分子生物学：第十一章分子生物学技术
分子生物学——原理与技术
分子生物学——原理与技术分子生物学是现代生物学中的一门重要科学，研究生物体的分子结构、功能和相互作用。
它是以DNA、RNA、蛋白质等重要分子为研究对象，探究它们的生物学意义，是基因工程和生物技术的理论基础，也是解决很多现代生物医学问题的关键。
一、 DNA、RNA和蛋白质分子生物学的研究对象包括DNA、RNA和蛋白质三种重要分子，这三种分子在细胞中各自发挥着至关重要的作用。
1. DNADNA（Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸），是构成基因的物质，是决定遗传信息及其表达的物质基础。
它由四种不同的碱基组成，分别是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（C）和胞嘧啶（G）。
DNA的结构像一条双链，两条链通过碱基互补配对而保持高度的稳定性和准确性，即A氢键与T 碱基配对，C氢键与G碱基配对。
2. RNARNA（Ribonucleic acid，核糖核酸），具有多种功能，如携带遗传信息、参与蛋白质合成、调节基因表达等等。
RNA的组成与DNA相似，同样由四种碱基组成，区别在于RNA中的胸腺嘧啶（T）被尿嘧啶（U）替代，且RNA是单链分子，而不是DNA的双链。
3. 蛋白质蛋白质是生物体内最重要的有机分子之一，也是分子生物学研究的重点之一。
蛋白质通过氨基酸的序列组成，不同的氨基酸序列决定了不同的功能和空间结构。
蛋白质在细胞中扮演着重要的角色，如酶催化反应、维持细胞结构、参与信号传导等等。
二、分子生物学基础技术分子生物学的研究方法主要包括分离、纯化、检测和克隆等技术手段。
下面就一些典型的实验方法进行说明：1. DNA分离与纯化方法（1）酚-氯仿：利用酚（Phenol）和氯仿（Chloroform）进行分离。
由于DNA对极性较弱，所以可以在酚-水界面处沉淀下来，然后利用氯仿分层，最后从水层中分离DNA。
（2）膜过滤：膜过滤法是利用孔径不同的膜进行分离纯化DNA。
一般使用微孔聚丙烯膜，按孔径大小可分为A、B、C三种不同的型号。
分子生物学-名词解释中文
第十章DNA的生物合成一、遗传学的中心法则和反中心法则：DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。
DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。
但在少数RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA中。
因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代；通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就称为反中心法则。
二、DNA复制的特点：1．半保留复制：DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semiconservative replication)。
DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M. Meselson 和F. Stahl 所完成的实验所证明。
2．有一定的复制起始点：DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点（复制子）。
在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。
3．需要引物(primer)：DNA聚合酶必须以一段具有3'端自由羟基（3'-OH）的RNA作为引物，才能开始聚合子代DNA链。
RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。
4．双向复制：DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。
但在低等生物中，也可进行单向复制。
5．半不连续复制：由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA链，因此两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。
以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在聚合时基本上是连续进行的，这一条链被称为领头链(leading strand)。
分子生物学 第11章
反式作用因子从功能上分析，其结构可包含不同区 域：DNA结合域、转录激活域、连接区
（一）蛋白质直接和DNA结合
在DNA结合结构域中具有一些特殊结构基序： 1. 螺旋-转角-螺旋结构基序
2. 锌指结构基序
3. 螺旋-突环-螺旋结构基序
4. 亮氨基拉链结构基序
5. 碱性结构域 6. Β折叠
•基元，基序或模序（motifs or modules） •在许多蛋白质中，有两个或三个具有二级结构的肽 段在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象， 称为基序。有的将这种规则的二级结构的聚集体称 为超二级结构，它们可直接作为三级结构的“建筑 块”或域结构的组成单位，是蛋白质发挥特定功能 的基础。 •类型：αα、ββ、αβα、锌指结构、亮氨酸拉链…
第11章 真核生物的基因表达调控
真核生物基因表达与调控与原核生物有很大不同
•原核生物同一群体的每个细胞都和外界环境直接接 触，它们主要通过转录调控，以开启或关闭某些基 因的表达来适应环境条件（主要是营养水平的变 化），故环境因子往往是调控的诱导物。 •而大多数真核生物，基因表达调控最明显的特征时 能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从 而实现“预定”的，有序的，不可逆的分化和发育 过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范 围内保持正常的生理功能。
1. 螺旋-转角-螺旋（Helix-turn-helix, HTH)
•HTH是第一个被确立的DNA结合结构。 很多细菌的调节蛋白是以螺旋-转角-螺旋这种基序 存在，如Lac阻遏蛋白，Trp阻遏蛋白、分解代谢激 活蛋白（CAP），λ噬菌体阻遏蛋白（Cro），噬菌 体434阻遏蛋白。在酵母中涉及交配型的a1和a2蛋 白以及在高等真核生物中的Oct-1和Oct-2也属于此 类型。
分子生物学：真核基因表达调控
真核基因表达的多级调控
在真核生物中基因表达的调节其特是
（1）多层次; （2）无操纵子和弱化子; （3）个体发育复杂; （4）受环境影响较小;
研究基因调控3个问题：
① 什么是诱发基因转录的信号？
基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，它 使细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是 基因活性调控的一种方式。
实例： 非洲爪蟾的卵母细胞中原有rRNA基因（rDNA）约500个拷
贝，在减数分裂I的粗线期，这个基因开始迅速复制，到双线 期它的拷贝数约为200万个，扩增近4000倍，可用于合成1012个 核糖体，以满足卵裂期和胚胎期合成大量蛋白质的需要。
二、基因扩增、基因重排和基因丢失
三、DNA甲基化与基因活性的调控
一、 染色质结构对转录的影响
按功能状态的不同可将染色质分为： （1）活性染色质（有转录活性） （2）非活性染色质（没有转录活性）
染色质的核小体发生构象改变，松散的染色质结构，便 于转录调控因子和顺式用元件结合和RNA聚合酶在转录模板上 滑动。
真核基因调控中虽然也发现有负性调控元件，但其存在并不 普遍；
顺式作用元件： 由若干可以区分的DNA序列组成，并与特定的功能
基因相连，组成基因转录的调控区，通过与相应的反 式作用因子结合，实现对基因转录的调控。
反式作用因子： 能直接地或间接地识别或结合在各类顺式作用元
件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白因子， 也被称为转录因子（TF）。
哺乳类基因组中约存在4万个CpG 岛，它们大多位于结构基 因启动子的核心序列和转录起始点，其中有60%～ 90% 的 CpG 被甲基化， CpG 岛在基因表达调控中起重要作用。
分子生物学实验技术分类
分子生物学实验技术分类分子生物学实验技术是现代生物学研究中不可或缺的一部分，它涉及到对生物体内分子结构、功能和相互作用的研究。
这些实验技术在基础科学研究、医学诊断和药物研发等领域发挥着重要作用。
在分子生物学实验技术中，根据其应用和原理可以进行分类，主要包括以下几类：1. 基因克隆技术，基因克隆技术是分子生物学研究中常用的技术之一，它包括DNA片段的定向克隆、质粒构建、DNA序列分析等。
通过基因克隆技术，研究人员可以将感兴趣的基因或DNA片段放入适当的载体中，进行进一步的研究和应用。
2. 蛋白质分离和纯化技术，蛋白质是生物体内重要的功能分子，其结构和功能的研究对于理解生物学过程至关重要。
蛋白质分离和纯化技术包括凝胶电泳、亲和层析、离子交换层析等方法，可以将混合的蛋白质样品分离并得到纯净的蛋白质。
3. 核酸分离和检测技术，核酸是生物体内的遗传物质，包括DNA和RNA。
核酸分离和检测技术包括DNA/RNA提取、聚合酶链式反应（PCR）、原位杂交等方法，可以用于检测和分析生物体内的核酸序列。
4. 基因组学和转录组学技术，基因组学和转录组学技术是对生物体内所有基因组和转录组的研究，包括全基因组测序、RNA测序、ChIP-seq等方法，可以帮助研究人员全面了解生物体内基因的组成和表达模式。
5. 蛋白质-核酸相互作用技术，蛋白质和核酸之间的相互作用对于细胞内的生物学过程至关重要。
蛋白质-核酸相互作用技术包括免疫共沉淀、荧光共聚焦、电泳迁移变性等方法，可以帮助研究人员研究蛋白质和核酸之间的相互作用。
以上是分子生物学实验技术的一些分类，这些技术的不断发展和创新为生物学研究提供了强大的工具，也推动了生物医学领域的进步。
在未来，随着技术的不断进步，分子生物学实验技术将继续发挥重要作用，为人类健康和生命科学研究带来更多的突破和进展。
分子生物学技术
三、DNA重组与DNA克隆
在应用限制酶切割基因DNA，获得带有平（或 粘性）末端的目的DNA片段之后，与应用同一种限 制酶（或不同限制酶但可产生相同末端的）切割后， 带有相同末端的载体的DNA分子，按一定比例混合， 经过DNA退火处理，在DNA连接酶的作用下，目的 DNA片段与载体DNA连接，形成新的含有目的DNA 片段的重组体的过程，即DNA重组。
★琼脂糖电泳
用于DNA分子量的测定用 于大片段DNA的分离，精 度低，但分离范围广
★ PAGE电泳 用于小片段DNA的分析 精度非常高
第二节
DNA分析技术
一、重组DNA技术
第一节 重组DNA技术
重组DNA技术（recombinant DNA technique）：
也称基因操作，是指将一种生物的DNA片段或人工 合成的基因，通过运载体在体外重组，转移并插入到另 一生物的基因组中，使其表达新的性状或用于进一步的 深入研究。
中央而交错切割，产生互补的单链末端，这种互补的 末端很容易连接，又称为粘性末端。
如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，
产生相同的粘性末端，混合后“退火”，这两种不
同的DNA分子彼此可以交错连接，形成重组DNA
分子。
三、 限制酶的命名：
限制酶是根据被发现的原核生物而命名的。 命名原则： ①第一个字母是细菌属名的第一个字母，要大写； ②第2、3个字母是细菌种名的前两个字母，要小写；
④有便于选择的标记基因（如抗药基因），以 便有利于选出转化细胞（带有外源基因的受体细 胞）。
常用的载体
根据克隆DNA片段大小的需要，常用的载 体有： 质粒
λ噬菌体
科斯质粒
酵母人工染色体
细菌人工染色体
（一）质粒(plasmid)
分子生物学电子教案第十一章
第十一章真核基因表达调控1．课程教学内容(1) 真核基因表达调控的特点(2) 真核基因表达调控的不同层次(3) 染色体水平的调控(4) DNA水平的调控(5) 真核基因转录水平的调节调控2．课程重点、难点真核生物基因表调控的特点、组蛋白乙酰化和DNA甲基化对基因表达的影响及机理、真核基因转录水平调控的机理。
3．课程教学要求（1）掌握真核生物基因表达调控的特点和方式；（2）掌握真核生物的多层次对基因的表达调控的机理和特点，理解真核生物与运河生物的基因调控的异同；（3）了解真核生物的其他表达调控方式。
▲真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约 4×106bp ，哺乳类基因组在109bp 数量级，比细菌大千倍；大肠杆菌约有 4000 个基因，人则约有 10 万个基因。
▲真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分 ( 如线粒体 DNA 等 )▲▲如前所述，细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元，共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron) 的 mRNA ；真核生物则是一个结构基因转录生成一条 mRNA ，即 mRNA 是单顺反子 (monocistron) ，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到▲原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中仅约 10% 的序列为蛋白质、 rRNA 、 tRNA 等编码，其余约 90% 的序列功能至今还不清▲原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子 (exon) 和内含子 (intron) ，转录后需经剪接(splicing) 去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节▲原核基因组中除 rRNA 、 tRNA 基因有多个拷贝外，重复序列不多。
分子生物学 第十一章 原核基因表达的调控
被cAMP激活 结合位点～22bp I -70 ~ -50
II -50 ~ -40
结合位点序列保守 不同基因受cAMP激活的水平不同
3 CAP的结合对DNA构型的影响
DNA弯曲 弯曲点位于CAP结合位点二重对称的中心 弯曲使CAP能与启动子上的RNA pol 接触
Summary
CA
B A: RNA polymerase B: lac repressor C: CRP-cAMP
Summary of lac operon regulation
Glucose High High Low Low
cAMP Low Low High High
Lactose Absent Present Absent Present
• 加入CAP，转录
• lac UV-5突变， -10区 TATGTT → TATAAT 在无CAP时，转录
• DNA topI 突变，降低起始转录对CAP的依赖
cAMP-CAP复合物的结合，使位点II附近的富含GC 区域双螺旋结构稳定性降低，因而-10区的熔解温度降 低，促进开放型启动子复合物的形成
9 原核生物基因表达的调控
9.1 基因表达概述 9.2 操纵元控制理论 9.3 基因转录的时序调控 9.4 转录后加工的调控 9.5 翻译水平的调控
孙朱乃玉恩贤
9.1 基因表达概述
9.1.1 生物遗传信息
9.1.1.1 C值矛盾 C value paradox
Genome DNA
10%; 结构基因的编码序列
triplet codon 90%; 重复，间隔，调节序列…
基因选择性表达指令 重要的遗传信息
.9.1.1.2 遗传信息的两大类别
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Excitation
SG
SG
SG SG
Emission
5’
3’
3’
SG
SG
SG
5’
TAQMAN法
EcoRⅠ G↓AATTC；HindⅢ A↓AGCTT C TTAA↑G TT CGA↑A
有一些限制酶的识别序列不是对称的，如 。
• AccBSⅠ CCG↓CTC；BssSⅠ C↓TCGTG GGC↑GAG GAGCA↑C
• 不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同，结果有三种 不同的情况：
①产生3’突出粘性末端（cohesive end）:以Eoor 为例 5’…G↓AATT C…3’ 3’…C ATAA↑G…5’
• [酶反应] 限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。 它能识别外源DNA并将其降解。
• 命名；一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母 组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同
大肠杆菌 DNA连接酶 以NAD＋提供能量 只能连接粘性末端
第二节 常用载体 （VECTOR）
定义：携带外源DNA进入宿主细胞并进行复制的运载工具称为载 体
• 种类：质粒、噬菌体、人工染色体等 • 特点：
• 具有自主复制能力； • 携带易于筛选的选择标志； • 含有多克隆位点（multiple cloning site,MCS）； • 只保留必要序列，便于导入宿主细胞和繁殖； • 使用安全。
PCR反应体系
• DNA模板（DNA template） • 引物（primer）
• 引物长度： 15-30bp。 • 引物 3’端的碱基要求严格配对。 • 引物内部出现二级结构。
• Taq酶（Taq DNA polymerase） • dNTP（ dATP,dGTP,dCTP,dTTP ） • Mg2+ （magnesium）
• 为DNA聚合酶活性所必需。 • 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 • Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增。
PCR循环的三个基本步骤
• 1. 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; • 2. 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与
②产生5’突出的粘性末端：以PstⅠ为例 5’…CTGCA↓G…3’ 3’…G↑ACGTC…5’
③产生平末端（blunt end）:Nru Ⅰ为例 5’…TCG↓CGA…3’ 3’…AGC↑GCT…5’
DNA连接酶(DNA ligase) ：
T4 DNA连接酶 以ATP提供能量 可以连接平末端和粘性末端
• 为引物，利用逆转录酶反转录成 cDNA。
• 以cDNA为模板进行PCR扩增，而 获得目的基因或检测基因表达
第四节 定量PCR原理与应用
▪非特异性荧光标记：SYBR Green ▪特异性荧光标记：
• TaqMan
• Molecular Beacon
• Amplisensor
非特异性荧光标记- SYBR GREEN SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与 细菌或细胞共生的遗传成分。
• 特点：
• 是染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed circuar DNA, cccDNA），可自然形成超螺旋结构
• 能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous replicon）。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传 给后代。
第十一章 分子 生物学实验技 术
第一节 分子生物学技术常用 酶类
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)
• 生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它 可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失 去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的 遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制 性内切酶(简称限制酶)。
一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶， 可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、 MboI等。
• 限制酶识别序列的结构 限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在
DNA 两条链相对称的位置。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 的识别序列和 切割位置如下：
SYBR Green
SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集 荧光信号。
非特异性荧光标记- SYBR GREEN
Excitation
5’
SG
SG SG
3’
3’
No Emission
SG
（lac Z’） • lac Z’基POLYMERASE CHAIN REACTION，聚合酶 链式反应)
PCR是一种根据体内DNA复制原理，在体外扩增DNA的技术。主要用于 在体外扩增特异DNA片段，它可以在短时间内在试管中获得百万特异 DNA序列拷贝。
• 质粒对宿主生存并不是必需的
• 质粒分子结构
pBR322：
• 全长4361bp。
• 携带氨卞青霉素抗性基因 （ampr）和四环素抗性基因 （tetr）。
• 具备复制起点ori。
• 具有较高的拷贝数，每个细胞 中可累积1000-3000份拷贝。
pUC18/19:
• 包含ori和ampr • E.coli 乳糖操纵子调节基因 lac I,启动子Plac,β-半乳糖苷酶α肽链
模板上的目的序列通过氢键配对;
• 3. 延伸(Extension): DNA模板—引物结合物在TaqDNA 聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，按碱基配对原理，合成一条 新的与模板DNA 链互补的DNA链。
RT-PCR:
• 提取组织或细胞中的总RNA • 以其中的mRNA作为模板，以：
• Oligo（dT）或 • 随机引物或 • 基因特异性引物