功地建立大鼠肝纤维
化模型[2-8]，但有关其作用机制尚未阐明。

既往的研究大多数为观察四氯化碳腹腔注
射造模的效果，国内少有对其作用机理方面的研究。

本研究拟观察CCl4制作肝纤维化模型时相关细胞因子的变化，初步探讨CCl4腹腔注射致大鼠肝纤维化的机理。

1 实验材料
主要药物、试剂
CCl4，分析纯，天津市北宏试剂厂生产;食用花生油;羧甲基纤维素钠，广州器化医疗设备有限公司进口分装;ALT、AST试剂盒，北京中生北控生物科技股份有限公司生
产;HA、LN 、放射免疫分析试剂盒，上海海岩生物技术中心生产;苏木素、伊红购自美国Sigma公司;Masson三色胶原试剂盒及即用型SP超敏试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司;NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所;大鼠β1、
αELISA试剂盒及兔抗大鼠
多克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有
限公司。

动物及实验
SPF级SD大鼠，雄性，体质量180～230 g，由广州中医药大学实验动物中心提供[合格证号：SCXK(粤，粤监证字2005A031]。

于广东省药物研究所标准SPF
实验室(粤监证字2005C125号)进行动物饲
养及实验。

2 方法
肝纤维化模型的建立
腹腔注射CCl4 mL (用花生油1∶6稀释)，每周3次，共14周。

动物分组与处理
30只SD大鼠随机分为模型组、正常对
照组、溶剂对照组，每组各10只。

模型组
予腹腔注射CCl4 mL (用花生油1∶6稀释)，每周3次，共14周;正常组不予处理;溶剂
对照组予腹腔注射花生油( mL/只/次)，每
周3次。

观察项目与方法
14周动物实验结束后，采用股静脉放血法最大量取血，分离血清，-20℃保存待检;留取部分肝组织于4%(φ)中性甲醛溶液固
定，部分于-170 ℃液氮中保存待检。

自动生化分析仪检测血清ALT、AST、HA、LN、，血清NO检测参照试剂盒进行，放射免疫方法检测β1、α;肝组织按常规方法行HE染色，参照试剂盒方法行Masson三色胶原染色，光镜下观察肝脏的病理改变，并按照肝纤维化半定量计分系统(SSS)方法，对各组大鼠肝纤维化程度评分，得分越高，表示纤维化程度越重，最高29分，最低0分。

SP免疫组化法检测肝组织，采用专业显微图像分析软件(AxioVision，版，Germany)进行图像分析。

方法
数据采用(±s)表示，用SPSS 统计软件进行统计学处理，多组数据间比较采用单因素方差分析，进行方差齐性检验，若各组总体方差齐同，采用
Tukey(n5)检验;若各组总体方差不齐同，采用检验。

为差异有显着性。

3 结果
肝功能指标及血清NO 与正常对照组、溶剂对照组比较，模型组大鼠血清中ALT、
AST活性及NO含量明显升高() ;正常组与溶剂组比较，差异无显着性()，见表1。

血清肝纤维化指标与正常对照组、溶
剂对照组比较，模型组血清中HA、LN、
明显升高 () ;正常组与溶剂组比较，差异
无显着性()(见表1)。

表1 各组大鼠血清ALT、AST、HA、LN、及NO含量的比较与正常对照组、溶剂对照组比较:﹟P
血清β1、α与正常对照组、溶剂对照组比较，模型组血清β1、α水平明显升高，差异有显着性();
正常组与溶剂组比较，差异无显着性()。

(见表2)。

表2 各组大鼠血清β1、α
的比较
与正常对照组、溶剂对照组比较:﹟P
肝病理 HE染色见正常组与溶剂组肝小叶结
构完整，肝索排列整齐，无炎症细胞浸润;
模型组肝小叶结构被破坏，肝索排列紊乱，有炎症细胞浸润，肝细胞水肿、脂肪变性明显，部分可见假小叶形成，证实肝纤维化形成，造模成功。

Masson三色胶原染色示：正常组与溶剂。