胃蛋白酶提取的分离纯化
胃蛋白酶提取的分离纯化
胃蛋白酶提取的分离纯化Last revised by LE LE in 2021胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。
其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。
纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。
综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。
关键词：胃蛋白酶分离纯化应用．生物提取法生产胃蛋白酶1．1 工艺路线（自溶、过滤）（脱脂、去杂质）猪胃黏膜→自溶液→上清液（浓缩、干燥）→胃蛋白酶成品工艺过程（1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。
一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。
（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。
用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。
（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。
（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。
球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。
2胃蛋白酶的分离技术有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。
通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。
当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。
丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。
2．2盐析法盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。
胃蛋白酶分离纯化技术研究进展
胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法 , 其主要目的是将酶液进行浓缩 、除盐及小分子物 质 。此法常配合盐析使用 , 以缩短提取时间 [ 5 ] 。 113 底物亲和法
底物亲合法是利用酶 (胃蛋白酶 ) 与其底物 (酪蛋白 ) 的亲和性 , 从胃黏膜中提取得到胃蛋 白酶 。使底物和酶在 pH215的乳酸缓冲液中充分 结合 , 然后调 pH 至 410 (底物的等电点 ) 沉淀 底物和酶的结合物 , 随后让沉淀物再溶解于乳酸 缓冲液中 , 添加低浓度的 SDS将底物和酶分离 , 得到酶 - SDS复合物 , 再进一步分离纯化 。陈躬 端 (2001) 成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了 实验室分离 , 得率大约为 30%。与传统的分离方 法比较 , 此法具有简单高效的优点 , 为后续的纯 化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用 , 同 时具有较高的特异性 [ 9 ] 。
110
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
1955年美国专利 ( 2, 701, 228 ) 记载了有 机溶剂法提取胃酶和胃酶素的联产工艺方法 。其 方法的核心主要是将胃黏膜用酸性溶液浸提后加 入乙醇或丙酮 , 使其比重达 0194 0196 先沉淀 胃膜素 , 继续加入乙醇或丙酮 , 使其比重达 0189
有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提 取浓 缩 , 通常使用的有机溶剂有乙醇和丙酮 。此种方 法是利用生化物质在不同浓度的有机溶剂中溶解 度的差异而实现分离的 [ 3 ] 。
收稿日期 : 2007 - 10 - 10 作者简介 : 王莹 (1981 - ) , 女 , 在读硕士 , 研究方向 : 畜产品加工 。
胃蛋白酶
计、凝
胶成像仪、核酸蛋白质分析仪。
四、实验方法
1
．猪胰蛋白酶的分离纯化
（
1
）粗猪胰蛋白酶的提取
取猪胰脏，除去脂肪和结缔组织，切碎，称重约
50g
加入
5
倍体积预冷的
pH2.5
乙酸酸化水
用组织捣碎机捣碎
离心
10000 rpm
，
15 min
用
4
层纱布过滤得上清液（
收集约
1.5 mL
，作为留样
1
，测蛋白含量，及时
SDS
化）
将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中，
边加边搅拌均匀，
使溶液中最终
含有
0.1 mol/L CaCl
2
加入极少量猪胰蛋白酶（约
2-5mg
），轻轻搅拌均匀
用
5 mol/L NaOH
调
pH
为
8.0
于
25
℃下活化
4~6
小时（
2
小时取样一次），测定酶活性增加的情况
4
活化完成后，用
2.5 mol/L H
3
C
6
H
5
O
7
·
2
H
2
O/L
）混匀，
用酸度计检查
pH
值是否为
6.0
。
（
10
）
8
％三氯乙酸
（
11
）
10 mg/mL
酪蛋白溶液：
取酪蛋白
1g
，
加
11
M
Tris
－
HCl
缓冲液，
pH8.0
40
mL
胃蛋白酶的提取实验报告
一、实验目的1. 了解胃蛋白酶的化学性质和生理功能。
2. 掌握从胃黏膜中提取胃蛋白酶的方法。
3. 学习实验操作技巧，提高实验技能。
二、实验原理胃蛋白酶是一种消化酶，主要存在于胃液中，能将蛋白质分解成肽和氨基酸。
本实验通过从新鲜猪胃黏膜中提取胃蛋白酶，探讨其提取方法及活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜猪胃黏膜、生理盐水、蒸馏水、氢氧化钠、硫酸铵、乙酸、酚酞指示剂、标准蛋白质溶液、考马斯亮蓝G-250染料、酶标仪、离心机、冰箱、烧杯、玻璃棒、移液管、滴定管、电子天平等。
2. 实验试剂：胃蛋白酶提取液、胃蛋白酶活性测定液、胃蛋白酶标准曲线、缓冲液等。
四、实验步骤1. 胃蛋白酶提取液的制备（1）将新鲜猪胃黏膜洗净，去除脂肪和杂质。
（2）将胃黏膜剪成小块，放入烧杯中，加入适量的生理盐水，用玻璃棒搅拌。
（3）将搅拌后的胃黏膜液过滤，收集滤液。
（4）向滤液中加入氢氧化钠溶液，调节pH至7.0。
（5）将溶液在室温下静置30分钟。
（6）加入硫酸铵溶液，使蛋白质盐析，沉淀蛋白质。
（7）将沉淀物用蒸馏水洗涤，直至无色。
（8）将洗涤后的沉淀物溶于适量的乙酸溶液中，制成胃蛋白酶提取液。
2. 胃蛋白酶活性测定（1）配制标准蛋白质溶液，用考马斯亮蓝G-250染料进行比色，绘制标准曲线。
（2）取一定量的胃蛋白酶提取液，加入适量的缓冲液，使pH值调至7.0。
（3）取标准蛋白质溶液和胃蛋白酶提取液，分别加入适量的胃蛋白酶活性测定液。
（4）将混合液置于37℃水浴中保温15分钟。
（5）取出混合液，加入适量的酚酞指示剂，用NaOH溶液滴定至终点。
（6）根据滴定结果，计算胃蛋白酶活性。
五、实验结果与分析1. 胃蛋白酶提取液的制备通过实验，成功从新鲜猪胃黏膜中提取出胃蛋白酶，提取液呈淡黄色。
2. 胃蛋白酶活性测定根据实验结果，绘制出胃蛋白酶标准曲线。
在实验条件下，胃蛋白酶活性为（XX±XX）U/mg。
六、实验结论1. 本实验成功从新鲜猪胃黏膜中提取出胃蛋白酶，提取方法简单可行。
各类型胶原的分离方法
综述评论 各类型胶原的分离方法郭 云北京奥弛坦登新技术公司,北京,100084张景锡北京科技大学材料学院,北京,100084彭必先中国科学院理化技术研究所,北京,1001011 Ⅰ型胶原1.1 从成年家兔提取[1]由耳静脉注入空气致死,迅速剥下兔皮,去毛及皮下脂肪,称重,然后将皮肤放入冰中(下述各步骤除特殊说明外,均在4℃下进行)切碎,用绞肉机将其绞成肉泥状,置入烧杯中,加入2.5倍量的中性盐提取液(0.1M T ris ,0.2M NaCl ,0.1m M E DT A ,pH 7.6)。
搅拌2～3h 后,以12,000g (g -重力加速度)离心30min ,弃上清液,沉淀部分加入2.5倍量的3%冰醋酸(H Ac )溶液,抽取搅拌过夜;以20,000g 离心90min 。
所得胶原经盐析沉淀、低离子强度沉淀、加热致凝胶化、超速离心、三氯醋酸-乙醇沉淀5个步骤进行胶原纯化。
Ⅰ型胶原的纯化:由于各型胶原可被不同浓度NaCl 所沉淀,将胶原溶液对pH 7.3,0.1M T ris 缓冲液透析,更换透析液直至平衡,液体的pH 仍维持中性;加入5.1M NaCl 至终浓度为1.7M ,搅拌过夜;以18,000g 离心30min ,弃沉淀(此部分为Ⅲ型胶原)。
上清液加入4.0M NaCl 至最终浓度为2.5M ,搅拌过夜。
以22,000g 离心30min ,沉淀溶解于1%H Ac 溶液中,对1%H Ac 透析,然后反复此过程。
最后所得胶原溶解于1%H Ac 溶液中。
对1%H Ac 反复透析,真空冷冻干燥,称重,保存于-20℃冰箱中。
1.2 从人胎盘提取[2]取新鲜正常人胎盘2只,胎盘去脐带和羊膜、捣碎、匀浆;4℃下胃蛋白酶消化20h (每20g 湿重组织加入0.05%胃蛋白酶、0.5m ol/L 醋酸100m L );清化上清液(酸性)中加入NaCl 至1.0m ol/L ,沉淀为胶原混合物;随后在中性条件下分别以1.5m ol/L 、2.5m ol/L NaCl 盐析,反复数次分别得Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的初纯品;用DE -52柱层析去除酸性大分子,得到纯化的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原。
胃蛋白酶生产工艺
胃蛋白酶生产工艺胃蛋白酶是一种重要的消化酶，能够在胃部分解蛋白质，帮助人体消化吸收。
胃蛋白酶的生产工艺主要包括菌种培养、发酵、提取和纯化等步骤。
以下是一个简要的胃蛋白酶生产工艺的介绍。
首先，选择合适的菌种进行培养。
常用的菌种是产胃蛋白酶的细菌，如枯草杆菌属的嗜热枯草杆菌（Bacillus thermoproteolyticus），也可以使用其他蛋白酶产生菌株。
菌种的选取要考虑其产量、生长速度和酶活性等因素。
然后，进行菌种的发酵过程。
将菌种接种到培养基中，控制好发酵条件，使菌株充分生长和繁殖。
发酵过程中要注意控制温度、pH值、氧气和营养物质等条件，以促进胃蛋白酶的产生。
接着，进行胃蛋白酶的提取。
发酵液经过离心分离，得到含有胃蛋白酶的上清液。
胃蛋白酶的提取过程中可能需要进行蛋白酶的激活或去除杂质等步骤，以提高酶的纯度和活性。
最后，进行胃蛋白酶的纯化和精制。
采用适当的分离技术，如层析、电泳等方法，将胃蛋白酶从提取液中分离出来，并去除其他成分和杂质。
纯化过程中要控制好条件，确保胃蛋白酶的纯度和活性。
在胃蛋白酶生产工艺中，需要重点考虑的因素有以下几点：1.菌种的选取和培养条件：选择产胃蛋白酶能力强、生长快速的菌株，并控制好培养基成分和发酵条件，以提高胃蛋白酶的产量和活性。
2.发酵条件的控制：控制好温度、pH值、氧气和营养物质等条件，以促进菌株的生长和胃蛋白酶的产生。
3.提取和纯化工艺的选择：根据实际情况选择合适的提取和纯化方法，以最大限度地提高胃蛋白酶的纯度和活性。
4.产品的质量控制：对生产的胃蛋白酶进行质量检测和控制，确保产品的活性和纯度达到要求。
综上所述，胃蛋白酶的生产工艺包括菌种培养、发酵、提取和纯化等过程。
通过合理选择菌种和优化发酵条件，以及采用适当的分离和纯化技术，可以获得高纯度、高活性的胃蛋白酶产品。
微生物蛋白提取和分离纯化
– 2. 装柱
缓冲液种液类，、防pH止、返离子混强度和
添加剂的选择应根据溶液与基 Nhomakorabea– 3. 平衡（equilibrium) 质的相互作用、可溶性和样品
– 4. 上样(loading)
的生化性质、以及后续操作的 要求等选择。使用前通过
– 5. 洗脱(elution) – 6. 凝胶再生和保养
洗0.脱45μ液m成的膜份过应滤与，膨可胀防止胶不溶 平和衡平体衡性积小时至颗所少同粒为用堵5的倍塞床液柱体子体积。相。
菌体
膜系结构：周质蛋白，膜蛋白
微生物蛋白提取和分离纯化
细胞破碎和蛋白质溶解
微生物蛋白提取和分离纯化
• 机械法 匀浆、研磨、压榨、超声等
• 非机械法 渗透、酶溶、冻融、化学等
• 新方法 激光破碎、冷冻喷射、相向流撞击等
微生物蛋白提取和分离纯化
微生物蛋白提取和分离纯化
微生物蛋白提取和分离纯化
微生物蛋白提取和分离纯化
160
Volume (ml)
0.6 0.8
0.5
0.6 0.4
0.4
0.3 0.4
0.3
0.2
0.1 0.2 0.2
0
0.1
240
0
200
240
0
200
240
elution
微生物蛋白提取和分离纯化
凝胶柱特点
• 特点：
– （1）介质不带电荷, 具有化学惰性，不与被分离物质 发生化学反应，条件温和，不会使物质变性；
微生物蛋白提取和分离纯化
层析过程
– （1）装柱 – （2）平衡（equilibrium) – （3）上样(loading) – （4）洗涤(washing) – （5）洗脱(elution) – （6）清洗与再生
液相色谱法分离胃蛋白酶原
高压凝胶过滤色谱法 中压阴离子交换色谱法 胃蛋白酶原
Ù
前言
正常人胃粘膜中的胃蛋白酶原有多种 包括
∗ ∗ ∀其中
滤 色谱柱
≅
Байду номын сангаас
Λ ∗
分子量范围
分离胃蛋白酶原粗制品 ∀配制不同离子强 度的流动相进行试验 结果发现离子强度过高或过 低都会影响分离结果 本文选择流动相为
Ù Ù ∀整个色 Ù 左右 ∀流速的试验范围为 ∗ Ù Ù
洗脱主要通过盐浓度的程序变化来控制流动相的强 度 ∀设 计 不 同 盐 浓 度 的 梯 度 程 序 缓 冲 液
Ù 乙 酸 乙 酸 钠 Ù
和峰顶点进行分析 峰 各点的最大吸收值都是 为纯组分 峰 在同样 点的最大吸收值有些 偏移 估计为
¬ 和 的混合组分 见图
缓冲液
∀经多次试验 发现当最后流动
高压凝胶过滤色谱 根据胃蛋白酶原分子量的差异 选用凝胶过
Ξ
本工作是江苏省自然科学基金项目 本文收稿日期 修回日期
胃癌相关性研究的一部分
色 用二极管阵列检测器对图 的色谱峰进行纯 度分析 ∀峰 的最大吸收值为 杂蛋白 峰 经活性测定为 峰 为活性组分 ∀取半峰高处左右各 点
谱
卷 梯度程序的设计 在离子交换色谱中 梯度
型高效液相色谱仪 自动进样器
图
左
Φιγ
胃蛋白酶原粗制品在凝胶过滤柱上的色谱图
Λ Χηρο ατογ ρα οφ χρυδε ε σινογ εν ον γ ελ φιλ τρατιον χολ υ ν
二极管阵列检测器
中压液相色谱仪 型自动收集器 ∀
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胃蛋白酶提取的分离纯
化
IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】
胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展
摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。
其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。
纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。
综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。
关键词：胃蛋白酶分离纯化应用
．生物提取法生产胃蛋白酶
1．1 工艺路线
（自溶、过滤）（脱脂、去杂质）
猪胃黏膜→自溶液→上清液
（浓缩、干燥）
→胃蛋白酶成品
工艺过程
（1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。
一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。
（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。
用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。
（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。
（4）浓缩、
干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。
球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。
2胃蛋白酶的分离技术
有机溶剂法
可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。
通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。
当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。
丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。
2．2盐析法
盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。
美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。
当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在—时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为%%。
此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。
底物亲和法
底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。
使底物和酶在的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。
陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。
与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。
【2】
透析法
胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法。
该法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与小分子物质及盐分开的。
由于透析主要是扩散过程，如果袋内外的盐浓度相等，扩散就会停止，因此要经常换溶剂，一般一天换2—3次。
如在冷处透析，则溶剂也要预先冷却，避免样品变性。
透析时的盐是否除净，可用化学试剂或电导仪来检测。
【1】
3胃蛋白酶的纯化技术
凝胶过滤法
美国在20世纪60年代研究结晶为蛋白酶的生产工艺时，是将75mg的胃蛋白酶原样本溶解在8mL的蒸馏水中(pH5．0～6．0)，在14℃±1。
，pH2．0下，保持20min激活。
然后用磺乙基Spandex G-25层析，最后用羟基磷灰石进行色谱层析。
结果表明用层析法得到的胃蛋白酶为单一物质纯品。
离子交换层析法
陈躬瑞等人在纯化蕲蛇胃蛋白酶时将SDS沉淀后的上清液上样到预先用0．05mol／L 乙酸缓冲液(pH5．0)平衡的DEAE—TOYOPEARL离子交换色谱柱(4．6mm X 100mm)上，用0～O．25mo1／L氯化钠梯度洗脱，流速为1ml／min。
得到的酶在5O℃30min 有较高的活性，有望应用于高温食品加工中。
【2】
基于以上对胃蛋白酶的分离纯化技术的比较分析可以看出，长期以来分离提取技术一直没有取得较大的突破，用有机溶剂、盐析等技术得到的天然胃蛋白酶产品，纯度、生物活性愈将不能满足医药品和工业日益增长的需要。
随着分离科学技术的不断发展，采用新型分离技术分离胃蛋白酶已势在必行。
因此，大多数学者认为以下几种技术是胃蛋白酶分离纯化的方向。
．1有机溶剂与盐析共沉淀
有机溶剂和盐析法都是分离纯化胃蛋白酶的传统方法，有其各自的特点。
如果将有机溶剂和盐析配合使用，不仅可以降低盐的用量，而且可以不同程度的消除各自分离纯化所带来的问题，得到的胃蛋白酶纯度和活性也会有所增加。
分离膜是一种特殊的、具有选择性透过功能的薄层物质，能利用分子大小实现分离，从而起到浓缩和分离纯化的作用。
由于其可在维持原生物体系环境的条件下实现分离，并可高效地浓缩、富集产物，有效地去除杂质，加之操作简单，结构紧凑、能耗低，过程简化，无一次污染，也将成为胃蛋白酶分离纯化工艺的研究方向。
胃蛋白酶具有极低的等电点(如猪胃蛋白pH1．0)，但胃蛋白酶的分离纯化技术中等电点沉淀法未见报道，如果此方法可实现，那将大大缩短分离纯化的时间。
底物亲和法是分离纯化胃蛋白酶的新亮点，但其工艺条件还不成熟，尤其是在分离底物和酶的复合物时，SDS的添加量有待研究。
4 结论
有人预言，21世纪将是生物技术的世纪，尤其是生物制药技术的世纪。
生物制药被誉为21世纪的“朝阳产业”。
得益于生物制药技术的酶类药物也日趋成熟。
高效的胃蛋白酶分离纯化工艺、技术和设备的出现，人们必将开发出高效的胃蛋白酶提取工艺。
这对于提高功能性胃蛋白酶产品、提高生产率、降低生产成本和改善人民生活水平起着举足轻重的作用。
而胃蛋白酶单一组分的制备分离，可为胃蛋白酶的研究开发提供标准品，同时能为后期胃蛋白酶单一组分生理活性的研究提供必要的物质保障。
参考文献
[1]张继平，郭照良，唐东生等.暗纹东方纯胃蛋白酶的分离纯化及部分性质研究[J]，湖南农业大学学报，2004（30）：526-529
[2]陈躬瑞、柯李晶、赵恒裕等．底物亲和法分离纯化薪蛇胃蛋白酶[J]，中国食品学报，2001(1)：5O-55
[3]黄纯，生物化学，科学出版社，北京，，18-49。