红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验
红细胞凝集抑制试验
孔号
样品稀释倍 数 PBS
被检鸡样品
1234
5
6
7
2× 4× 8× 16× 32× 64× 64×
25 25 25 25 25 25
25
25 25 25 25 25 25
25
8
9
Hale Waihona Puke 256× 512×25
25
25
25
10
11
12
1024×
抗原对照 红细胞 对照
25
25
25
25
4HAU血凝素 25 25 25 25 25 25
25
25
25
25
25
振荡器上振荡10s混匀，室温放置20min
弃25
1%红细胞
25 25 25 25 25 25
25
25
25
25
25
25
振荡10s混匀，室温作用 15min
结果观察
----
-
-
+
++
+++
++ ++
++ ++
-
注：-表示不凝集；++表示部分凝集；++++表示完全凝集。
血凝抑制效价：能使红细胞凝集全部被抑制的样品最高稀释倍数。
如果配制的4HAU准确，则1:4稀释度为凝集终点；
如果高于1:4，则说明血凝素浓度过高（抗体效价 低于正常值），
如果低于1:4，则说明血凝素浓度过低（抗体效价 高于正常值）。
根据检验结果进行调整，使工作液为4HAU。
四单位验证
血凝试验(HA)及血凝抑制试验(HI)
一、目的要求 掌握HA和HI试验的基本操作技术，了解其实用价值。 二、实验材料 1、禽流感毒 2、1%鸡红细胞 3、生理盐水 4、禽流感阳性血清 5、96孔“V”型微量反应板 三、实验内容 1、HA试验术式表： 2、HI试验术式表： 四、作业 1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原抗体反应？为什么？ 2、HI试验是不是特异的抗原抗体反应？为什么
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1： 2 1： 4 1： 8 ﹟ 以100%凝集病毒最大稀释孔为该病毒的凝集价
血凝抑制试验(HI)
一、概念： 1 、 HI 试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制， 称HI试验。 2、抗体效价：出现红细胞凝集抑制现象的血清的最大稀释倍数叫抗体 效价。
病毒的红细胞凝集试验（HA）
一、 概念 病毒的红细胞凝集现象：许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞 表面受体结合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象。 二、应用 1 、当以被检动物的某一器官为病料，进行HA试验，结果为阳性者，证明 该被检材料中有能凝集红细胞的某种病毒。 2 、凝集价的测定：将被检病毒材料，稀释成不同的稀释倍数，进行 HA试 验，出现血凝现象的各稀释孔中，以100%能出现病毒的红细胞凝集现象的 病毒的最大稀释倍数者即定为凝集价(血凝价)
二、动物体内抗体存在情况 1、当动物感染某病毒而发病时，可在机体的相应器官查出病毒。
2、病毒相当于免疫效应物质中的抗原，病毒进入动物机体，将发生特异
性免疫反应，即产生免疫物质——抗体（ 90%抗体都存在于动物的血清 中），抗原和抗体发生特异性结合反应 3、病畜体内，因受病毒抗原刺激，产生大量相应抗体，故体内抗体效价 较高 4、健康动物，免疫接种后，因受疫苗（抗原）刺激，而发生免疫应答反 应，体内抗体效价较高
血凝及血凝抑制实验
1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢，以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄色，之后直至清亮为清洗干净）。 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸取干净。
血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 七、红细胞制备
一、实验目的
1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法 2、了解新城疫有关背景知识
二、实验内容
1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫苗注射后的抗体检测）
三、实验原理
1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。
病毒颗粒
红细胞
2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；
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红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集抑制试验(HI)
红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集抑制试验(HI)
红细胞凝集试验(HA)和红细胞凝集抑制试验(HI)是两种常见的检验手段，用于检测血液中是否存在抗体，从而诊断某些疾病或病原体感染。
红细胞凝集试验(HA)
红细胞凝集试验(HA)是一种检测抗体与抗原反应的常规方法。
在这个测试中，医生或实验室技术人员将被测血浆放入红细胞凝集剂中，然后与已知抗原混合，比如病毒、细菌或其他病原体。
如果血浆中含有与已知抗原相应的抗体，那么红细胞就会和抗原结合在一起形成凝集。
如果血浆中没有抗体，红细胞就会分散在凝集剂中。
HA 可以检测出许多病原体的抗体，包括流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和风疹病毒等。
红细胞凝集抑制试验(HI)
红细胞凝集抑制试验(HI)也是一种检测抗体和抗原反应的常规方法。
在这个测试中，被测血液中的抗体与已知抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，在复合物中加入未和抗原混合的红细胞，如果血浆中含有抗体，它们会与复合物结合，使得红细胞不会凝集。
如果血液中没有相应的抗体，红细胞就会在复合物中凝集。
与HA相比，HI适用于检测一些病原体，比如肝炎病毒和流感病毒等，但不是所有病原体都适合使用HI进行检测。
红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）是检测抗体和抗原反应的两种常见方法。
这两种技术可用于诊断许多疾病和病原体感染，但需要在临床实验室或医疗机构进行，由专业人员执行。
尽管这些测试非常有用和重要，但仍需要与其他诊断工具和检查方法相结合，以确保诊断的准确性和病人的治疗。
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红细胞凝集试验及红细胞凝集抑制试验1．红细胞凝集试验 采用50孔板或试管法按表1，若采用96孔微量板法按表2进行，用生理盐水将待检抗原按术式稀释成不同倍数，加入1%鸡红细胞悬液。
将50孔板或试管前后左右摇匀；将96孔微量板在振荡器上摇匀，置于20～30℃，20～40分钟后（微量板法时间短, 15～30分钟）判定结果，使50%红细胞凝集的最高稀释度，作为判定终点。
表1 50孔板或试管法测定凝集价 单位：ml孔或管号对照1 2 3 4 5 6 7 8…… 血凝素稀释倍数 10 20 40 80 160 320 640 1280…… 0.5生理盐水0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5……} } } } } } } } 弃0.5待检抗原 0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1%鸡红细胞悬液0.50.50.50.50.50.50.50.50.5表2 96孔微量板法测定凝集价 单位：μl孔号对照1 2 3 4 5 6 7 8...... 稀释倍数 2 4 8 16 32 64 128 256 (25)生理盐水25 25 25 25 25 25 25 25…… } } } } } } } } 弃25 待检抗原 25 25 25 25 25 25 25 25 1%鸡红细胞悬液2525252525252525252．红细胞凝集抑制试验 2.1血凝素凝集价测定 50孔板或试管法按表3，若采用96孔微量板法按表4进行。
表3 50孔板或试管法测定凝集价 单位：ml孔或管号对照1 234567 8……血凝素稀释倍数5 10 20 40 80 160 320 640……0.25生理盐水0.4 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25……}} } } } } } } 弃0.25血凝素 0.1 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.251%鸡红细胞悬液 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.250.25 0.25 生理盐水0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.250.25 0.25表4 96孔微量板法测定凝集价 单位：μl孔号对照1 2 3 4 5 6 7 8…… 稀释倍数 2 4 8 16 32 64 128 256……25生理盐水25 25 25 25 25 25 25 25……血凝素 25 25 25 25 25 25 25 25 1%鸡红细胞悬液 25 25 25 25 25 25 25 25 25 生理盐水252525252525 2525252.2.1 4单位抗原工作液配制 选用上述2.1项抗原进行。
兽医凝集试验
红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）河南省乘风动物保健技术研究所一、实验用设备：●1、离心机1台（3000转离心红细胞）2、冰箱1台（存放抗原）3、振荡器1台（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。
5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用6、移液器1把（5-50微升稀释血清）7、吸头和移液器配套使用8、积液槽配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用9、一次性采血管采血用10、2毫升注射器采血用●11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用13、重铬酸钾配制清洁液用14、硫酸配制清洁液用15、吸管1毫升、10毫升16、吸耳球和吸管配套使用17、针头9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）18、蒸馏水当地买。
清洗96孔V型板、吸头用19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原二、实验前的准备：●抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。
●1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。
在离心机中以3000转/分离心5分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中3000转/分离心5分钟，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4～5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。
放入4℃冰箱中可保存2—3天。
使用时用1ml吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加入9.9ml的生理盐水，此即1%红细胞悬液。
现用现配。
●抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。
●被检血清：每只鸡心脏或翼下采血0.5-1ml,静置或离心，待血清析出后备用。
●吸管清洁液的配制：使用1%的稀硫酸溶液。
水10公斤，硫酸100毫升，将硫酸慢慢倒入水中，不断搅拌，操作时必须戴手套，口罩。
血凝与血凝抑制试验(附思考题及答案)
五、结果判定
• 血凝试验：根据血凝价稀释病毒悬液 • 血凝抑制试验：血凝抑制试验效价：出现完全血凝抑制时的最高
血清稀释度。
Байду номын сангаас
六、思考题
• 1、血凝价判定偏高或者偏低对血凝抑制价的判定结果有什么 影响？
• 若血凝价判定偏高，即稀释的倍数偏高，使得病毒浓度未达 到要求的4个血凝单位，则需要中和病毒的血清更少，即血清 的稀释倍数更大，因此结果会偏高。
将血浆、白细胞等充分洗去，用生理盐水配置成1%红细胞悬液备 用 • 0·85%生理盐水 • 鸡血清
四、实验步骤
• （一）血凝试验 • 1～12孔加入生理盐水 • 第一孔加入50ul病毒悬液，倍比稀释至第11孔 • 1～12孔加入1%的红细胞50ul • 震荡后置于37度恒温箱25～30min后，观察结果 • 病毒的血凝价？ • 病毒的血凝价：能使红细胞产生50%凝集的病毒最高稀释度。
血凝和血凝抑制试验
安尧o
一、实验目的
• 1、掌握病毒血凝与血凝抑制试验的原理。 • 2、掌握试验的设计、操作步骤和结果的判定。
二、实验原理
• 血凝试验（HA）：
• 血凝抑制试验（HI）：
• 某些病毒能够使动物的红细胞发 生凝集现象。
• 红细胞凝集的本质是抗原-抗体 反应，红细胞表面存在凝集原
• 在病毒悬液中加入特异性抗体
• 2、血凝和血凝抑制试验的应用？ • 血凝试验可以检测某种病毒是否具有凝集红细胞的能力，测
定病毒的血凝价、滴度，血凝抑制试验可以检测抗体是否有 效，抗体的效价。
请在此处添加标题
• （二）血凝抑制试验 • 1～11孔加入25ul生理盐水 • 第1孔加待检血清25ul，倍比稀释至第10孔 • 1～11孔加入25ul4个血凝单位的病毒悬液 • 1～12孔加入1%红细胞50ul • 震荡后置37度恒温箱25~30min观察结果。 • 红细胞凝集100%的抑制作为结果判定的终点
血凝和血凝抑制试验
血清
生理盐水 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50
被检血清 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 弃 25μl / /
病毒悬液 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 /
1%RBC 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
实验八 血凝和血凝抑制试验
（Hemagglutination and Hemagglutination Inhibition, HA and HI）
2013.12.11
能凝集红细胞的病原
禽流感病毒 新城疫病毒 传传染性支气管炎病毒（胰酶，磷脂酶C） EDS76 副鸡嗜血杆菌 鸡毒支原体
＝1:23为可疑
六、思考题
血凝和血凝抑制试验在兽医学中的应用。
细胞对照
HA HI
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 RBC RBC
稀释倍数 1:21 1:22 1:23 1:24 1:25 1:26 1:27 1:28 1:29 1:210
生理盐水 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 病毒悬液 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 弃 5/0μl / 1%红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
3. 0.85%生理盐水。 4. 被检血清，采自被检鸡的健康血清。
四、实验步骤
（一）血凝试验（HA）
1. 1~12孔加入50μl生理盐水; 2. 第1孔加50μl病毒悬液，倍比稀释到第10孔； 3. 1~12孔中加入1%的红细胞50μl； 4. 震荡后置37℃25~30min观察结果。 5. 病毒液的血凝价是1:2？。
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红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验流感病毒表面的血凝素（HA）蛋白，含有识别和结合宿主细胞表面受体的结构，能使一些特定的红细胞发生凝集现象。
当红细胞和病毒按适当的比例混合后，由于病毒的作用使红细胞发生凝集，此为凝集现象。
含有特异的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制红细胞凝集现象的出现，即抗体与病毒结合后，可以使血凝素不能吸附于红细胞表面的受体上，此为红细胞凝集抑制（HAI）。
微量红细胞凝集抑制试验是目前最常用的一种鉴定流感病毒型/亚型及分析流感病毒HA抗原性变异的试验方法，也可以用于对一般人群抗体水平的检测和疫苗效果的评价等方面。
用于HAI试验的标准参照血清必须及时更新，用于鉴定流感病毒型/亚型应包括当年的国际疫苗株或国内流行代表株的抗血清，可以用羊、鸡、雪貂、兔等实验动物的抗血清；用于抗原分析的抗血清建议包括同一型别和亚型不同毒株免疫的标准参考抗血清，由于用雪貂制备的抗流感病毒血清特异性高，易将不同毒株间抗原性差异显示出来，因此常用免疫雪貂的抗血清进行抗原分析。
HAI试验中所用的血清必须经特殊处理以去除非特异性抑制素及非特异性凝集素。
（一）生物安全要求所有有关试验操作都应在相应生物安全级别的实验室中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定，做好个人防护要求。
季节性流感病毒病毒或经完全灭活的高致病性禽流感病毒操作可以在BSL-2实验室里进行，高致病性禽流感病毒的操作在BSL-3级实验室中进行。
（二）实验所用试剂1．标准参考抗原：以国际疫苗株和国内流行株作为标准参考抗原，新分离的毒株作为待测抗原。
2.标准参考抗血清：以国际疫苗株和国内流行株制备的抗血清作为标准参考血清。
血清要经RDE处理。
（三）其他试剂/材料/仪器1. 红细胞悬液2. PH7.4的PBS缓冲液3. RDE（日本生研）4. 水浴箱（37℃，56℃）5. 台式离心机6. 多道可调加样器、单道可调加样器7. 离心管8. 96孔微量血凝板（使用豚鼠和人红细胞进行实验须用“U”底板，使用火鸡红细胞进行实验用“V”底板）9. 200µL、1000µLTIP头、水槽表1. 流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较红细胞火鸡豚鼠人“O”型血终浓度0.5 0.5 0.5 孔底部形状V型U型U型孵育时间25-30min 45-60min 45-60min 红细胞沉积形状细胞沉积成点状，倾细胞沉积细胞沉积成斜时细胞向下流成泪成环状环状滴状（四）流感病毒鉴定和抗原分析步骤1. 实验前准备（1）标准参考抗血清的处理1）去除血清中的非特异性抑制素a）所谓抑制素是指各种动物血清、体液、组织液中所含与红细胞表面受体相似的物质，它们能与红细胞受体一起竞争性地被病毒表面血凝素所识别和结合。
目前所知道的非特异性抑制素，除大白鼠血清中对丙型流感病毒特殊的非特异性抑制素，还有三种：α、β和γ。
在HAI试验中，必须将非特异性抑制素从抗血清中去除干净，才能准确地测定出HAI的抗体效价。
常用的清除非特异性血凝抑制素的方法有霍乱滤液（RDE，受体破坏酶的一种）清除法，过碘酸钾清除法等。
b）RDE处理步骤：用25mL生理盐水稀释RDE；在1体积血清中加入3体积RDE（如0.1mL血清+0.3mLRDE），37℃水浴16-18h；56℃水浴30 min；加入6体积生理盐水（在0.4mLRDE和血清混合物中加入0.6mL生理盐水）。
2）去除非特异性凝集素a）向20体积RDE处理后的血清中加入1体积的纯血球。
b）完全/彻底混匀，在2-8℃孵育，每15 min重新混匀一次。
c）1h后，2000转离心5min。
吸出血清上清液。
d）取出一块96孔血凝板，在第一列每孔加入50uLPBS缓冲液,吸出50uL处理好的血清，做2倍稀释，加入50uL红细胞悬液，室温静置30-60min,观察试验结果，如果红细胞沉积，证明血清中非特异性凝集素去除干净（去除非特异性凝集用红细胞类型与下一步试验用红细胞类型一致）。
（2）红细胞悬液配制1） A.S液全称为Alsever氏液。
配制方法为葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g、去离子水加至100mL，微热溶解，将pH值调到6.1，8磅20min高压灭菌，4℃贮存备用。
2）将含有红细胞的A.S液，离心5min（火鸡/鸡红细胞1800rpm；人“O”型、豚鼠红细胞2000rpm，不同离心机转速稍有不同），弃上清。
3）加入等量的PBS缓冲液洗涤，充分混匀，离心5min（转速同上），弃上清。
PBS缓冲液洗涤三次。
最后一次洗涤后，离心10min（转速同上），弃上清。
4）吸出适当体积的红细胞，用PBS缓冲液配制成工作浓度为1%红细胞悬液。
2. 流感毒株HA滴度的测定（1）在微量血凝板的第2~12列加入50µL PBS缓冲液。
（2）在第一列（A1~G1）中加入100µL病毒悬液。
（3） H1加入100µL PBS ，作为红细胞阴性对照。
（4） 从第一列各孔吸50µL 病毒液，由第1列至第12列做2倍系列稀释，最后一列每孔弃去50µL 。
（5） 在每孔中加入50µL 红细胞悬液，轻拍血凝板，充分混匀。
（6） 室温孵育，鸡和火鸡红细胞静置25-30min 后观察结果，人“O ”型和豚鼠红细胞45-60min 后观察结果，并记录。
3. HA 试验结果判断引起全部红细胞凝集为完全凝集，以“+”记录；只有部分红细胞凝集记录为“+/-”；无凝集记录“-”。
血凝滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的血凝滴度。
表2. HA 滴度判定举例病毒稀释度 HA 滴度 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A + + - - - - - - - - - - 2 B + + + + - - - - - - - - 8 C + + + + + - - - - - - - 16 D + + + + + + - - - - - - 32 E + + + + + + + - - - - - 64 F + + + + + + + + - - - - 128 G + + + + + + + + + + + + ≥2048 H ------------＜14. 制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位的抗原（1）一个凝集单位指能引起等量的标准化的红细胞凝集的病毒量。
进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个血凝单位的病毒量。
（2）制备4个单位血凝抗原时，首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。
如每种血清做8孔稀释，每孔用抗原25µL，则测定一份血清需0.2mL抗原。
根据标准抗血清的份数计算出实验所需病毒抗原总量。
（3）其次，计算出病毒稀释度。
用病毒的HA滴度除以8，得到的商即为配置4个血凝单位所需的稀释度。
如，某病毒的HA滴度为64，除以8等于8，则1:8（1mL病毒液加7mLPBS缓冲液）稀释该病毒即可得到4个血凝单位的抗原。
注：红细胞凝集抑制试验中所用的4个血凝单位是指每25µL病毒液中含有4个血凝单位（等于50µL病毒液中含有8个血凝单位）。
表3. 所需抗原总量为1600µL时，4个血凝单位配置对照表HA滴度病毒液(µL) PBS(µL)16 800 80032 400 120064 200 1400128 100 1500256 50 1550512 25 15751024 12.5 1587.52048 6.25 1593.755. 4个血凝单位抗原的复核滴定（1）为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误，新配置的4个血凝单位抗原需复核滴定。
操作方法同HA实验步骤。
（2）如果只有前4孔出现凝集，表明每50µL病毒含有8个血凝单位，该病毒稀释准确，可以用于红细胞凝集抑制试验。
如第5孔也出现凝集，说明每50µL病毒含有16个血凝单位，该抗原必须等量稀释。
如只有前3孔凝集，表明每50µL病毒仅含4个血凝单位，病毒量需加倍。
此外，4个血凝单位抗原必须每次现用现配。
6. 红细胞凝集抑制试验（HAI）（1）利用HAI方法进行流感病毒的鉴定红细胞凝集抑制试验（HAI）鉴定未知病毒，每块96孔血凝板可以检测两株未知病毒。
1）在血凝板的第1- 5、7-11列每孔加入25µL PBS缓冲液，第6和12列每孔加入50µLPBS。
然后在A1-A4、A7-A10各孔分别加入：抗A(H1N1)pdm09流感病毒标准参考血清、抗季节性A(H3N2)流感病毒标准参考血清、抗B-Yamagata系流感病毒标准参考血清、抗B-Victoria系流感病毒标准参考血清25µL，用多道移液器从A1-A4、A7-A10行每个孔分别取25µL，由A至H行做2倍稀释血清，最后一行弃去25µL。
2）第1至4各列每孔加入25µL4血凝单位待检抗原1, A7至A10各列每孔加入25µL4血凝单位待检抗原2。
第5和第11列加入25µLPBS缓冲液，作为红细胞对照。
第6和第12列第一孔分别加入50µL8血凝单位待检抗原1和2，由A 至H行做2倍稀释，最后一行弃去50µL，此处做法的目的是HAI实验同时验证所配置4单位抗原的准确性,确保实验结果准确。
a）阳性对照：将试剂盒中的各型/亚型流感病毒标准参考抗原按照上述步骤进行检测。
3）轻拍，混匀，室温孵育30min。
4）每孔加入50µL配置好的红细胞悬液，轻拍混匀，室温静置30-60min，观察血凝抑制实验结果（具体孵育时间根据使用的不同种类血球来定，详见表1）。
（2）利用HAI方法进行流感病毒的抗原分析1）验证4血凝单位抗原步骤同以上，如果4血凝单位结果不准确需重新配置，直至回滴结果准确为止，在进行抗原分析时4血凝单位抗原一定要配制准确，保证病毒之间抗原分析结果有可比性。
2）在微量血凝板的第1-11列每孔加入25µLPBS缓冲液，第12列每孔加入50µLPBS缓冲液。
在第一行（A1-A11）每孔加入25µL对应待检流感病毒型/亚型的抗原分析用参考抗血清及阴性对照血清。
3）从第一行（A1-A11）各孔混匀之后吸取25µL血清，由第1行至第8行做2倍系列稀释，最后一行每孔弃去25µL液体。
4）在微量板的第1-11列每孔加入25μL配制好的4血凝单位抗原，第12列A12孔加入50µL配置好的8血凝单位抗原，由第1行至第4行做2倍系列稀释，最后一行每孔弃去50µL液体。