常见生理测定用方法-2017-5-20-新版

常见生理指标测定用方法

――SOD、POD、CAT、可溶性蛋白、叶绿素、电导率、可溶性糖、MDA、脯氨酸、叶片含水量

SOD酶液可用于SOD、POD、CAT、可溶性蛋白指标的测定，即POD、CAT、可溶性蛋白三个指标不用再取叶片。

SOD酶液的提取。每个重复称取去叶脉的叶片组织约0.25g。剪碎放入预先冷却好的研钵中，加入少量(2-3 ml，因总体积只有9 ml，还要冲洗2次)的磷酸缓冲液(0.05 mol/L，PH=7.8)（不加PVP）研磨成匀浆，然后倒入10 ml的带刻度的塑料离心管中（预先洗好晾干），并用此磷酸缓冲液定容到9 ml。在3000转，4℃高速离心机（提前4℃预冷一下，设好4℃后提前空转运行一下）中离心15分钟，将提取的酶液放入置有冰袋的塑料盒中，低温保存，备用。宜用酶液将4个指标当天测完，切记。

实验一氮蓝四唑(NBT)法测定SOD活力（优先1-用材0.25 g）

1.实验原理

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它的反应产物可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560 nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。

2. 材料、仪器设备及试剂

（一）材料

叶片。

（二）仪器设备

高速台式离心机，分光光度计，微量进样器（要注意测试一下是否准确，用玻璃移液管来对比），荧光灯（反应试管处照度为4000 lx），我们用的光照培养箱，33%的光照下，上数第二个架子中间位置为4000 lx。试管。

（三）试剂

（1）0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.8）。

注：PBS（磷酸缓冲液）配制

母液：A液：0.2 mol/L Na2HPO4溶液：Na2HPO4.12 H2O 71.63 g定容至1000 ml; (计算步骤：358.14*0.2=71.628 g)

B液：0.2 mol/L NaH2PO4溶液：NaH2PO4. 2 H2O 31.20 g定容至1000 ml; (计算步骤：156.01*0.2=31.202 g)

0.05 mol/L pH=7.8 PBS：A液取114.38 ml，B液取10.63 ml，将A与B液混合并用蒸馏水定容至500 ml.（详见李合生版《植物生理生化实验原理和技术》P267）

（2）130 mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399 g Met用0.05 mol/L PBS定容至100ml。

（3）750 µmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.0613 g （精确到最后一位，相差不要超0.0003 g）NBT用磷酸缓冲液定容至100 ml，4℃冰箱中，置于棕色瓶中避光保存。

（4）100 µmol/L EDTA-Na2溶液称取0.0372 g EDTA-Na2，用0.05 mol/L PBS磷酸缓冲液定容至1000 ml。

（5）20 µmol/L核黄素溶液：称取0.0753 g核黄素用蒸馏水定容至1000 ml。（注：核黄素现用现配，不用时严格避光保存，放在棕色瓶中，切记）

3. 实验步骤

1) 酶液提取

称取去叶脉的叶片组织约0.2500 g（精确到小数点后两位），剪碎放入预先冷却好的研钵中，加入少量的磷酸缓冲液(0.05 mol/L，pH=7.8)（不加PVP）研磨成匀浆，然后倒入10 ml的离心管(带刻度)中，并用此磷酸缓冲液定容到9 ml。在3000 r/min，4℃高速离心机中离心15分钟（离心务必澄清，否则再离一次），将提取的酶液放入冰箱中，4℃低温保存。

2)反应混合液的配置(根据测定样品现配，如50或100个样品用量)

每支试管中各溶液显色反应用量：0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.8），1.5 ml；130 mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液，0.3 ml；750 µmol/L氮蓝四唑溶液，0.3 ml；100 µmol/L EDTA-Na2溶液，0.3 ml；蒸馏水，0.10 ml；以上总计2.50 ml。

根据样品的量配制反应混合液。

3)显色反应

取5 ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，每支加入2.50 ml的反应混合液，然后向对照管中加入0.20 ml（200 µl）的0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；向测定管管中加入0.20 ml（200 µl, 酶液用量可以调整，夏枯草采用200 µl）的酶液，然后再迅速向四支试管中分别加0.3 ml的20 µmol/L 核黄素溶液。

混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于4000 lx日光下（置于2#209实验室靠门侧光照培养箱由上往下第二层正中心位置，33%光照度）反应20 min（要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。

注：反应结束应立即测定，以防数值出现较大偏颇。

4) SOD 活性测定

反应结束后，以不照光的对照管作空白，在560 nm 处，分别测定其他各管的吸光度（在测定中测定管与吸收管应该比对照管的吸光度值降低）。

4. 结果计算

已知SOD 活性单位以抑制NBT 光还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD 活性。

T CK E CK V W A V A A g U SOD ⨯⨯⨯⨯-=5.0)()/(总活性

式中：SOD 总活性以每克样品鲜质量酶单位表示(U/g)，A CK 为对照管的吸光度A E 为样品管的吸光度；V 为样品液总体积；V T 为测定时样品用量(mL)；W 为叶片的鲜重(g)。

实验二 过氧化物酶POD 活性的测定

（优先1-用材0.25 g ，同SOD 酶液)

1. 实验原理

在过氧化物酶POD 的催化下，过氧化氢将愈创木酚氧化为茶褐色产物，此产物在470 nm 有最大光吸收,因此测定470 nm 的吸光度变化就可得到过氧化物酶的活性。

2. 材料、仪器设备及试剂

1)材料

新鲜芍药叶片

2)仪器设备

722型分光光度计，离心机，研钵，容量瓶

3)试剂

(1) 0.05 mol/L ，pH=6.0的磷酸缓冲液（用于反应混合液的配制） 注：PBS （磷酸缓冲液）配制

母液：A 液：0.2 mol/L Na 2HPO 4溶液： Na 2HPO 4.12 H 2O 71.62 g 定容至1000 ml; B 液：0.2 mol/L NaH 2PO 4溶液：NaH 2PO 4. 2 H 2O 31.2 g 定容至1000 ml;

0.05 mol/L pH=6 PBS ：A 液取15.375 ml ，B 液取109.6 ml ，将A 与B 液

混合并用蒸馏水定容至500 ml （详见李合生版《植物生理生化实验原理和技术》P267）。

(2) 愈创木酚

(3) 30%过氧化氢

3. 实验步骤

(1) 取两支试管，一只为对照管，一只为试验管。将提取的SOD 酶液取1 ml 加入到实验管中，对照管加1 ml 蒸馏水。将两支试管都放在室内自然上升至室