感染性疾病分子诊断2013

二、丙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV) 属黄病毒科。目前发现约90%的输血后非 甲非乙型肝炎和7080%的无输血史的散 发型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致。部 分HCV感染者不出现临床症状，但有 50%会发展成为慢性，且易致肝硬化和肝 癌。HCV主要通过输血感染(是输血后肝 炎的主要致病因子)，也可由静脉注射或 母婴和家庭内接触而获得。
HBV基因组具有独特的结构，是一个长约 3.2 kb的不完全双链环状DNA。双链的长度 不对称，长链(L)因与病毒mRNA互补，定 为负链；短链(S)为正链，5’末端固定，3’末 端位置不固定，S正链的长度可为L负链的 50~100%，因而在病毒群体中出现不同长 度的正链与全长的负链匹配，故仅有部分基 因组长度为双链。HBV基因组L链上至少有 4个ORF，分别称为S、C、P和X，编码外 膜蛋白、核壳蛋白、聚合酶和X蛋白。多个 ORF重叠的结果使HBV本身3.2 kb基因组序 列的利用率高达150~200%。
（一）病毒基因组结构 丙型肝炎病毒呈球形颗粒，直径 约50nm，有一脂质包膜。核心含单股
正链RNA，长9.4 kb。整个基因组只有
一个可读框，位于基因组中央，编码一
条含有
• RNA病毒中的RNA能自我复制，大部分 RNA病毒是单链的，复制一般是先以自己 为模板合成一条互补的单链，病毒原有的、 起模板作用的链称为正链，新复制的RNA 链称为负链。
（二）分子诊断方法
1．PCR
2. 支链DNA技术
3. 核酸杂交 4. 基因芯片技术
逆向斑点杂交法 原理就是将各种探针固定在基质上, 用以检 测受检的各种标记样品中与探针互补的核 酸物质的变化。
• FeO/ Au 纳米颗粒探针法 近年来, 通过纳米表面结合寡核苷酸构成纳 米颗粒基因探针, 用于检测靶脱氧核糖核酸。 其原理是利用DNA 碱基严格互补配对的特 性设计的, 主要应用于分子的组装。
2. 定量检测 可判断HCV的传染性及病 毒复制情况，进行病情评估、判断病人 预后。还可通过对HCV RNA拷贝数的监 测，评价干扰素和其他抗病毒药物的疗 效。另外，人们注意到临床分型与疗效 的关系，发现如III型HCV患者对干扰素 的疗效更佳，此时也需要采用分子生物 学技术对HCV进行病毒分型。
• 拉米夫定作为新一代核苷类高效抗乙肝病 毒药物，可迅速降低HBV-DNA的浓度，改 善肝脏组织的病变，还可能阻止纤维化的 进程，终止肝硬化的发展，尤其是拉米夫 定不受人种、病毒感染的模式、野生型或 基因组前C区突变的影响。该药与干扰素合 用有协同作用。
• 长期服用拉米夫定会引起HBV基因突变而造成耐 药，其中95%是由于HBV基因组P区中高度保守 的YMDD功能区（Y酪氨酸—M甲硫氨酸—D天冬 氨酸-- D天冬氨酸）发生突变：第552位甲硫氨酸 （M）被缬氨酸（V）或异亮氨酸（I）代替，突 变后的HBV称为YVDD变异株和YIDD变异株。由 于变异造成基因组核苷酸与DNA多聚酶的结合能 力有降低，通常变异株的复制能力低于野生株。 当停止应用拉米夫定治疗后，野生株通常会替代 变异株。
HBV 感染的病原学诊断 免疫血清学检测 HBV 的血清学标志物 分子生物学方法检测 免疫学方法测定病毒抗体是一种快速简便的检测手 段, 常用的方法是间接ELISA, 目前我国HBV 检测 采用的第三代ELISA 试剂由多种病毒抗原组合匹 配, 具有较好的灵敏性和特异性, 但其在病毒感染 的窗口期不能检测到抗体, 这在很大程度上限制了 ELISA 检测的准确性, 不能有效的控制病毒的传播, 因而, 发展新的诊断HBV 感染主要依赖分子生物 学技术对病毒DNA 的检测。
分子诊断学
陈昌杰
病因 内因和外因两大类
内因主要指遗传因素，如基因结构、 基因表达状况的改变，其中基因结构的 改变包括点突变、插入、缺失、重排、 易位、基因结构多态性变异、前病毒插 入等；而基因表达状况改变则包括转录 产物的结构或表达量的异常。 外因是指外在的环境因素，如生活方 式、工作环境、精神状况和各种感染性 病原体的侵入等。
（一）病毒基因组结构 HBV是一种可感染人体、且具有独立复制 能力的双链DNA病毒，具有以下几个特点： ① 不完全双链环状结构；② 利用重叠的 开放读码框架(ORF)可编码多个蛋白质； ③ 所有调控序列均位于蛋白质编码区；④ 基因序列具有多变性。HBV基因组是已知 可感染人类又能独立进行复制的双链DNA 病毒中最小和最高效的。
（二）分子诊断方法
1．PCR 2. 核酸杂交 3. bDNA技术 4. 基因芯片技术
1. 定性检测 虽然抗HCV并不是保护性抗体， 临床上可以根据抗HCV来判断是否感染，但 由于患者免疫功能的差异，仅有部分患者出 现抗HCV，且抗HCV尚会出现时阴时阳的表 现。采用分子生物学技术检测到HCV RNA 的存在是HCV感染的确证标志。检测HCVRNA可对丙型肝炎作早期诊断，解决了免疫 学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否 处于隐性或亚临床状态。在HCV的感染中， 第一周内就可以检测出HCV RNA，
• HBeAg 阳性的标本,HBV DNA 通常有较高 的浓度, HBeAg 阴性、抗HBe 阳性的标本, HBV DNA 浓度通常较低。当HBV 基因组 前C 区发生突变时, 则可出现HBeAg 阴性 而HBV DNA 仍保持在较高的浓度。单独抗 HBc 阳性的血液HBVDNA 浓度通常很低。
关于血液中HBV DNA 浓度与患者传染性之间的关 系, 如血清中HBV DNA 浓度大于109 拷贝/ ml, 则
• HBV DNA 检测是乙肝病毒抗病毒治疗的有效监 测指标。乙肝病毒药物治疗后, HBVDNA 含量持 续下降, 然后持续在低水平, 或低至方法学能检出 的含量( 测定下限)以下, 则说明治疗有效。观测抗 病毒药物治疗效果不能凭两三次检测结果来判断, 必须多次动态观察, 每次检测的间隔天数不宜太短, 一般为两周以上。可采用以检测次数为横坐标, HBV DNA 量为纵坐标作图的方法来判断血清 HBV DNA 量的变化趋势, 进而判断抗病毒治疗是 否有效。血循环中HBV DNA 浓度与HBsAg 和 HBeAg 有一定的相关, 但其浓度间并不呈正线性 相关。
诊断策略可以分为以下两种：
一般性检出策略
完整检出策略
一般性检出策略所提供的感染性病原体的信息量
较少，几乎不提供型别（包括变异株性疾病分子诊
断一般性策略只是快速诊断是何种病原体的感染。
为了得到更多的疾病病原体信息，建议应 该采取完整策略按照诊断→分型→亚型→ 耐药性检测的思路，利用多种分子诊断手 段对感染性病原体进行分析。
• 乙型肝炎病毒DNA 等温扩增技术 HBV 的病毒载量与感染状态密切相关, 寻求 快速、简便、灵敏、特异的定量手段是对 HBV 早期诊断、病程监控及流行病学调查 的需求。
（三）临床意义 1．HBV感染的早期诊断 2. 监测治疗效果 3. 判断病情，指导制订合理的治疗方案 HBV DNA定量检测是判断病毒复制情况的指 标。HBV DNA拷贝数越高，病毒复制越厉害， 传染性越强，肝脏病理损害程度越高，肝组 织炎症反应越重。 4. 在乙型肝炎病毒耐药检测中的应用
聚合酶链反应- 限制性片段长度多态性法 该法利用错配PCR 的原理扩增HBV 前C 区 长194 bp,C 启动子区长184 bp 的基因片段, 扩增产物分别经限制性内切酶Bsu 361, Bc1I 酶切, 琼脂糖凝胶电泳, 根据酶切图谱 多态性, 建立检测HBV 前CA1896, BCPT1762/ A1764双变异的方法,
分子诊断对感染性疾病可用于以下几个方面：
适用不易培养的； 种属鉴定； 早期诊断； 动态监测； 流行病学调查； 基因分型； 耐药检测。
感染性病原体进行分子诊断，取决于两个条件： 一是在该病原体核酸中有特异的核酸序列（感 染性病原体本身含有一些保守序列，即使在不 同的基因型这些保守序列的变异也很小，因此 可以根据保守序列设计探针或引物）； 二是能够根据特异的核酸序列设计和制备具有 特定信号的探针或设计合成相应PCR引物，多 数感染性疾病的病原体都具备上述两个条件。
乙型肝炎病毒( HBV) 感染是一个严重的全球问题,
据估计全球大约有20 亿人曾经感染乙肝病毒, 慢 性HBV感染者约315 亿~ 4 亿人, 每年有50 万~ 120 万人死于HBV 感染。我国是乙型肝炎的高发 区, 每年约有10% ~20%的急性乙肝将转成慢性肝 炎, 肝硬化甚至发展成肝癌,严重威胁着人们的健 康, 急性乙肝的慢性化及慢性肝炎癌变的发生机制 是多年来肝病研究的重点。
感染性疾病即由病原微生物引起的疾病的统称 。 外源性感染：指由外界致病病原体侵人人体后导 致的感染，如伤寒、病毒性肝炎等多为外源性感 染。 内源性感染：指由人体自身的正常菌群，在人体 免疫功能下降时引起的感染，因为这些细菌必须 在一定条件下才能致病，所以又称为条件致病菌 或机会致病菌，如肠道菌群中的大肠埃希菌、肠 球菌等引起的感染多为内源性感染。
第一节 病毒的基因检测
人类许多感染性疾病由病毒引起，如肝炎、 脑炎、脊髓灰质炎、流行性感冒、狂犬病、 艾滋病等。根据病毒的核酸成分，可将其分 为脱氧核糖核酸（DNA）病毒和核糖核酸 （RNA）病毒两大类。
一、乙型肝炎病毒 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是引 起病毒性肝炎的主要病原体之一，属嗜肝DNA病 毒科的原型病毒，病毒毒粒中含内源性DNA聚合 酶活性。嗜肝病毒科有独特的复制方式，病毒合 成以RNA中间体为模板，经反转录合成DNA链， 在某些方面，HBV与逆转录病毒有许多相似性。
第十章 感染性疾病的分子诊断
分子诊断（molecular diagnosis）是指 通过检测基因的结构异常或其表达异常，对 人体的健康状态和疾病作出诊断的方法。 评估基因的存在和缺陷通常以DNA为材 料，而评估基因的表达量则以基因转录或翻 译的产物RNA/蛋白质分析来评估个体的生理/ 病理状态。
分子诊断技术主要包括 核酸杂交 聚合酶链式反应（PCR） 基因芯片技术