柑橘黄龙病常规PCR检测技术研究与初步应用
柑橘黄龙病PCR检测方法
柑橘黄龙病PCR检测方法有付出有风险才有收获的，而且种植柑橘是不可能一帆风顺的，柑橘和人一样也会生病，有叶片的，有树干的，有果实的。
这篇文章让我们来了解一下柑橘的黄龙病，那什么是柑橘黄龙病呢？柑橘黄龙病的PCR检测方法是什么呢？我们又应该如何预防柑橘黄龙病呢？1，柑橘黄龙病和人生病一样，柑橘的黄龙病也有一个进程。
柑橘得了黄龙病后，首先柑橘的叶片会发黄、变的脆、硬容易一掐就掉，叶片的脉络也会发肿，柑橘叶片的表面不再整齐不再有光泽，因此，早期我们可以通过观察柑橘叶片来大致判定柑橘是否病变。
其次是柑橘的树尖，柑橘的树尖会出现一个黄化现象，出现很多营养不良的树枝，该树枝会发黄，但发黄底下的树叶又是正常的！再次，是柑橘的花，得病的柑橘树容易提前开花，但花比正常的花更加容易凋落。
最后是柑橘树根的一个症状，树根会腐败坏死。
柑橘黄龙病的发病是从上往下的，不会直接从根系坏死，所以，平常我们就可以通过观察柑橘树的一个基本情况来防御治疗。
2，柑橘黄龙病PCR检测方法因为，显微镜检查对柑橘的黄龙病容易出现一个漏检，血清学方法范围又会相当于比较狭窄，所以，我们通常用PCR去检测柑橘是否患有黄龙病。
PCR中文名是聚合酶链式反应，即通过一些仪器设备去检测柑橘体内病原体的DNA序列看是否和黄龙病的DNA序列一致，因此来判定柑橘是否患有黄龙病。
3，柑橘黄龙病的预防（1）加强柑橘苗的检查，严禁得病的种子和苗流入市场，防止刚开始种植柑橘而不了解此种疾病的人误选误种！（2）一旦发现有黄龙病的发生，马上处理！柑橘感染黄龙病后只会越来越严重，还有可能传染给其他健康树苗，所以，当发病后，应当把得病的果树连根挖起，将病枝病叶用火烧毁。
（3）柑橘木虱是传染黄龙病的媒介，因此我们应尽量消除柑橘木虱，切除因得了黄龙病而发黄的树枝树叶，饿死木虱。
以上是关于柑橘黄龙病的一些相关知识，种植柑橘的农户也不要怕这个黄龙病，只要预防治疗得当，它根本不值一提。
也希望以后大家能略微了解下柑橘黄龙病PCR检测方法，方便以后的管理。
柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定
柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定柳州市是广西重要的柑橘生产基地之一，然而柑橘黄龙病是严重威胁柑橘产业的一种重要病害。
柑橘黄龙病是由黄龙病杆菌引起的一种传播较快的细菌性病害，其在柳州市柑橘园中的发生频率较高。
对柑橘黄龙病的快速检测及代谢物鉴定具有重要意义。
QPCR（Quantitative PCR）是一种快速准确的分子生物学方法，可用于检测柑橘黄龙病病原体的存在及数量。
QPCR方法结合了PCR技术和荧光探针技术，能够在短时间内明确检测到目标DNA的数量，并且还可以区分出不同的细菌菌株。
QPCR技术被广泛应用于植物病原体的检测中。
针对柳州市柑橘黄龙病的QPCR检测，首先需要针对黄龙病杆菌的DNA进行提取。
提取后的DNA样品可以直接用于QPCR检测，通过引入特定的引物和探针，配合荧光检测系统，即可在PCR反应过程中定量检测病原体DNA的存在量。
通过对已发病和未发病柑橘叶片进行QPCR检测，可以判断病原体在植物体内的数量，从而评估病害的程度和传播速率。
除了快速检测柑橘黄龙病病原体的存在数量外，还有必要对患病柑橘的代谢物进行鉴定。
病害对植物的影响不仅仅局限在外部症状上，还会影响植物内部的代谢活动。
通过代谢物鉴定可以全面了解患病柑橘的生化变化，为病害防治提供更多的参考信息。
代谢物鉴定的方法有很多种，包括色谱-质谱联用技术（GC-MS、LC-MS）、核磁共振技术（NMR）、红外光谱技术（IR）等。
这些方法都能通过分析样品中不同代谢物的特征峰或峰面积，鉴定出代谢物的种类和含量，从而揭示植物的生化变化。
对于柑橘黄龙病，代谢物鉴定可以分析出植物叶片中的酚类化合物、萜类化合物、胺类化合物等代谢产物的变化情况。
这些化合物的变化不仅反映了植物的生理状态，还可以作为植物对病害的抗性指标。
通过代谢物鉴定，可以找到与抗性相关的代谢产物，为后续的遗传改良和植物保护提供重要的信息。
柳州市柑橘黄龙病的QPCR检测及代谢物鉴定是一项有益的研究工作。
梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究与应用
梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究与应用梅州地区是广东省著名的柑橘产区之一，柑橘种植业在当地占据着极为重要的地位。
近年来，柑橘黄龙病成为了梅州地区柑橘产业发展面临的一个严重问题。
柑橘黄龙病是由念珠病菌引起的一种植物病害，主要侵害柑橘类植物，导致柑橘叶片出现黄化、叶缘卷曲、果实变形等症状，严重影响了柑橘的产量和质量。
及早检测和控制柑橘黄龙病对于保障梅州地区柑橘产业的健康发展具有重要意义。
随着分子生物学技术的不断发展，PCR（聚合酶链式反应）技术成为了检测植物病原体的重要手段之一。
常规PCR和实时荧光定量PCR作为PCR技术的两种主要变种，分别具有其特定的优势和应用范围。
本文将探讨梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术在病原体检测与疾病防控中的应用，为柑橘黄龙病的早期监测和有效管理提供技术支持。
一、柑橘黄龙病的病原体柑橘黄龙病的病原体为念珠病菌，是一种革兰氏阴性细菌，其主要传播途径为柑橘落叶介壳虫。
念珠病菌在柑橘树中引起内生细菌病，导致植物出现黄化、叶片卷曲、果实变形等症状，严重影响柑橘的生长和产量。
目前，柑橘黄龙病已经成为全球性的柑橘病害，对柑橘产业造成了严重威胁。
二、常规PCR技术在柑橘黄龙病检测中的应用常规PCR技术是通过DNA扩增的方法来检测特定的基因序列，其操作流程相对简单，灵敏度较高，通常用于病原体的快速检测和鉴定。
在柑橘黄龙病检测中，常规PCR技术可以利用念珠病菌特异性基因序列进行扩增，从而实现对念珠病菌的检测。
常规PCR技术的操作流程通常包括以下几个步骤：提取植物组织中的DNA样本、设计特异性引物进行PCR扩增、电泳分析扩增产物等。
通过常规PCR技术检测，可以快速获得样品中是否存在念珠病菌的信息，为疾病的早期监测提供了重要的技术手段。
实时荧光定量PCR技术是一种将PCR反应与荧光探针结合的新型PCR技术，其具有高度灵敏性、准确性和高通量性的特点。
梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究与应用
表1柑橘黄龙病常规PCR 扩增引物目的基因引物名称引物序列16S rDNAOI15′-GCGCGTATCCAATACGAGCGGCA-3′OI2c5′-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3′摘要本文利用TaqMan 探针实时荧光定量PCR (qPCR )检测技术对梅州地区疑似柑橘黄龙病样品进行检测,并与常规PCR 检测进行对比。
结果表明,实时荧光定量PCR 用于检测柑橘黄龙病菌结果快速、准确、可靠且无污染。
采用2种方法对梯度稀释的阳性样本进行检测发现,实时荧光定量PCR 的灵敏度较常规PCR 更高,能够检出样品中痕量的病原菌。
本研究在梅州地区建立了以实时荧光定量PCR 方法进行柑橘黄龙病疑似植株的检测,可以为梅州地区提供更准确、更灵敏、快速的黄龙病检测技术。
关键词柑橘黄龙病;实时荧光定量PCR ;灵敏度;广东梅州中图分类号S664.4文献标识码A 文章编号1007-5739(2020)08-0103-03开放科学(资源服务)标识码(OSID )Research and Application of Conventional PCR and Real-time Quantitative PCR Detection Technology for CitrusHuanglongbing in Meizhou AreaLI Yue 1ZHANG Zhi-biao 1ZHOU Yu-rong 1ZHONG Jin-liang 2MA Rui-feng 1LIU Rui 2HUANG Cheng 1TAO Xing-xing 1(1Meizhou Institute of Agriculture Sciences in Guangdong Province ,Meizhou Guangdong 514071;2Meizhou Institute of Fruit Research )Abstract In this paper ,TaqMan probe real-time quantitative PCR (qPCR )detection technology was used to detect suspected citrus huanglongb-ing samples in Meizhou area ,and compared with conventional PCR detection.The results showed that real-time fluorescent quantitative PCR for detecting citrus huanglongbing was fast ,accurate ,reliable and free pollution.Two methods were used to detect the gradient-diluted positive samples ,which showed that the sensitivity of real-time quantitative PCR was higher than that of conventional PCR ,and it could detect trace amounts of pathogenic bacteria in the samples.This study established a real-time quantitative PCR method to detect suspected citrus Huanglongbing plants in Meizhou area ,which could provide more accurate ,sensitive and rapid Huanglongbing detection technology in Meizhou area.Key words citrus huanglongbing ;real-time fluorescent quantitative PCR ;sensitivity ;Meizhou Guangdong梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR 与实时荧光定量PCR 检测技术研究与应用李月1张志标1周玉蓉1钟进良2马瑞丰1刘蕊2黄城1陶星星1(1广东省梅州市农业科学院,广东梅州514071;2梅州市果树研究所)柑橘作为重要的经济作物之一,广泛分布在热带和亚热带地区,产量居于世界水果之首[1]。
梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究与应用
梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究与应用1. 引言1.1 研究背景柑橘黄龙病是由黄龙病菌引起的柑橘病害，主要通过亚洲柑橘际植物单胞菌传播，造成柑橘树叶片黄龙状、芽梢生长迟缓、果实变形、果实裂纹等严重症状，严重危害柑橘生产。
目前，梅州地区柑橘黄龙病已成为威胁柑橘产业发展的重要因素。
传统的黄龙病检测方法通常采用病斑样品的酶联免疫吸附试验（ELISA）或聚合酶链式反应（PCR）技术。
这些方法存在着检测灵敏度低、结果准确性不高等问题，不能完全满足对黄龙病的快速、准确诊断需求。
基于常规PCR与实时荧光定量PCR技术在其他领域已广泛应用且具有高灵敏度和准确性的特点，本研究旨在探讨这两种技术在梅州地区柑橘黄龙病检测中的应用，从而提高柑橘黄龙病的早期诊断和防控水平。
通过研究常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术的原理、比较以及在柑橘黄龙病检测中的具体应用，为梅州地区柑橘产业的健康发展提供科学依据和技术支持。
1.2 研究目的研究目的是为了探讨在梅州地区柑橘黄龙病防控中，常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术的应用效果。
通过比较两种技术的原理和优缺点，确立更为准确、快速的检测方法，为该地区柑橘黄龙病的早期诊断和防控提供科学依据。
具体目的包括：1. 探究常规PCR检测技术在柑橘黄龙病检测中的应用情况和效果；2. 研究实时荧光定量PCR检测技术的原理及其对柑橘黄龙病的检测敏感性与准确性；3. 比较常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术在柑橘黄龙病检测中的优劣之处；4. 分析柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究成果，探讨其在梅州地区的实际应用前景；5. 最终旨在提高柑橘黄龙病的防治水平，为梅州地区柑橘产业的健康发展提供技术支持和保障。
1.3 研究意义梅州地区是我国重要的柑橘产区之一，柑橘黄龙病是严重危害柑橘生产的病害之一。
柑橘黄龙病是由杆菌共生体传播的一种病害，能够引起植物严重的光合作用障碍，导致柑橘树叶片黄化、叶缘翘曲、树势下降、果实生长受损等严重问题，严重影响了柑橘产量和品质。
柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定
柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定【摘要】柑橘黄龙病是柑橘树的一种严重病害，对柳州市的柑橘产业造成了严重威胁。
本文通过QPCR技术和代谢物鉴定方法，对柳州市柑橘黄龙病进行检测和研究。
在病原鉴定方法探讨中，探讨了QPCR技术在柑橘黄龙病检测中的应用，并详细介绍了代谢物鉴定在研究中的重要作用。
实验方法部分详细描述了柑橘黄龙病代谢物鉴定的步骤和流程，结果分析部分对代谢物鉴定结果进行了详细的分析。
结论部分总结了柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定的重要意义，并展望了未来的研究方向。
通过本文的研究，将为柑橘黄龙病的防控提供重要的实验依据和理论支持。
【关键词】关键词：柳州市、柑橘、黄龙病、QPCR检测、代谢物鉴定、病原鉴定、技术应用、实验方法、结果分析、研究意义、未来展望。
1. 引言1.1 柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定的背景柳州市位于广西壮族自治区，是我国重要的柑橘产区之一，然而近年来，柳州市柑橘黄龙病的发生严重影响着柑橘产业的发展。
柑橘黄龙病是由类花叶病毒引起的一种病害，严重危害柑橘树的生长和果实的品质。
除了病原检测外，代谢物鉴定也扮演着重要的角色。
通过分析柑橘树受到黄龙病侵染后的代谢物变化，可以深入了解病程的发展和机制，为寻找防治病害的新方法提供参考。
本研究就是基于QPCR技术和代谢物鉴定方法，探讨柳州市柑橘黄龙病的病原鉴定和机制研究，旨在为柑橘产业的健康发展提供科学依据和技术支持。
1.2 研究目的研究目的：本研究旨在探究柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定的方法和应用，旨在提高黄龙病的检测准确性和效率，为柑橘黄龙病的防控提供科学依据。
具体目的包括：1. 探讨柳州市柑橘黄龙病病原鉴定方法，提高病原检测的灵敏度和特异性；2. 研究QPCR技术在柳州市柑橘黄龙病检测中的应用，评估其在实际检测中的准确性和稳定性；3. 探讨代谢物鉴定在柳州市柑橘黄龙病研究中的作用，揭示病原与寄主之间的代谢互作机制；4. 探讨柑橘黄龙病代谢物鉴定的实验方法，总结代谢物鉴定的关键步骤和注意事项；5. 分析代谢物鉴定结果，揭示柑橘黄龙病的代谢物特征和变化规律。
柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定
柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定柳州市是中国柑橘产业的重要基地之一，柑橘黄龙病是造成柑橘感染的一种病害，严重影响了柑橘的产量和品质。
为了及时发现柑橘黄龙病的感染情况并对其进行有效的控制，近年来，柳州市开展了柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定工作。
下面将介绍柳州市柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定的相关情况。
柳州市柑橘黄龙病QPCR检测的工作原理是利用定量PCR技术对柑橘叶片中的黄龙病菌进行快速、准确的检测。
QPCR技术是在传统PCR技术基础上发展而来的一种新型PCR技术，其最大特点是能够实现对目标DNA的定量检测，具有高灵敏度、高特异性、高准确性等优点。
通过QPCR检测，可以快速获得柑橘叶片中黄龙病菌的数量信息，为进一步的病害防控提供科学依据。
针对柳州市柑橘黄龙病的QPCR检测工作，相关部门首先对柑橘树叶采样进行标本处理，提取出叶片中的DNA。
随后，利用QPCR仪器进行PCR扩增反应，通过实时监测扩增曲线，得出黄龙病菌DNA的数量。
根据检测结果，对不同地区、不同柑橘品种的黄龙病感染情况进行分析，及时采取相应的防控措施，保障柑橘产量和品质。
除了QPCR检测外，柳州市还开展了柑橘黄龙病代谢物鉴定工作。
柑橘黄龙病是由黄龙病细菌引起的一种植物病害，其感染会导致柑橘叶片内部代谢物的显著变化。
通过对柑橘叶片进行代谢物分析，可以发现黄龙病感染对柑橘植株代谢活动的影响，为进一步研究其发病机制提供重要参考。
在柑橘黄龙病代谢物鉴定工作中，柳州市相关部门首先对不同状态的柑橘叶片进行采样，采用色谱质谱联用技术对其代谢物进行分析。
通过比对感染和未感染的柑橘叶片代谢物谱图，可以鉴定出感染黄龙病后柑橘叶片中代谢物含量的变化情况，进而揭示柑橘黄龙病的发病机制和传播途径。
通过柑橘黄龙病QPCR检测及代谢物鉴定工作，柳州市已经取得了显著的成效。
QPCR检测技术的应用大大提高了柑橘黄龙病的检测效率和准确性，为病害的防控提供了可靠的数据支持。
利用实时荧光PCR技术定量分析柑橘黄龙病菌的研究的开题报告
利用实时荧光PCR技术定量分析柑橘黄龙病菌的研究的开题报告摘要：黄龙病是世界上最严重的柑橘病害之一，由黄龙病菌引起。
目前，黄龙病的快速检测和定量分析对于黄龙病的早期诊断和病情监测具有重要意义。
实时荧光PCR技术可以准确、快速地检测黄龙病菌，并进行定量分析。
本文将介绍实时荧光PCR技术在黄龙病研究和检测中的应用，并探讨该技术在黄龙病菌的定量分析中的优势和限制。
关键词：柑橘黄龙病，黄龙病菌，实时荧光PCR，定量分析一、研究背景及意义柑橘黄龙病是一种由黄龙病菌引起的疾病，广泛分布于世界上许多柑橘生产地区。
由于该病的高度传染性和致病性，严重影响了柑橘生产，给农业产业带来了严重的经济损失。
因此，黄龙病的快速检测和定量分析对于该病的早期诊断和病情监测具有重要意义。
传统的黄龙病检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、PCR等。
其中，ELISA 方法操作简单、成本低，但不能进行定量分析。
PCR方法可以进行定性和定量分析，但需要专业设备以及复杂的操作步骤，且存在交叉反应风险。
实时荧光PCR技术是一种基于荧光信号的PCR检测方法，可以准确、快速地检测黄龙病菌，并进行定量分析。
相比于传统的PCR方法，实时荧光PCR技术具有灵敏度高、特异性好、操作简便、快速等优点，在黄龙病的早期检测和病情诊断中具有重要应用价值。
二、研究目的本文旨在介绍实时荧光PCR技术在黄龙病研究和检测中的应用，并探讨该技术在黄龙病菌的定量分析中的优势和限制。
三、研究内容和方法1.实时荧光PCR技术原理及操作流程的介绍；2.实时荧光PCR技术在黄龙病检测中的应用情况的回顾，并探讨该技术在黄龙病菌的定量分析中的优劣势；3.构建相应的实验体系，利用实时荧光PCR技术对柑橘黄龙病菌的定量分析；4.对实验结果进行统计和分析。
四、期望结果通过本研究，预计可以达到以下几个方面的期望结果：1. 系统掌握实时荧光PCR技术，并熟练掌握该技术在黄龙病检测和定量分析中的应用；2. 抛弃传统PCR方法的缺点，建立一种简单、快速、可靠的柑橘黄龙病菌定量分析方法；3. 为柑橘黄龙病的早期诊断和病情监测提供一种新的检测手段。
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柑橘黄龙病常规PCR检测技术研究与初步应用摘要柑橘黄龙病是世界范围具有毁灭性危害的柑橘细菌性病害，在我国大部分柑橘产区发生，严重制约了我国柑橘产业的发展。
本文根据黄龙病病原物亚洲韧皮杆菌核糖体16S rRNA基因设计了1对PCR引物HLBF468/HLBR877，并以此为基础建立了常规PCR反应体系，确定了检测体系的特异性和灵敏度。
结果表明该体系的检测灵敏度比先前报道的常规PCR方法有了明显提高。
利用建立的PCR体系完成了对广东和广西两省区果园柑橘黄龙病的抽样检测。
本研究建立的常规PCR方法可以作为一种简便、准确、灵敏的检测技术应用于柑橘黄龙病的早期诊断。
关键词柑橘黄龙病；亚洲韧皮杆菌；常规PCR；灵敏度；早期诊断中图分类号：S 436.66文献标识码：ADOI：10.16688/j.zwbh.2017071Abstract Citrus Huanglongbing （HLB）is a devastating bacterial disease on citrus in the world and seriously restricts the development of citrus industry in our country. Polymerase chain reaction （PCR）approach was established based on a pair of primers，HLBF468/HLBR877，designed from the ribosomal gene sequence of 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus，and its sensitivity was obviously higher than that of the previous reported PCR approach. The samples infected by HLB were collected from Guangdong and Guangxi and were tested by this method. The results showed that this method could be applied for early diagnosis of HLB.Key words citrus Huanglongbing （HLB）；Candidatus Liberibacter asiaticus；PCR；sensitivity；early diagnosis柑橘黄龙病（citrus Huanglongbing，HLB）是世界范围具有毁灭性危害的柑橘细菌性病害，在我国大部分柑橘产区发生，并造成巨大损失，严重制约了我国柑橘产业的生存与健康发展[12]。
柑橘黄龙病的病原物已于1994年被确定为韧皮部杆菌属类细菌“Candidatus Liberibact er spp.”，是一种限于筛管组织内寄生的革兰氏阴性细菌。
根据耐热性和地理分布分为三个种：亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus，非洲种Candidatus Liberibacter africanus和美洲种Candidatus Liberibacter americanus。
在我国分布的是亚洲韧皮部杆菌Candidatus Liberibacter asiaticus。
柑橘黄龙病的传播与症状表现具有较长的潜伏期（一般为3至8个月），这使得该病的防治和早期诊断工作变得十分困难[35]，为此，建立成本低廉、操作简便、结果稳定且可靠的快速的柑橘黄龙病早期诊断技术，对于防止柑橘黄龙病进一步扩散传播，减少果农经济损失具有重大意义。
PCR检测灵敏度和可信度高，可批量进行，除了能对显症的植物组织中的病原进行定性和定量分析外，还能对未显症的植物材料、媒介昆虫中的病原物进行检测，目前已成为植物病虫害诊断的可靠方法之一[4]。
近年来，国内外研究人员利用常规PCR检测方法开展了对柚、柑、橙、橘等果园主要栽培的芸香科果树品种的柑橘黄龙病诊断工作，一般情况下可以完成对黄龙病的快速准确检测[614]。
但由于黄龙病病原菌在柑橘植株体内含量较低且分布不均匀，常规PCR检测结果会出现假阴性，影响了其在黄龙病早期诊断中应用的可靠性。
本研究通过设计筛选黄龙病病原物特异性引物对，优化常规PCR体系与反应条件，以提高常规PCR检测方法的灵敏度，以期为黄龙病早期诊断提供一种简便可靠的常规PCR检测方法。
1 材料与方法1.1 供试材料黄龙病阳性样品：采自广东康士生物科技股份有限公司江门市新会果园内具有典型黄龙病斑驳症状的柑橘树叶片。
黄龙病阴性样品：为广州市齐美植物保护有限公司提供的柑橘脱毒苗叶片。
特异性测试对照样品：包括笔者从柑橘叶面分离培养的腐生菌，以及由中国农业大学植物保护学院提供的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
空白对照样品：DNase/RNase-Free去离子水（RT121），购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.2 试验方法1.2.1 引物设计在GenBank数据库中检索亚洲韧皮部杆菌Candidatus Liberibacter asiaticus及其同属其他菌种序列长度大于1 000 bp的16S rRNA基因同源序列（GenBank登录号分别为：DQ432005.1、AB038369.1、AY-919311.1、AJ542545.1、KF926817.1和KT273280.1），對获得的所有基因片段序列用DNAMAN软件进行多序列比对，寻找亚洲韧皮部杆菌的保守位点，同时该保守位点又能特异地区分同属其他种类，在该位点人工设计引物，利用Oligo 7.0软件对引物进行评估。
通过预试验筛选出最佳引物对HLBF468/HLBR877（HLBF468：5′-GCGATTAAGTTAGAG-GTGA-3′；HLBR877：5′-TACCATCTCTGATAT-CGTCCTATA-3′），预期扩增片段长度为433 bp。
引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2.2 DNA提取柑橘叶片组织：分别称取0.1 g柑橘叶中脉及叶柄置于2.0 mL的离心管中，使用Bullet Blender GOLD24组织细胞破碎仪进行样品粉碎，然后使用植物基因组DNA提取试剂盒[DP305，天根生化科技（北京）有限公司]进行基因组DNA提取，具体操作流程参照试剂盒说明书。
菌液：分离培养的柑橘叶面腐生菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，使用细菌基因组DNA提取试剂盒[DP302，天根生化科技（北京）有限公司]进行基因组DNA提取，具体操作流程参照试剂盒说明书。
1.2.3 PCR扩增和产物测序使用筛选出的引物对HLBF468/HLBR877进行PCR扩增，通过不断调整PCR反应试剂用量以及退火温度、时间等，最终确定PCR反应体系总体积为30 μL，具体包括：2×Taq PCR MasterMix [KT201，天根生化科技（北京）有限公司] 15.0 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL，ddH2O 11 μL，模板2.0 μL。
反应条件为95℃预变性3 min后进行40次PCR 循环：95℃变性30 s，55℃退火延伸30 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸3 min，PCR 产物保存于4℃。
扩增反应结束后，取5 μL PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶（已加入SYBGreen荧光染料）上进行电泳检测，在紫外灯下观察结果。
将出现条带的PCR产物委托上海生工生物工程有限公司纯化并进行双向测序，返回的测序结果进行BLAST比对，以确定扩增产物是否为目的基因片段。
1.2.4 引物HLBF468/HLBR877的特异性检测分别以黄龙病阳性样品、黄龙病阴性样品、柑橘叶面腐生菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的DNA为模板，以DNase/RNase-Free去离子水为空白对照，利用引物对HLBF468/HLBR877，按照1.2.3的反应体系进行特异性检测。
1.2.5 引物对HLBF468/HLBR877的灵敏度检测使用大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒[DP210，天根生化科技（北京）有限公司]回收纯化目的条带，具体操作流程参照说明书。
用NanoDrop ND-1000分光光度计检测DNA浓度，得到的DNA浓度为11.7 ng/μL，用于后续的灵敏度检测。
将浓度为11.7 n g/μL的DNA用DNase/RNase-Free去离子水按照10倍梯度依次稀释为1.17、0.117、1.17×10-2、1.17×10-3、1.17×10-4、1.17×10-5、1.17×10-6、1.17×10-7、1.17×10-8和1.17×10-9 ng/μL。
以每种稀释液为模板，水为阴性对照，用引物对HLBF468/HLBR877分别对不同浓度的模板DNA按照1.2.3中的反应体系和反应程序进行PCR扩增。
1.2.6 引物对HLBF468/HLBR877与CQULA03F/ CQULA03R[15]的灵敏度对比胡浩等[15]利用引物对CQULA03F/CQULA03R進行黄龙病常规PCR检测，该引物对的灵敏度为4.39×10-1 pg/μL，为国内记载的最高灵敏度。
将CQULA03F/CQULA03R和本研究筛选出的引物对HLBF468/HLBR877进行灵敏度检测比较。
按1.2.2的方法提取黄龙病阳性柑橘树叶片的基因组DNA，并将其按10倍梯度进行稀释，以各感病叶片组织基因组DNA稀释液为模板，分别用引物对CQULA03F/CQULA03R按照胡浩等[15]的PCR反应体系和本研究的引物对HLBF468/HLBR877按照1.2.3的PCR反应体系进行扩增。
1.2.7 检测体系的应用2016年6月，在广西恭城陈德全果园选取具有明显黄龙病红鼻子果症状，已确诊感染柑橘黄龙病的2株砂糖橘老树作为应用效果检验的阳性样本；在广西恭城新建无黄龙病疫情的金燕子合作社和广东新会果园，分别选取2株红心柚树和1株柠檬树作为应用效果检验的阴性样本。
检测时分别选取2株感病砂糖橘树上未表现柑橘黄龙病症状的新生叶和其他3株作为阴性样本的果树新生叶提取样本的DNA，然后应用本研究建立的PCR检测方法进行柑橘黄龙病早期诊断，验证本研究建立体系的检测效果。
2 结果与分析2.1 PCR产物测序与相似性比对结果委托上海生工生物工程有限公司对预期位置出现特异性条带的PCR产物进行纯化和双向测序，反馈回来的测序文件经过DNAMAN进行正反向序列拼接后所得序列信息在NCBI上进行BLAST比对（Hs：//blast.ncbi.nlm.nih）。