酵母细胞的固定化及其酒精发酵试验
固定化酵母细胞生产乙醇试验报告
固定化酵母细胞生产乙醇试验报告
本试验旨在研究固定化酵母细胞生产乙醇的能力。
首先，采用分子生物学技术建立的固定化酵母细胞，并放入含有目标表达蛋白（乙醇脱氢酶）的受体体系，培养在适宜的培养基中；其次，添加有机底物和生长调节剂，提高酵母细胞乙醇合成效率；最后，在培养基不同时间段进行调控，观察乙醇液位高度，测量乙醇密度，确定乙醇比重指数及分子量。
试验结果表明，固定化酵母细胞在此培养条件下能够有效合成乙醇，乙醇的比重指数和分子量也有所提高，但乙醇的曲线变化显示出较弱的合成趋势，需要进一步调整培养参数，以提高乙醇的产率。
酵母细胞的固定化及其酒精发酵试验
酵母细胞的固定化及其酒精发酵试验一、实验目的1.掌握微生物细胞的固定化方法；2.学习用固定化酵母进行酒精发酵；3.进一步理解淀粉质原料酒精发酵的原理和一般工艺过程。
二、实验原理（一）酵母菌酒精发酵在无氧条件下，酵母菌利用葡萄糖或淀粉水解糖发酵产生乙醇和CO2的作用，称为酒精发酵，总反应式为：C6H12O6→2C2H5OH+2CO2酒精发酵是生产酒精及各种酒类的基础。
本实验采用固定化酵母发酵，通过测定发酵过程中的酵母细胞数、生成的CO2量以及最终产物酒精的量，可以判断固定化酵母的发酵能力。
（二）细胞固定化技术固定化细胞就是被限制自由的细胞。
即采用物理或化学的方法将细胞固定在载体上或限度在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并能反复或连续使用。
微生物细胞的固定化方法有：（1）吸附法，（2）包埋法，（3）不用载体法。
本实验采用凝胶包埋的固定化方法，把酵母细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入CaCl2溶液，形成海藻酸钙凝胶小球，细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。
三、实验器材（一）淀粉的液化与糖化（双酶法）1. 酵母菌细胞：酒精活性干酵母。
2. 2.5%海藻酸钠溶液40mL，2 % CaCl2溶液100mL。
3.培养基：①增殖培养基：浓度为130BX麦芽汁，以6N硫酸调节pH值至4.1~4.5。
（每组100mL 装于250mL三角瓶，1kg/cm2，灭菌30min后备用）②发酵培养基：淀粉水解液，具体制备见实验步骤。
4. 培养箱、显微镜、蒸馏装置及其他常规实验仪器四、实验方法①调浆:以1﹕3~3.5的比例，将玉米粉（或玉米淀粉）用60℃左右的温水调成粉浆500mL;②液化：加α-淀粉酶（用量约为10u/g淀粉）；加热至85~90℃，保持30~60 min，加热煮沸10 min，补充水分。
③糖化：将上述液化醪冷至60~62℃，加入糖化酶，用量为80~100u/g淀粉，维持30 min后分装于500mL三角瓶，每瓶装糖化醪250mL。
酵母菌的分离纯化
酵母菌的分离纯化-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵第一部分酵母菌的分离纯化一、实验目的应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。
二、实验原理酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。
多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为酵母菌生长迅速，容易分离培养。
在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。
因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。
三、器材和用品1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。
2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。
分装三角瓶；试管斜面1支/组3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为左右，再分装试管9ml2支/组。
4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。
四、实验方法1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。
2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。
3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。
4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。
5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。
实验一 固定化酵母酒精发酵
实验一固定化酵母酒精发酵一、实验目的掌握制备固定化细胞中最基本、最常用的方法。
掌握固定化酵母酒精发酵工艺。
掌握酒精的提取及测定方法。
二、实验原理固定化酶和固定微生物细胞的原理是将酶或微生物细胞利用物理的或化学的方法，使酶或细胞与固体的水不溶性支持物（或称载体）相结合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性。
它在固相状态作用于底物，具有离子交换树脂那样的特点，有一定的机械强度，可用搅拌或装柱形式与底物溶液接触。
由于酶和微生物细胞被固定在载体上，使得它们在反应结束后，可反复使用，也可贮存较长时间使酶和微生物活性不变。
一般胞内酶、提纯酶在固定化中或固定化后常不稳定，而固定化微生物不仅可避免复杂的酶提取和纯化过程，同时解决了酶的不稳定性问题。
细胞固定化后，酶活较高，操作稳定性较好，可在多步酶促反应中应用并便于连续化、自动化操作。
若代谢底物及产物均为低分子物质时使用固定化微生物细胞效果更佳。
微生物细胞固定化常用载体有：1、多糖类（纤维素、琼脂、葡聚糖凝胶、藻酸钙、K一角叉胶、DEAE-纤维素等）；2、蛋白质（骨胶原、明胶等）；3、无机载体（氧化铝、活性炭、陶瓷、磁铁、二氧化硅、高岭土、磷酸钙凝胶等）；4、合成载体（聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、酚醛树脂等）。
选择载体原则以价廉、无毒、强度高为好。
微生物细胞固定化常用的方法有三大类：1．吸附法吸附法是将细胞直接吸附于惰性载体上，分物理吸附法与离子结合法。
（1）物理吸附法是利用硅藻土、多孔砖、木屑等作为载体，将微生物细胞吸附住。
（2）离子结合法是利用微生物细胞表面的静电荷在适当条件下可以和离子交换树脂进行离子结合和吸附制成固定化细胞。
吸附法优点是：操作简便、载体可再生；缺点是：细胞与载体的结合力弱、pH、离子强度等外界条件的变化都可以造成细胞的解吸而从载体上脱落。
2．包埋法是将微生物细胞均匀地包埋在水不溶性载体的紧密结构中，细胞不至漏出而废物和产物可以进入和渗出。
细胞和载体不起任何结合反应．细胞处于最佳生理状态。
酵母菌细胞的固定化技术
浓度太低：固定的酵母菌太少
第四步：将海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合
① 过程 将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵 母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中 ②注意事项 为什么要冷却至室温？
防止高温杀死酵母菌。恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配制好的 CaCl2溶液中，浸泡30min左右。 ②注意事项 为什么要浸泡30分钟？
③注意事项 溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离 子影响实验结果
第三步：配制海藻酸钠溶液
① 过程 称取0.2g海藻酸钠，放入40ml蒸馏水，用酒精灯小火间 断加热至完全溶化。 ②注意事项 为什么要小火间断加热？
防止海藻酸钠焦糊。 为什么说该步骤是实验成败的关键步骤？
浓度太高：得不到规则的凝胶珠
酵母菌细胞的固定化技术
一、基本步骤：
酵母细胞的活化 配制CaCl2溶液 配制海藻酸钠溶液 将海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合 固定化酵母细胞
第一步：酵母细胞的活化
加水 活化
由于缺水，酵母处于 休眠状态
活化的干酵母
第二步：配制0.05mol/L的CaCl2
① 过程 称取无水CaCl2 0.83g，放入200ml的烧杯中，加入150ml 的蒸馏水，使其充分溶解，待用 ② 目的 使胶体聚沉
以便凝胶珠形成稳定的结构
球形或椭 球形，浅 黄色
二、用固定化酵母发酵
1.将固定好的酵母细胞（凝胶珠）用_蒸__馏__水__冲洗2~3次。
2.发酵时的温度就为__2_5_℃___，时间_2_4_h____（底物为葡 萄糖） 3.将凝胶珠加入用于发酵的葡萄糖溶液后会发现有_气__泡___ 产生，同时有_酒__精__味散发。
实验一 酵母细胞的固定化
实验一酵母细胞的固定化一、实验原理与目的原理：固定化酶和固定化细胞技术是利用物理或化学方法将酶或者细胞固定在一定空间的技术，包括包埋法,化学结合法（将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上）和物理吸附法固定化，细胞多采用包埋法固定化。
常用的包埋载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维和聚丙烯酰胺等。
本实验选用海藻酸钠作为载体包埋酵母菌细胞。
目的:了解细胞固定化的原理；掌握酵母细胞固定化实验操作.二、仪器与用具仪器:50ml烧杯、200ml烧杯、玻璃棒、量筒、酒精灯、石棉网、针筒、三角瓶、水浴锅、恒温箱.化学材料：活化酵母菌(酵母悬液)、蒸馏水、无水CaCl2、海藻酸钠、葡萄糖。
三、试剂配制1、0.05mol/L的CaCl2溶液150ml；2、海藻酸钠溶液：每0.7g海藻酸钠加入10ml水加热溶液成糊状；3、10％葡萄糖溶液150ml。
四、实验方法与步骤1、干酵母活化：1g干酵母+10ml蒸馏水→50ml烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。
2、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合：将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已经活化的酵母细胞,用玻璃棒充分搅拌混合均匀。
3、固定化酵母细胞：用20ml注射器吸取海藻酸钠与酵母细胞混合液，在恒定的高度（建议距液面12~15cm处，过低凝胶珠形状不规则，过高液体容易飞溅），缓慢将混合液滴加到CaCl2中，观察液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形。
将凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。
4、固定化酵母细胞发酵：用5ml移液器吸取蒸馏水冲洗固定好的凝胶珠2～3次，然后加入装有150ml10％葡萄糖溶液的三角瓶中，置于25℃发酵24h,观察结果。
实验开始时，凝胶球是沉在烧杯底部,24h后，凝胶球浮在溶液悬浮在上层,而且可以观察到凝胶球并不断产生气泡，说明固定化的酵母细胞正在利用溶液中的葡萄糖产生酒精和二氧化碳,结果凝胶球内包含的二氧化碳气泡使凝胶球悬浮于溶液上层.五、结果观察：打开瓶盖，闻气味,观察葡萄糖液中的变化。
酵母细胞的固定化及其性能测定
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采用物理或化学的方法固定微生物细胞， 以微生物在固定化后的生长状态可分为3类：固 定化死细胞、固定化活细胞和固定化增殖细胞。
最令人感兴趣的是固定化增殖细胞，因 为多数微生物代谢的产物与其生长相关。
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微生物细胞的固定化方法有： （1）吸附法， （2）包埋法， （3）不用载体法。
包埋法
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包埋法
是制备固定化细胞最常用的方法。将生成 菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、 琼脂、海藻酸、卡拉胶、醋酸纤维、胶原、明 胶等包埋起来，发挥微生物的作用。
胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入CaCl2溶液，
形成海藻酸钙凝胶小球，细胞包埋在凝胶的小
孔中，制成固定化细胞。
学生也可以经查阅资料自行设计酵母
细胞的固定化方法。
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三实验仪器、试剂
1. 酵母菌细胞：酒精活性干酵母，或新鲜的斜面酵母菌种。 2. 2.5%海藻酸钠溶液40mL（海藻酸钠比较难溶，配制时需在加热
钾 0.1%，硫酸铵 0.2%，调节 pH5.0。（每组150mL装三角瓶，灭菌 后备用）
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四、操作步骤
1.干酵母活化：称取2g活性干酵母，投入50mL、2%蔗糖
溶液中，在32℃条件下活化1~2h；然后离心弃去上清液
（3000r/min、10min），备用。 2.固定化：将离心收集的酵母湿细胞悬浮在40mL海藻酸
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吸附法
最常用的是 物理吸附法：是将微生物细胞附着于 固体载体上的一种固定方法。常用的载体为多孔砖、瓷 杯、木屑、蔗渣、聚氯乙烯、硅藻土、玻璃纤维等。
例如：将酵母用聚氯乙烯或多孔砖固定化，每g载体可
以固定80mg酵母；也可将固定化的酿酒酵母，装入反应
柱，以生产乙醇，乙醇可达120g/L。 物理吸附法载体与微生物细胞间不起反应，吸附量 大，但细胞极容易脱落而流失，有待于进一步改善。
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3(DOC)
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵吴英玲 10197020 10生物创新班摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。
将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内4 ℃下保存。
用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。
并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。
采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。
关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentationability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。
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酵母细胞的固定化及其酒精发酵试验
一、实验目的
1.掌握微生物细胞的固定化方法；
2.学习用固定化酵母进行酒精发酵；
3.进一步理解淀粉质原料酒精发酵的原理
和一般工艺过程。
二、实验原理
（一）酵母菌酒精发酵
在无氧条件下，酵母菌利用葡萄糖或淀粉水解糖发酵产生乙醇和CO2的作用，称为酒精发酵，总反应式为：
C6H12O6→2C2H5OH+2CO2
酒精发酵是生产酒精及各种酒类的基础。
本实验采用固定化酵母发酵，通过测定发酵过程中的酵母细胞数、生成的CO2量以及最终产物酒精的量，可以判断固定化酵母的发酵能力。
（二）细胞固定化技术
固定化细胞就是被限制自由的细胞。
即采用物理或化学的方法将细胞固定在载体上或限度在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并能反复或连续使用。
微生物细胞的固定化方法有：
（1）吸附法，
（2）包埋法，
（3）不用载体法。
本实验采用凝胶包埋的固定化方法，把酵母细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入CaCl2溶液，形成海藻酸钙凝胶小球，细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。
三、实验器材
（一）淀粉的液化与糖化（双酶法）
1. 酵母菌细胞：酒精活性干酵母。
2. 2.5%海藻酸钠溶液40mL，2 % CaCl2溶液100mL。
3.培养基：
①增殖培养基：浓度为130BX麦芽汁，以6N硫酸调节pH值至4.1~4.5。
（每组100mL 装于250mL三角瓶，1kg/cm2，灭菌30min后备用）
②发酵培养基：淀粉水解液，具体制备见实验步骤。
4. 培养箱、显微镜、蒸馏装置及其他常规实验仪器
四、实验方法
①调浆:以1﹕3~3.5的比例，将玉米粉（或玉米淀粉）用60℃左右的温水调成粉浆500mL;
②液化：加α-淀粉酶（用量约为10u/g淀粉）；加热至85~90℃，保持30~60 min，加热煮沸10 min，补充水分。
③糖化：将上述液化醪冷至60~62℃，加入糖化酶，用量为80~100u/g淀粉，维持
30 min后分装于500mL三角瓶，每瓶装糖化醪250mL。
糖化醪质量检查：要求糖度16~17°BX，还原糖4~6%，酸度2~3。
（二）干酵母活化
称取2g活性酒精干酵母；
加入到2%、50mL蔗糖溶液中；
在培养箱中32℃活化1h左右；
离心（3000r/min、10min），弃去上清液；
湿酵母备用。
（三）固定化操作
①将酵母湿细胞与40mL海藻酸钠溶液混合均匀；
②用注射器（不用针头）将海藻酸钠—酵母菌混合
液点滴滴入CaCl2溶液中，形成球状颗粒；
③常温下静置2h，使其充分固化；
④滤出凝胶颗粒；用无菌水洗涤2~3遍，即得固定化
酵母细胞。
（四）固定化酵母的增殖
将固定化颗粒投入增殖培养基中进行增殖，28℃、120r/min下增殖24h。
定时采用血球记数板测定酵母细胞数。
（五）固定化酵母的分批酒精发酵
将增殖后的固定化酵母颗粒，置于三角瓶发酵培养基中（安装下图），30℃进行酒精发酵，发酵时间48h左右。
定时记录发酵液的糖度及细胞数的变化。
六）CO2生成量的测定
按右图安装测定装置。
培养前，揩干三角瓶外壁，置于天平上称重，记下重量为W1；培养结束后，取出三角瓶轻轻摇动，使CO2尽量逸出，在同一架天平上再称重，记下重量为W2，则：
二氧化碳生成量＝W1 －W2
（七）酒精度的测定
先装好蒸馏装置（参见下图）；取酒精醪液l00mL，加蒸馏水l00mL，于500mL蒸馏瓶中蒸馏，取100mL馏分，用酒精比重计测量酒精浓度；同时测温度，查表换算成20℃的酒精度。
五、实验结果记录
1.记录定时测定的酵母细胞数；
2. 二氧化碳生成量= 克。
3.蒸馏液的酒精度= 度，温度为℃，换算为20℃的酒精度为度。
研究人：夏凡
指导老师：。