电镜技术
形态学研究中的扫描电镜技术
形态学研究中的扫描电镜技术形态学是生物学的一个重要分支。
它研究生物体的形态结构，包括细胞、组织、器官、生物体等。
形态学的研究方法主要包括显微技术、电镜技术等。
其中，扫描电镜技术被广泛应用于生物形态学的研究中。
一、扫描电镜技术的概述扫描电镜技术是一种高分辨率的电子显微镜技术，它可以在非真空下对样品进行观察。
扫描电镜将电子束定向向样品表面扫描，然后通过对扫描电子的反射、散射和吸收来诱发样品表面的二次电子发射。
这些二次电子被探测器捕获并转化为图像。
扫描电镜技术可以提供高分辨率和三维图像，同时不需要对样品进行切片和染色。
因此，扫描电镜技术被广泛应用于生物学、材料科学、化学等领域的研究中。
二、扫描电镜技术在生物形态学研究中的应用1. 细胞结构研究扫描电镜技术可以用于研究细胞表面的形态结构，以及各种微细结构的形态变化。
例如，用扫描电镜观察红细胞可以看到其表面的微细绒毛和凹陷。
2. 组织学研究扫描电镜技术可以帮助研究活体组织、细胞和器官的形态结构。
解剖学家和生物学家可以使用扫描电镜技术来描绘人体各个组织和细胞的形态，制作出许多精美的三维影像。
扫描电镜也可以用于观察细胞的超微结构，例如细胞核、线粒体等。
3. 功能性研究扫描电镜技术可以用于研究生物体内的神经和感觉器官等功能性结构。
例如，使用扫描电镜可以观察蛇的毒牙和水母的刺细胞等功能性结构。
4. 疾病研究扫描电镜技术可以用于研究疾病的发生、发展和治疗。
例如，使用扫描电镜可以观察癌细胞的表面形态和结构变化。
5. 物种分类研究扫描电镜技术可以帮助研究不同物种的形态结构差异，从而推断它们之间的亲缘关系。
例如，使用扫描电镜可以观察昆虫体表的微结构和毛发，推断它们的物种分类。
三、扫描电镜技术应用的局限性1. 样品制备的困难扫描电镜技术需要对样品进行制备，包括表面覆膜、清洗、干燥等。
制备样品的过程需要精密的仪器和操作，并对样品进行高度的保护，以保证扫描电镜观察到的是样品的真实表面形态。
免疫电镜技术步骤
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免疫电镜技术基本原理
免疫电镜技术基本原理
免疫电镜技术是一种结合了免疫学和电镜学的高级技术，它可以用来检测细胞和组织中的蛋白质、抗原和抗体等分子。
免疫电镜技术的基本原理是利用抗体与抗原的特异性结合来标记细胞或组织中的分子，然后通过电镜观察标记物的位置和形态。
免疫电镜技术的步骤包括样品制备、抗体标记和电镜观察。
首先，需要将样品制备成超薄切片，通常使用冷冻切片技术来保持样品的原始结构和形态。
然后，将抗体与标记物结合，通常使用金粒子或荧光染料等标记物来标记抗体。
标记后的抗体可以与样品中的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
最后，使用电镜观察样品中的标记物，可以通过电镜的高分辨率来观察标记物的位置和形态。
免疫电镜技术的优点是可以在细胞和组织水平上观察分子的位置和形态，可以提供高分辨率的图像，可以检测低浓度的分子，可以检测细胞和组织中的多种分子。
但是，免疫电镜技术也存在一些缺点，如样品制备复杂、标记物选择有限、标记效率低等。
免疫电镜技术是一种重要的生物学研究技术，它可以用来研究细胞和组织中的分子，可以提供高分辨率的图像，可以帮助我们更好地理解生物学现象。
4.1催化剂表征技术-电镜技术
4.1 电镜技术 4.2 多晶X射线衍射 4.3 X射线 光电子谱(XPS) 4.4 全自动比表面及孔隙度分析仪 4.5 红外吸附 4.6 热分析技术 4.7 程序升温分析技术 4.8 核磁共振技术 4.9 原位技术 4.10 激光拉曼技术
前言
TEM的形式
透射电子显微镜（简称透射电镜，TEM），可以以几种 不同的形式出现，如： 高分辨电镜（HRTEM） 透射扫描电镜（STEM） 分析型电镜（AEM）等等。 入射电子束（照明束）也有两种主要形式： 平行束：透射电镜成像及衍射 会聚束：扫描透射电镜成像、微分析及微衍射。
TEM原理
透射电子显微镜是以波长很短的电子束做照明源，用电 磁透镜聚焦成像的一种具有高分辨本领，高放大倍数的电 子光学仪器。 以高能电子（50-200 KeV）穿透样品，根据样品不同 位置的电子透过强度不同或电子透过晶体样品的衍射方向 不同，经过后面的电磁透镜的放大后，在荧光屏上显示出 图象；透射电镜在加速电压Ep=100 KeV下，电子的波长为 3.7 pm。
为此，1986年，宾尼博士和罗雷尔与发明电子显
微镜的鲁斯卡获诺贝尔物理学奖。
一、扫描隧道显微镜的工作原理
扫描隧道显微镜 (Scanning Tunneling Microscope)的工 作原理是基于量子力学中的隧道效应。 一般认为，金属中处于费米能级(EF)上的自由电子，若 想逐出金属表面，则必须获得足以克服金属表面逸出功()的 能量。 但量子力学理论认为，由于金属中的自由电子具有波动 性，电子波()向表面传播，在遇到边界时，一部分被反射(反 射波R)，而另一部分则可透过边界(透射波T)，从而形成金 属表面上的电子云。 当金属1与金属2靠得很近(通常小于1 nm)时，两金属表面 的电子云将相互渗透(两金属透射波T1与T2相互重叠)。此即 称之为电子隧道效应。
生物冷冻电镜的技术及应用
生物冷冻电镜的技术及应用随着生物学的发展，现代科学对生物结构和功能的研究已经到达了一个新的高度。
其中，冷冻电镜成为了生物结构研究中不可或缺的重要技术手段。
与传统的电镜技术不同，冷冻电镜技术可以使生物样品在冷冻状态下被固定，不失真和干扰，从而更为准确地观察和研究生物体内各种微观结构，尤其是高分子复合物的结构与互作。
一、冷冻电镜技术的基本原理冷冻电镜技术是通过将生物样品在快速冷冻的状态下迅速固定，避免样品在固化过程中产生化学反应，从而保持了样品在自然状态下的形态结构。
通常，样品的冷冻速度可达到10000-60000℃/s，减少了溶剂结晶对样品的损伤。
电子显微镜可以将冷冻过程的各个环节迅速观察和记录下来，尤其是高分子复合物的高分辨率成像，更好地反映了样品的自然结构。
二、冷冻电镜技术的发展历程冷冻电镜技术自1950年代开始，随着电子显微技术的发展不断完善和改进，鲜明的发展成果已经在现代生物学研究中不可忽视。
1950年代，人们通过旋转模型来模拟生物大分子的三维结构。
60年代初期，Patrick Boyer首次使用冷冻电镜研究鱼的肌肉组织，成功地观察到鱼肌纤维，开创了冷冻电镜领域新的历史篇章。
随后，人们开始使用冷冻技术尝试研究生物样品，1967年，探针技术的出现被认为是冷冻电镜技术具有突破性进展的标志。
1980年代，高分辨率微镜的发明，使得冷冻电镜技术的分辨率被提高到0.2奈米级别。
随着技术的发展，冷冻电镜技术已成为人们研究微生物学、生物医学和生物工程学等领域不可或缺的技术之一。
三、冷冻电镜技术的应用冷冻电镜技术广泛应用于从分子结构到大分子复合物的细胞研究，已经成为各种生物学领域的重要技术手段。
当下，主要的应用领域包括：1、细胞结构研究。
冷冻电镜技术是观察细胞组织和细胞配件的理想手段，可以在非常高的空间解析度下获取细胞超结构的实时图像，增强细胞结构研究的深度和广度。
2、蛋白质与生物大分子的研究。
冷冻电镜技术可直观地观察高级生物大分子的结构，从而使生物高分子结构和功能的研究更加精确和深入。
电镜技术及超薄切片技术(研究生)医学
• 电镜技术简介 • 超薄切片技术简介 • 电镜技术与超薄切片技术在医学中的
应用 • 电镜技术与超薄切片技术的发展趋势
与展望 • 实验操作与注意事项
01
电镜技术简介
电镜技术的发展历程
电子显微镜的发明
1926年由德国科学家Max Knoll和 Ernst Ruska发明，标志着电镜技术的 诞生。
安全防护措施
确保实验室通风良好，减少有害气体和粉尘的暴露；定期检查和维护仪器设备，确保其正常运行；对于有毒有害 的化学品和废弃物，应按照相关规定进行妥善处理。
THANKS
感谢观看
电镜技术的初步发展
现代电镜技术的进步
20世纪80年代以后，电镜技术不断更 新换代，分辨率和成像质量得到显著 提高。
20世纪30年代至50年代，电镜技术逐 渐应用于医学、生物学等领域。
电镜技术的原理及应用
原理
电镜技术利用电子代替传统显微镜的光源，通过电子束与样品相互作用产生图 像，再通过显像管显示出来。
药物作用机制探讨
通过观察药物对细胞器、细胞膜等结 构的影响，探讨药物的作用机制，为 临床用药提供依据。
04
电镜技术与超薄切片技术的发展趋势
与展望
新技术新方法的探索与应用
冷冻电镜技术
随着冷冻电镜技术的发展，可以 直接观察生物大分子的结构和动 态，为生物医学研究提供了新的
视角。
电子断层扫描技术
通过多角度观察样品，获取三维重 构图像，提高了对复杂样品结构的 认识。
根据样品类型和观察要求选择合 适的切片机和切片刀。
切片操作
将样品固定在切片机上，调整切 片厚度，进行切片。
切片观察
将切片转移到电镜载网上，进行 观察和拍照。
电镜的图像处理技术
电镜的图像处理技术电子显微镜（简称电镜）是一种高科技装置，可以高精度地观察物质微观结构，它的出现推动了纳米科学、纳米技术的不断发展。
在电镜取得的图像中，图像处理技术可以为我们提供更多的细节信息，让人类更好地认识和利用物质世界，将在此阐述一些常用的图像处理技术。
1、对比度调整调整对比度可以使图像更加清晰，让目标物体的特征更加明显。
电镜的图像通常比较暗淡，如果不进行对比度调整，会很难看清物体的表面结构和内部形态。
为此，我们需要使用图像处理软件，在里面打开电镜图像，通过调节对比度和亮度等参数，使得图像更加明亮、细节更加清晰。
2、去噪电镜图像通常包含噪声，在处理图像前，我们需要把噪声移除，这可以通过各种滤波算法来实现。
常用的去噪算法有中值滤波、高斯滤波、维纳滤波等。
中值滤波将每个像素的值都改为周围像素的中值，具有去除噪声的效果；高斯滤波是一种基于像素点附近值的加权平均值的算法，可以消除高频噪声；维纳滤波可以对加性噪声进行去噪。
3、边缘检测边缘检测是图像处理中的一种常见操作，它可以帮助我们寻找图像中各个物体的边缘。
在电镜图像处理中，边缘检测可以帮助我们更加清晰地观察物体的表面形态和内部结构。
常用的边缘检测算法有Canny算法、Sobel算法、Laplacian算法等。
这些算法都可以在图像中寻找边缘，并将其以线条的形式标记出来，方便我们分析和研究。
4、三维可视化在电镜实验中，我们经常需要观察物体的三维形态，这可以通过三维可视化技术来实现。
在图像处理软件中，我们可以将电镜图像进行三维建模，然后通过旋转、拉伸等操作，让物体的三维形态更加清晰地呈现出来。
此外，还可以使用虚拟现实技术来进行三维可视化，让用户身临其境地观察物体的微观结构。
5、人工智能技术辅助分析随着人工智能技术的不断发展，电镜图像处理也不再局限于传统的方法，人工智能技术在其中扮演越来越重要的角色。
比如，我们可以使用卷积神经网络等深度学习技术来自动识别物体的形态、结构等信息，帮助我们更快速地进行图像分析和处理。
电镜
1、电子显微镜（electron microscope), 简称电镜, 是使用电子来展示物件的内部或表面结构的显微镜。
是显微镜的一种！但电镜是大型精密仪器,其原理、结构与光镜显著不同。
2、原理: 高速运动的电子在电场或磁场的作用下，会发生折射，并且能被聚焦，能聚焦即能成像。
高速运行的电子的波长比可见光的波长短（波粒二象性), 电子显微镜的分辨率（约0.1纳米）远高于光学显微镜的分辨率（约200纳米, 光学显微镜的分辨率受其使用波长的限制)。
3、电镜的种类：按目的分：透射电镜、扫描电镜 分析装置：X-rays 波谱仪、能谱仪；按用途分：生物医学用电子显微镜、非生物医学用电子显微镜； 按原理分:场发射、非场发射； 分辨率:显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距。
其计算公式是σ=λ/NA 式中σ为最小分辨距离；λ为光线的波长；NA 为物镜的数值孔径。
可见物镜的分辨率是由物镜的NA 值与照明光源的波长两个因素决定。
NA 值越大，照明光线波长越短，则σ值越小，分辨率就越高。
要提高分辨率，即减小σ值，可采取以下措施:（1） 降低波长λ值，使用短波长光源。
（2） 增大介质n 值以提高NA 值（NA=nsinu/2）。
（3） 增大孔径角u 值以提高NA 值。
（4）增加明暗反差。
放大倍数到一定程度时就图像模糊，而电子显微镜用电子做光源，可以清晰。
5、常见电镜技术 1、超薄切片技术2、负染色技术3、冰冻复型技术4、冷冻超薄切片技术5、电镜酶细胞化学技术6、免疫电子显微镜技术7、电镜放射自显影技术8、核酸大分子的电镜样品制备技术9、SEM 电镜样品制备技术10、电子探针；11、电镜原位杂交技术。
7、EM 在医学中的应用 ①在基础医学方面：a.观察细胞的亚微结构：线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器的接构及病理变化。
b.观察药物的代谢机理及对亚微结构的影响。
c. 研究病毒的作用机理及作用靶。
d.探讨分子病理学的发生机制。
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④ 应用Fab’－HRP以减少抗体分子量
⑤ 延长作用时间，4℃过夜
⑥ 反复脱水、水化（不适用于膜受体的研究）
4.超薄切片制备
⒈1％锇酸后固定，1h ⒉0.01mol/L pH 7.4 二甲砷酸钠缓冲液内过夜
⒊脱水、浸透（适当压缩时间）
⒋包埋、聚合
⒌超薄切片（如为免疫酶标，不作对比染色，应尽早
步骤、及所示结果，易获成功
缺点：弥散，密度较低，定位精确性较差，不宜对比染色
PDGF-R
2.铁蛋白
12nm颗粒（大），中心是Fe(OH)3 外围蛋白质 分子量大（440KD），穿透力差 易与环氧树脂非特异吸附而出现背景“着色”
3.胶体金 理想
2HAuCl4+ 3H2O2
(还原剂)
2Au–+8HCl+3O2
电镜观察）
包埋后法
制备超薄切片
（镍网或金网）
→ 免疫细胞化学染色
（无需脱树脂）
优点：简便、重复性好、可作多标记 缺点：操作过程中抗原性受损，阳性率低
对策
⒈改用PG、PLP固定 ⒉改用亲水、低温聚合包埋介质
常规用环氧树脂类（epoxy resins）包埋介质 如epon，spurr，araldite等， 疏水、60℃高温聚合
• 切片 超薄切片50nm ± 粘附于铜网上
• 染色
“电子染色” 结构图像之间的反差 醋酸铀—柠檬酸铅双染色法 重金属盐类染色剂
• 电镜观察
免疫电子显微镜技术
免疫电镜（Immunoelectron microscopy,IEM ） 免疫细胞化学反应 高电子密度 亚 细胞水平定位抗原（抗体）
探讨：病因、发病机制，组织发生
（饱和第一重一抗之Fc）
多聚甲醛固定
（灭活二抗中未被中和之Fab）
第二重特异一抗
第二重金标记二抗
IEM技术除广泛应用于透射电镜外亦可
应用于扫描及冷冻蚀刻电镜技术（略）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
IFNg-R
IgG
Κ ，λ
3．免疫细胞化学标记
①用漂染
注意：
② 增加抗体浓度（4～5倍）
③ 1%BSA的应用 ④ 用免疫酶标时，免用H2O2 ⑤ 想方设法增加抗体之穿透力
增加抗体穿透力的措施
① 去垢剂的应用
0.01～0.2% Saponin或Triton X-100 5-10’
② 反复冻融
先浸泡于20％甘油或蔗糖（或10％DMSO），液氮速冻， 室温溶解，重复2～3次
包埋后法（浅表法） 超薄切片制备 → 免疫细胞化学反应→电镜观察
（固定、脱水、包埋、超薄切片）
不包埋法 冰冻超薄切片→免疫细胞化学反应→电镜观察
包埋前法
1. 取材：新鲜、1mm3（脑、脊髓灌注固定后取） 2. 固定与切片： ①前固定：处理好“保持抗原性与保持超微结构”的矛盾 ②复合固定液的应用 PG固定液：1 ～ 4% Paraformaldehyde 0.01～0.2％ Glutaraldehyde PLP固定液：Periodate-lysine-Paraformaldehyde （配制方法见附录） ③厚切片（10～40μm） 振动切片机的应用，或浸泡于20～30%蔗糖溶液、 速冻、冰冻切片 ④继续固定 4℃ 4～5h ⑤彻底清洗 4℃ PBS(含2～5％蔗糖)过夜
注意结合光镜
←X7,500
X45,000→
标记物
酶、铁蛋白、胶体金
1 .酶标记－HRP(40KD) 小，易穿透，稳定
通过戊二醛（过碘酸钠），将抗体IgG或SPA与HRP交联 直接法、间接法、PAP法、ABC法等均可 Fab’－HRP 分子量小（70KD）利于抗体穿透
优点：可借鉴免疫组化（光镜）所用之试剂、操作
兼具包埋前法及包埋后法的优点
步骤： 1.小块组织1～4％多聚甲醛固定（增加组织硬度） 2.浸泡于2.3mol/L蔗糖溶液，平衡渗透压 3.包埋于10％明胶，液氮速冻，超薄切片（50～60nm） 4.置镍网免疫细胞化学染色
双标记或多标记
选包埋后法，金标记（针对不同抗原标以不同直径之胶金颗粒）， 如用间接法，标以不同直径胶金颗粒之二抗如来自同一种类动物时， 防止叠加污染之方法有： 1．双面分别标记，谨慎操作 2．分步固定（灭活） 第一重特异一抗 过量金标记二抗
改用丙烯酸树脂类（acrylic resins）包埋介质 脱水无需太净，粘性小，聚合温度低，非特异性吸附少 如LR White 48～50℃聚合 Lowiryl K4M -35℃聚合 紫外光照启动聚合 HM20/80 -50℃聚合 紫外光照启动聚合 HM23 -80℃聚合 紫外光照启动聚合
不包埋法（冰冻超薄切片法）
胶体金颗粒 （溶胶) —— Au
IgG
(IG)
Au SPA
(PAG)
密度梯度离心 柱层析（S－400） 去除大颗粒聚合物及未标记蛋白 还原剂 白磷 抗坏血酸 枸橼酸钠 5nm 8～13nm >15nm
双标或多标
TNF-R2 ×46000
TNF-R1 ×21000
VWF ×73000
胶金标记之优点：
免疫电子显微镜技术
0.2mm
0.2μm
0.2nm
像差、衍 射效应 像差
电镜基本技术
取材，固定，脱水，浸透，包埋，切片，染色
• 取材 关键 快、准、轻、小 1mm3 组织块
• 固定 戊二醛 — 锇酸双重固定 保存组织的精细结构
• 脱水 丙酮、乙醇梯度脱水
• 包埋 包埋剂—多用环氧树脂类 高温聚合（60oC 恒温箱）
① ③ ④ ⑤ 抗体活性高 ② 可作光镜对照观察（免疫金银法） 可作对比染色，超微结构清晰 可作双标或多标记 颗粒可定量计数
注意： ⒈ 间接法时，一抗不能用Fab’；用PAG时，一抗不能用羊IgG
⒉
小颗粒（5nm）胶体金不易观察
包埋前法（浸透法） 免疫细胞化学反应→超薄切片制备 → 电镜观察
（厚片）