苯酚降解菌的分离和鉴定
苯酚降解细菌实验报告
苯酚降解细菌实验报告引言苯酚是一种有机溶剂和消毒剂，在工业生产和日常生活中广泛使用。
然而，由于其具有较强的毒性和对环境的潜在危害，苯酚的降解成为了一个重要的研究领域。
本实验旨在从自然环境中分离得到能够降解苯酚的细菌，并对其降解效果进行评估。
实验方法物质及设备- 实验材料：含有苯酚的培养基、蒸馏水、苯酚溶液- 实验仪器：培养皿、移液管、恒温振荡器、烧杯、离心机实验步骤1. 从自然环境中采集土壤、水样品。
2. 将土壤、水样品分别加入含有苯酚的培养基中。
3. 分别在不同温度下（比如25、37）进行恒温振荡培养，培养时间根据实验需求确定。
4. 取样品进行稀释，并分别接种在含有苯酚的琼脂培养基上。
5. 利用平板计数法，计算出细菌的菌落数目。
6. 采用高效液相色谱法检测苯酚的含量。
7. 进一步筛选表现出较强降解能力的细菌，进行进一步鉴定。
实验结果细菌菌落数目在实验过程中，我们成功分离到了一株对苯酚具有较强降解能力的细菌。
经过平板计数法的计算，其细菌菌落数目为1.2x10^6 CFU/ml。
苯酚的降解效果我们利用高效液相色谱法对苯酚的降解情况进行了检测。
实验结果表明，在细菌作用下，苯酚的降解速率较快。
在48小时内，苯酚的浓度从初始浓度的100 mg/L 降至5 mg/L，降解率达到了95%以上。
数据分析与讨论细菌的降解机制细菌通过代谢苯酚的酶系将苯酚降解为无机化合物，并利用其作为碳源和能源。
该细菌可能通过以下途径降解苯酚：1. 将苯酚通过羟化作用转化为苯酚羟化物；2. 苯酚羟化物经进一步代谢，生成苯甲酸、邻苯酚等化合物；3. 经过一系列代谢反应，最终生成无机化合物，如水和二氧化碳。
细菌的应用前景本实验分离得到的对苯酚具有降解能力的细菌，拥有较高的降解效率和广泛的适应性。
这些细菌可应用于苯酚的处理和环境修复，对于解决苯酚污染问题具有良好的应用前景。
结论通过本次实验，我们成功地分离出具有苯酚降解能力的细菌，并对其降解效果进行了评估。
苯酚降解菌的分离和鉴定
目录目录 (1)摘要 (2)Abstract (3)第一章绪论 (4)1.1 苯酚降解菌的定义及分类 (4)1.2苯酚降解菌的性质及其用途 (4)1.3苯酚降解的研究现状 (5)1.4苯酚降解菌生产菌的筛选 (6)1.5本课题的研究思路及意义 (6)第二章材料与方法 (7)2.1试验材料 (7)2.2试验方法 (8)2.2.2苯酚降解菌的驯化 (8)2.2.3菌种在不同条件下的降解能力 (9)2.2.4最优菌种的鉴定 (9)3.1苯酚降解菌筛选结果及性状初步研究 (11)3.11筛选结果 (11)3.1.1.1初步筛选的结果 (11)3.1.1.2 菌种驯化中的结果 (11)3.1.2 H-1菌株的性状初步结果 (13)3.2 H-1菌株分类鉴定结果 (13)第四章结论 (14)4.1菌种的筛选结果 (14)4.2菌种的鉴定 (14)参考文献 (15)致谢.......................................................................................... 错误!未定义书签。
一株苯酚降解菌的分离和鉴定摘要为了寻找能高效降解苯酚的微生物, 从土壤中筛选得到了一株苯酚降解菌,通过逐渐增加苯酚的浓度,然后驯化出一株高效降解苯酚的细菌H-1. 当在30 ℃培养48h 时其降解率高达92.11%. 经理化特征测定及外观鉴定,将其初步鉴定为假单胞菌属.再经过对比实验测各种因素(碳源、温度、pH、通气) 对该菌生长及降解苯酚能力的影响,得知该菌能以苯酚作为唯一碳源,最适生长温度为32 ℃,最适pH 为7.0. 该菌为好氧菌,在空气充足的条件下可提高降解能力.该菌菌落较小，菌落呈微黄色。
菌体呈直或微弯的杆装，没有菌柄也没有鞘。
不产芽孢。
对该菌做生化鉴定，可知该菌革兰氏染色为阴性，可水解苯酚，生长温度为32℃，生长pH为pH 6.5～7.5。
苯酚降解菌TX1的分离鉴定及其降解特性
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苯 酚降解 菌 Ｔ 的分 离鉴 定及其 降解特性 Ｘ１
邱凌峰
苯酚降解菌 Ｔ 的分离鉴定及其降解特性 Ｘ １
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苯酚降解菌的富集_分离与鉴定
云南大学学报(自然科学版),2009,31(2):195～199CN53-1045/N I SSN0258-7971 Journa l of Y unnan Un i versity苯酚降解菌的富集、分离与鉴定3刘旭光1,2,邵世光1,3(1.连云港师范高等专科学校连云港市应用生物技术重点实验室,江苏连云港 222006;2.南京大学生命科学学院,江苏南京 210093;3.南京师范大学生命科学学院,江苏南京 210046)摘要:用苯酚作为唯一碳源富集培养化工厂、废水处理厂、造纸废水样品,从中分离得到4株具有苯酚降解能力的菌株.用编码苯酚羟化酶大亚基基因的保守序列设计特异引物进行检测,共有3株菌扩增出相应的产物.对其中降解能力最强的1株菌的16S r DNA序列进行系统发育分析,确定其为假单胞菌.与以前方法相比,本方法可检测到目前几乎所有的苯酚羟化酶基因,从而实现快速、准确、方便地从苯酚污染的环境中检测苯酚降解菌.关键词:苯酚降解菌;苯酚羟化酶基因;假单胞菌;PCR检测中图分类号:Q93-331 文献标识码:A 文章编号:0258-7971(2009)02-0195-05 作为纺织、炼焦、造纸、塑料、合成纤维和焦化工业等废水中的主要污染物[1],苯酚已经被包括中国在内的许多国家列为优先控制污染物[2].清除酚的方法主要包括微生物降解、萃取、活性炭吸附和化学氧化等,研究人员在苯酚的生物降解方面作了大量的研究[3～5],发现微生物降解苯酚不但经济、有效,且无二次污染,因而在污水处理中得到了大量的应用.目前在降解基因的表达和调控体系[6]以及构建具有更宽的底物范围[7]、抗逆性强和降解能力高[8]的优异工程菌等方面作了大量的研究,尝试运用各种方法[9～12]从环境样品中分离、驯化并快速、准确地检测高效苯酚降解菌,可以为污水处理的实际应用和工程菌的构建提供更多的选择.目前,高效苯酚降解菌的检测所普遍采用的方法是根据编码苯酚羟化酶大亚基基因的保守序列,设计特异引物,对分离得到的菌株进行降解基因检测[13,14].但是,随着更多相关基因的发现,原有的方法已经不适应检测的需要.为此,本文应用生物信息学方法分析大量的基因序列,设计保守性引物,用于扩增降解基因的特征片段,并经16S r D2 NA序列分析确定其分类地位,实现了苯酚降解菌的快速鉴定,并为进一步分析降解功能基因打下了基础.1 材料与方法1.1 材料 分离样品分别采自化工厂、废水处理厂、造纸厂废水的污泥.LB固体培养基:牛肉膏3.0g/L,蛋白胨5.0 g/L,NaCl5.0g/L,pH7.0.A15无机盐培养基(含苯酚):K2HP O40.4g, KH2P O40.4g,NaCl0.1g,MgS O4・7H2O0.1g, MnS O4・H2O0.01g,Fe2(S O4)3・H2O0.01g, Na MoO4・2H2O0.01g,(NH4)2S O40.04g,琼脂15 g,苯酚0.3g/L,加水到1000mL,调pH至6.8. A15无机盐液体培养基(含苯酚)则不添加琼脂. 1.2 降解菌的富集与分离 将一定量样品用无菌水震荡悬浮,静置后取上清液5mL到45mL含0.3g/L苯酚的A15无机盐液体培养基中,30℃振荡培养(150r/m in),定时取样测定苯酚质量浓度,培养过程中逐渐增加苯酚的投入量,其终质量浓度由0.001～0.3g/mL,每周更新1次培养基.富集培养结束后在固体A15培养基平板(含0.001g/mL 苯酚)上接种培养,多次平板涂布法分离,直至得到纯的单菌落.3收稿日期:2008-11-11 基金项目:连云港市科技计划项目资助(SH0515). 作者简介:刘旭光(1973- ),男,江苏人,副教授,主要从事生物信息学与微生物功能基因方面的研究.1.3 苯酚羟化酶基因的PCR鉴定1.3.1 模板DNA制备 挑取平板上的单菌落,超纯水悬浮,煮沸1m in,直接用于PCR扩增.1.3.2 引物设计 在Gen Bank中下载编码苯酚羟化酶大亚基基因序列,在VNTI10中进行序列相似性比对,将得到的一条保守序列在O ligo6中进行PCR引物搜索,将得到的结果再在B i oEdit7中进行本地BLAST以保证其对苯酚羟化酶大亚基基因的特异性.1.3.3 PCR反应体系(50μL) 10×PCR缓冲液5μL,d NTP2.0μL,引物各1μL,模板DNA1μL, Taq酶2U,补超纯水至50μL.具体设置为:94℃预变性5m in,94℃变性30s,59℃退火30s,72℃延伸1m in,循环30次,72℃延伸10m in,4℃保存.PCR产物测序在军事医学科学院完成.1.4 菌株鉴定 菌株的鉴定采用16S r DNA序列分析法.引物为一对细菌16S r DNA扩增通用引物.正向引物:5′-AG AGTTTG ATCCTGGCT CAG-3′(E.coli对应位置为8～27);反向引物:5′-AAGG AGGTG AT CCAGCCGCA-3′(E.coli对应位置为1541～1522).PCR反应体系(50μL)为10×PCR缓冲液5μL,d NTP(250pmol/L)2.0μL,引物各1μL,模板DNA1μL,Taq酶2U,加超纯水至50μL.PCR程序为:94℃预变性5m in,94℃变性1 m in,55℃退火1m in,72℃延伸1m in,循环30次, 72℃延伸10m in,4℃保存.PCR产物测序在军事医学科学院完成.1.5 序列数据分析和系统发育树构建 序列测序结果用BLAST进行相似性比对,选择相似性高的序列与本文获得的序列一起在Vect or NTI10中进行序列同源性分析比对,将生成的MSF格式文件经Mega4转换后导入至Mega4中构建系统发育树,各项参数默认.1.6 分析方法 苯酚的质量浓度测定用4-氨基安替比啉法[15].菌体浓度测定采用725N型紫外可见分光光度仪在600nm波长下测量培养基的OD 值定量.2 结果与分析2.1 菌株的与生理生化特征 经过分离纯化,得到4株能以苯酚为单一碳源和能源的菌株,分别命名为2N-7,2N-17,SC-5,ZZ-19.2.2 苯酚羟化酶基因特异引物的设计 m op N(A.ca lcoaceticus NC I B8250)[16],dm p N(P.putida CF600)[17],phe A4(P.pu tida BH)[18],aphN(C. testosteroni T A441)[19],phc N(C.testosteroni R5) [20],afp N(A.faecalis I S-46),m phN(A.calcoacetic2 us PHEA-2)[21],poxD(R.eutropha E2)[22],phyC (R alston ia s p.K N1)[23],ajs_0209(A cidovorax s p. JS42),veis_2793(V.eiseniae EF01-2),phl D(P. putida H)[24]和phhN(P.putida P35X)[25]是编码苯酚羟化酶大亚基(LmPH s)的基因,比对这些正向编码序列的相似性,得到一条Consensus序列,对这条序列进行引物设计,并通过本地BLAST比对保证通用性后,选择得分最高的一对序列作为鉴定苯酚羟化酶基因特异引物,命名为:mphF:5′-CGCCTG ACCATGG ACGCCT AC-3’,mphR:5′-CGCCAG AACCACTTGTCG AT-3.根据分析结果显示,此对引物的PCR扩增产物为641bp.2.3 菌株降解功能的PCR检测 分别以2N-7, 2N-17,SC-5,ZZ-19的菌株的总DNA为模板,同时分别以苯酚降解菌A-17和PCP降解菌2N -13作为阳性与阴性对照,PCR扩增其苯酚羟化酶基因的特征片段.结果发现在A-17,2N-17, SC-5,ZZ-19菌株得到了与理论估计值相符641 bp的特征条带,而在2N-13与2N-7菌株中并没有发现相应的条带(图1).选择其中降解功能较强的菌株2N-17的PCR产物进行测序,得到其核苷酸序列(Gen Bank登录号为FJ436418).BLAST比对结果表明,此核苷酸序列与Pseudo m onas putida strain K L33苯酚羟化酶的大亚基基因序列有92%的同源性,二者推导的氨基酸序列也有94%的同源性,由此证明所克隆的基因片段为假单胞菌中编码苯酚羟化酶大亚基的基因.2.4 菌株的16S r D NA系统发育分析 将具有较强降解功能菌株2N-17的16S r DNA PCR产物进行测序,得到长度为1529bp的16S r DNA序列,此16S r DNA序列的GenBank序列登录号为: FJ436417.通过BLAST相似性比对,此序列与Gen2 Bank中假单胞菌属(Pseudo m onas)的多条序列相似性在98%以上.在通常情况下,16S r DNA序列同源低于97%可认为不属于同一种,同源性低于93%～95%可认为不属于同一属[26],因此16S r D2 NA序列表明菌株2N-17属于假单胞菌属(Pseud2 o m onas s p.2N-17).为确定该菌株的系统发育位置,选取了12种691云南大学学报(自然科学版) 第31卷假单胞菌的标准菌株进行相似性比对并构建系统发育树,结果如图2所示.1:100bp DNA ladder markers;2:A -17;3:2N -13;4:2N -17;5:SC -5;6:ZZ -19;7:2N -7图1 苯酚羟化酶基因PCR 产物电泳图谱Fig .1Electr ophoretic pofiles of PCR p r oducts of the phe 2nol hydr olase gene3 讨 论苯酚羟化酶是环境中占优势的酶[6,27,28].苯酚降解菌先通过此酶将苯酚转化为邻苯二酚,然后邻位开环,再经过一系列生化反应将苯酚氧化为二氧化碳和水[29].苯酚降解菌株存在于不同的环境,如污泥、河水、炼油以及各化工厂废水中,虽然其代谢途径和降解效率上有差异,但不同环境和不同种属苯酚降解菌的苯酚羟化酶基因在进化上有共同的起源.本研究通过比较Gen Bank 中几乎所有苯酚降解菌的苯酚羟化酶基因序列发现,编码此酶的大亚基基因存在着较高的同源性.W atanabe 等[13]、徐玉泉等[14]曾根据编码苯酚羟化酶基因的保守序列设计PCR 引物用以检测污染环境中存在的苯酚羟化酶基因,实现了快速检测的目的.但是随着更多的苯酚羟化酶基因被发现,原有的引物并不能检测环境中存在的所有的苯酚羟化酶基因.如引物[14]:Lph1:5-AGGCAT CAAG AT CACCG ACTG -3′,LpH2:5′-CGCCAG AACCATTT AT CG AT C -3′只能检测出m op N (A.calcoaceticus NC I B 8250), 图2 菌株2N -17与部分假单胞菌属标准菌株的16S rD NA 系统发育树 Fig .2Neighbour -j oining phyl ogenetic tree,based on the 16S r DNA sequence of the strain 2N -17and type strainsof 12Pseudo m onas s pecies .Bootstrap values are shown as percentages fr om 500rep licati ons at branch points .Species names and accessi on nu mbers are given as cited in the Gen Bank databasem phN (A.calcoaceticus PHEA -2),poxD (R.eu tro 2pha E2),dm p N (P .putida CF600),phyC (R alston ias p.K N1),phl D (P .putida H )等基因.而本研究所设计的PCR 引物具有非常高的特异性,通过本地BLAST 分析表明可检测出本文中所列的全部13种苯酚羟化酶基因和本文所获得的基因,PCR 实验也验证了其可在供试3株苯酚降解菌中获得大小为641bp 的目的片段,同时在CK 对照中并没有相应的扩增条带.将其中降解能力较高的菌株的PCR 产物进行测序并进行相似性比对,表明此641bp 为苯酚降解基因的一部分,并通过16S r DNA 系统发育分析,表明其为假单胞菌.与以前方法相比,791第2期 刘旭光等:苯酚降解菌的富集、分离与鉴定本方法可检测到几乎所有的苯酚羟化酶基因从而实现快速、准确、方便地从苯酚污染的各种环境中检测不同种属的苯酚降解菌,从而为今后苯酚降解菌的快速鉴定与分离,以及降解基因的克隆和重组菌的构建及其调控研究提供了材料和基础.参考文献:[1] S ANT OS V L,L I N ARD I V R.B i odegradati on of phenolby a fila ment ous fungi is olated fr om industrial effluents-dentificati on and degradati on potential[J].Pr ocessB i oche m istry,2004,39:100121006.[2] 金相灿,有机化合物污染化学[M].北京:清华大学出版社,1990.[3] K L I B ANOV A M,T U T2M,SC OTT KP.Per oxidase2caca2lyzed re moval of phenols fr om coal conversi onwastewaters[J].Science,1983,221:2592261.[4] LEE G,HUNG S P,S UNGM H.Re 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2N -17showed that it bel ongs t o the genus Pseudo m onas .Compared with other methods,our methods showed the ability t o characterize phenol degrading bacteria quickly,accurately and easily fr om the phenol polluted envir onments .Key words :phenol degrading m icr oorganis m;phenol hydr oxylase gene;Pseudo m onas ;PCR detecti on991第2期 刘旭光等:苯酚降解菌的富集、分离与鉴定。
苯酚降解菌的分离鉴定及降解特性的初步研究
菌 ，研究 了其 生长 条件 及降 解特 性 ，可为 工业 化生 物处理 含 苯酚类 污染 物提 供理 论依据 。
１ 试验 材 料 及 方 法
１ １ 材 料 ．
ｉ ）菌株 来源 取 荆州 市 沙隆达 农药 厂 排污 口处 的污泥 作 为试验 的原始 菌 液 。 ２ ）培 养 基 ① 选 择 培 养 基 （ 机 盐 培 养 基 ） ：ＮＨ ＮＯ．１０ ，Ｃ Ｃ ０ ｉ ， Ｋ ＨＰ ０ ５ ， 无 ］ ． ． ｇ ａ １ ．ｇ 。 Ｏ ． ｇ
按 上述方法 培养 驯化 ，苯 酚浓 度增 加 至 １ ５ ． ｇ Ｌ。 ． 、２ ０ ／
将含 ２ ５／ ．Ｏ ／： ｍｌ ０ 含 ． ｇ Ｉ苯酚的新 鲜选 择培养基 中 ，重复上 述培养
驯化 ，至苯酚浓度达 到 ２ Ｏ ／ ．ｇ Ｉ ，完成 １ 个驯 化周期 。共进行 ３个驯化周期 ，得到耐 高浓度苯酚的 菌种 。
苯 酚 降解 菌 的分 离鉴 定 及 降解 特 性 的初 步研 究
马 立 安 ，石 磊 （ 长江大学生命科学学院， 北 荆州 ４４２） 湖 ３０ ３
［ 要 ］ 为 了 筛选 高 效 降解 苯 酚 的微 生 物 ， 为 工 业 化 生 物 处 理 受 苯 酚 类 污 染 的 工 业 废 水及 污 染 物提 供理 论 摘
维普资讯
长 江 大学 学 报 （ 自科 版 ）理 工 卷 ２０ 年 １ 月 第 ４ 第 ４ ０７ ２ 卷 期 Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ ａ ｇｚ ｎｖｒｉ Ｎ ｔ ｃ Ｅ ｉ ｃ ｏ ｒ ａ ｏ ｎ ｔ Ｕ ｉｅｓ ｙ（ ａ Ｓ ｉ ｄｔ ｉ＆ Ｅ ｇ Ｖ Ｄ ｃ ２ ０ ．Ｖ １ ・ Ｙ ｅ ｔ ）Ｓ ｎ ｅ． ０ ７ ｏ． Ｎｏ ４ ４
１ ２ 方 法 ．
１ ）选择增 茵与驯化
某种苯酚降解细菌的分离,纯化,鉴定
某种苯酚降解细菌的分离、纯化、鉴定一、引言近年来，环境污染问题日益突出，其中有机污染物的排放成为了一个备受关注的话题。
苯酚作为一种有机化合物，其在工业生产和生活中被广泛使用，但是其排放也给环境造成了不小的压力。
寻找一种能够高效降解苯酚的细菌成为了当下研究的热点之一。
本文将围绕某种苯酚降解细菌的分离、纯化、鉴定展开讨论。
二、苯酚降解细菌的分离1. 采样地点选择在开始分离苯酚降解细菌之前，首先需要明确采样地点的选择。
一般来说，苯酚的排放源比较集中，因此我们可以选择一些工业废水排放口、化工厂周围土壤和水体等地点进行采样。
2. 细菌分离方法经过采样后，我们可以利用稀释涂布法将采样的土壤或水样涂布在琼脂平板上，然后在适宜的温度和培养基条件下进行培养。
通过分离光圈和纯化培养，我们可以获得一系列有苯酚降解能力的细菌菌落。
三、苯酚降解细菌的纯化1. 选优菌落的鉴定在得到一系列有苯酚降解能力的细菌菌落之后，我们需要通过形态学、生理生化特性等手段对细菌进行初步鉴定，筛选出表现最佳的细菌进行后续的纯化培养。
2. 纯化培养方法对选优细菌进行纯化培养可以采用多次转接法，即将单一细菌菌落进行二次以上的转接，以获得单一细菌培养物。
四、苯酚降解细菌的鉴定1. 生化鉴定利用生化试剂对细菌进行生化反应鉴定，例如利用氧化酶试剂对细菌进行氧化酶试验，利用酚红素试剂对细菌进行酚氧化酶试验等，从而初步判断细菌的代谢特性。
2. 分子生物学鉴定通过16S rRNA基因测序鉴定细菌的亲缘关系，确定其属种级别的分类位置。
五、个人观点和总结苯酚降解细菌的分离、纯化、鉴定是一项具有挑战性的工作，需要从多个角度进行综合分析和判断。
通过本文的探讨，我们不仅仅了解了苯酚降解细菌的基本分离和纯化方法，还深入了解了细菌鉴定和分类的相关技术。
希望通过这些工作，能够为环境污染治理和资源开发提供一些有益的参考和借鉴。
苯酚是一种常见的工业化合物，在工业生产和生活中被广泛使用。
苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究
上海师范大学硕士学位论文苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究姓名：何小丽申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：肖明20090501上海师范大学硕士学位论文摘要论文题目：苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究学校专业：微生物学学位申请人：何小丽指导教师：肖明摘要酚类化合物为细胞原浆毒物，属高毒性物质。
这类物质来源广泛，通常污染水源，毒死鱼虾，危害农作物，并严重威胁人类的健康。
含酚有机物的毒性还在于其只能被少数的微生物分解。
从自然界中筛选分离出能够降解特定污染物的高效菌种，有针对性的投加到已有的污水处理系统中的生物强化技术，能够快速提供大量具有特殊作用的微生物，在有毒有害污染物治理中显示出巨大的潜力。
1、本研究从胜利油田河口采油厂的飞雁滩油田土壤样品中分离得到10株能够利用并降解苯酚的菌株P1-P4、P7、P9-P13。
该10株苯酚降解菌能够在以苯酚为唯一碳源和能源的培养基上生长，经16S rDNA分子鉴定和生理生化检测，该10株降酚菌分别被鉴定到属或种。
其中降酚菌株P1、P3和P4这3株菌株分别属于劳尔氏菌属(Ralstonia)、贪噬菌属（Variovorax）和节杆菌属（Arthrobacter）里的种。
其它7株降酚菌株P2、P7、P9-P13都属于假单胞菌属（Pseudomonas）里的种。
这4个属里的细菌在国内外都已被报道有降解苯酚的特性，其中有关假单胞菌降解环境有机物的报道较多。
2、培养液中的苯酚含量通过4-氨基安替比啉分光光度法测定，通过苯酚降解效率的比较，菌株P2降解苯酚的能力较其它9株菌株要强。
于是将菌株P2作为本研究中进一步研究的对象，研究了不同的环境条件下该菌株降解苯酚和菌体生长的情况。
3、通过苯酚羟化酶特异性引物的设计，从菌株P2扩增出苯酚羟化酶大亚基基因，该基因片段编码对苯酚有催化活性的多肽，催化苯酚代谢的第一步反应；表明菌株P2能降解苯酚是由于细胞具有降解苯酚的遗传基础。
高效苯酚降解菌的分离鉴定
高效苯酚降解菌的分离鉴定作者：关海滨丁瑛张英王玉华王宏伟来源：《科教导刊·电子版》2014年第34期摘要目的：从重度酚类污染的土壤样本中筛选、鉴定高效降酚菌，对该菌株在不同苯酚浓度下进行降酚能力的考查。
方法采用以苯酚为唯一碳源、逐量分批的方法驯化、分离苯酚降解菌株，利用形态学、培养特性、生理生化反应以及设计引物检测16SrDNA序列鉴定菌株。
结果：筛选到一株高效苯酚降解菌，鉴定归属为不动杆菌属，该菌株48h内对苯酚（2.0g·L-1）的降解率为85.93%。
结论：经过实验室驯化及降酚条件优化，所得菌株具有良好的降解苯酚性能。
关键词苯酚降解菌驯化分子鉴定中图分类号：X172 文献标识码：A当今社会工业化程度的提高使许多工厂大量排放含酚废水及污染物。
酚类化合物属芳香族化合物，对人体有毒害作用，比如对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可引起肝或肾损害，还可引起不同程度的头痛、咳嗽、恶心、呕吐等等。
治理含酚废水最有效的方法是控制污染源，首先是加强企业的管理，使其自觉的对含酚废水采取有效处理、回收以及综合利用；其次是合理选择工艺流程、开发无公害工艺、无公害催化剂、使用无公害试剂的反应实现清洁工艺技术；第三是寻找高效率、合适的降低废水中的含酚浓度的方法。
生物法治理含酚废水较其它方法比有能耗少、处理效率高、二次污染少等优点。
近些年来对于直接用于高浓度含酚废水的降酚菌研究有限，本研究旨在驯化、分离、筛选出能够适用于工业上降解高浓度含酚废水的菌种。
1 材料与方法1.1 培养基（1）唯一碳源培养基：苯酚终浓度分别为0.5g·L-1至2.0g·L-1。
（2）富集培养基蛋白胨10. 0g·L-1，牛肉浸膏5. 0 g·L-1，NaCl 5. 0 g·L-1，pH7. 0。
（3）富集（分离）固体培养基：苯酚浓度若干、琼脂浓度为15.0 g·L-1。
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目录目录 (1)摘要 (2)Abstract (3)第一章绪论 (4)1.1 苯酚降解菌的定义及分类 (4)1.2苯酚降解菌的性质及其用途 (4)1.3苯酚降解的研究现状 (5)1.4苯酚降解菌生产菌的筛选 (6)1.5本课题的研究思路及意义 (6)第二章材料与方法 (7)2.1试验材料 (7)2.2试验方法 (8)2.2.2苯酚降解菌的驯化 (8)2.2.3菌种在不同条件下的降解能力 (9)2.2.4最优菌种的鉴定 (9)3.1苯酚降解菌筛选结果及性状初步研究 (11)3.11筛选结果 (11)3.1.1.1初步筛选的结果 (11)3.1.1.2 菌种驯化中的结果 (11)3.1.2 H-1菌株的性状初步结果 (13)3.2 H-1菌株分类鉴定结果 (13)第四章结论 (14)4.1菌种的筛选结果 (14)4.2菌种的鉴定 (14)参考文献 (15)致谢.......................................................................................... 错误!未定义书签。
一株苯酚降解菌的分离和鉴定摘要为了寻找能高效降解苯酚的微生物, 从土壤中筛选得到了一株苯酚降解菌,通过逐渐增加苯酚的浓度,然后驯化出一株高效降解苯酚的细菌H-1. 当在30 ℃培养48h 时其降解率高达92.11%. 经理化特征测定及外观鉴定,将其初步鉴定为假单胞菌属.再经过对比实验测各种因素(碳源、温度、pH、通气) 对该菌生长及降解苯酚能力的影响,得知该菌能以苯酚作为唯一碳源,最适生长温度为32 ℃,最适pH 为7.0. 该菌为好氧菌,在空气充足的条件下可提高降解能力.该菌菌落较小，菌落呈微黄色。
菌体呈直或微弯的杆装，没有菌柄也没有鞘。
不产芽孢。
对该菌做生化鉴定，可知该菌革兰氏染色为阴性，可水解苯酚，生长温度为32℃，生长pH为pH 6.5～7.5。
参照东秀珠,蔡妙英的《常见细菌系统鉴定手册》等文献方法，以形态和培养特征为主，生理生化特性及生态特性为辅，经初步鉴定为假单胞菌属，命名为H-1，具体确定到种则需要进一步的研究。
【关键词】：筛选苯酚降解鉴定Isolation and Identification of a Phenol-degradingBacteriaAbstractIn order to find efficient microbial degradation of phenol, screened from the soil has been a phenol-degrading bacteria, through a gradual increase in the concentration of phenol, and then domesticated from a phenol-degrading bacteria in H-1. When at 30 ℃48h culture, when the maximum degradation of rate was as high as 92.11%. Manager of the characteristics of measurement and the appearance of identification, be identified as Pseudomonas. After comparing the experimental test a variety of factors (carbon source, temperature, pH, ventilation) on the bacteria growth and phenol degradation ability, that the bacteria to phenol as the sole carbon source, the optimal growth temperature of 32 ℃, the optimum pH was 7.0. bacteria for aerobic bacteria in t air under the conditions of sufficient capacity to enhance the degradation.Bacteria colony small micro-colonies were yellow. Cell was under the direct or Micro bend installed, there is no there is no sheath stripe. Did not produce spores. To do biochemical identification of bacteria, bacteria known as Gram stain negative, can be hydrolyzed phenol, the growth temperature of 32 ℃, the growth of pH for the pH 6.5 ~ 7.5.Reference to "bacteria Berger Identification Manual (Eighth Edition)" and other literature methods, in order to shape and cultivate the characteristics of the main physiological and biochemical characteristics and ecological characteristics of supplement, preliminary identified as Pseudomonas, named for the H-1 specific to the species to determine the need for further research.【Key words】: Screening identify degradation phenol第一章绪论1.1 苯酚降解菌的定义及分类苯酚降解菌(Phenol-degrading bacteria)是能够降解苯酚成为其他物质的菌的总称，它广泛存在于土壤，水体中。
苯酚俗名石炭酸，分子式C6H5OH，比重1.071，熔点42～43℃，沸点182℃，燃点79℃。
无色结晶或结晶熔块，具有特殊气味（与浆糊的味道相似）。
置露空气中或日光下被氧化逐渐变成粉红色至红色，在潮湿空气中，吸湿后，由结晶变成液体。
酸性极弱（弱于H２CO３），有特臭，有毒，有强腐蚀性。
室温微溶于水，能溶于苯及碱性溶液，易溶于乙醇、乙醚、氯仿、甘油等有机溶剂中，难溶于石油醚。
常用于测定硝酸盐、亚硝酸盐及作有机合成原料等．实验室可用溴（生成白色沉淀2,4,6－三溴苯酚，十分灵敏）及FeCl3（生成［Fe(C6H5O)6]3-络离子呈紫色）检验．[11]苯酚主要用于生产酚醛树脂、己内酰胺、双酚A、己二酸、苯胺、烷基酚、水杨酸等，此外还可用作溶剂、试剂和消毒剂等，在合成纤维、合成橡胶、塑料、医药、农药、香料、染料以及涂料等方面具有广泛的应用。
苯酚的毒理低浓度酚能使蛋白变性,高浓度能使蛋白沉淀。
对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用,也可抑制中枢神经系统或损害肝、肾功。
水溶液比纯酚易经皮肤吸收,而乳剂更易吸收。
吸入的酚大部分滞留在肺内,停止接触很快排出体外。
吸收的酚大部分以原形或与硫酸、葡萄糖醛酸或其他酸结合随尿排出,一部分经氧化变为邻苯二酚和对苯二酚随尿排出,使尿呈棕黑色(酚尿)。
[11]人口服致死量报道不一,LD为2～15g,或MLD为140mg/kg,14g/kg。
国外报道酚液污染皮肤面积为25%,10分钟死亡,血酚为0.74mmol/L。
苯酚是重要的化工原料,被广泛应用于酚醛树脂、杀虫剂、染料、农药和医药的生产中. 但苯酚本身是有毒的有机化合物,具有使蛋白质变性的作用,对皮肤粘膜有腐蚀性;此外,它还可以作用于中枢神经而引起痉挛. 美国环保局和我国相继把苯酚列入有毒污染物名单.处理含酚废水的方法很多,其中生物降解法是一种经济有效且无二次污染的方法,许多学者在这方面进行了大量研究.[11]1.2苯酚降解菌的性质及其用途苯酚降解菌一般多为不动杆菌、假单胞菌、好氧产碱菌等。
有的可以以苯酚为单一碳源，有的是混合碳源。
目前,治理含酚废水的途径主要有化学试剂法(如萃取、吸附、离子交换、化学沉淀、化学氧化、反渗透、生化处理等) 和生物降解两种。
国内外许多学者在生物降解苯酚方面进行了广泛的研究,已鉴定存在苯酚降解能力的微生物有乙酸钙不动杆菌( Acinetobactercal coaceticus) 、假单胞菌( Pseudomonas sp. ) 、富养产碱菌( Alcaligenes eutrophus) 等。
苯酚降解菌可用于，降解广泛存在于化工、造纸、钢铁等工业废水中。
含酚的污水，防止由于酚污染而导致的江河湖泊中的鱼虾的死亡,含酚的污水会使庄稼死亡或减产,严重危害人类的健康。
[10]1.3苯酚降解的研究现状苯酚降解技术主要有:1、催化湿式氧化技术：催化湿式氧化技术是80年代国际上发展起来的一种治理高浓度有机废水的新技术，是在一定温度、压力下，在催化剂作用下，经空气氧化使污水中的苯酚氧化分解成CO2、H2O等无害物质，达到净化目的。
其特点是净化效率高，流程简单，占地面积少。
2、生物强化技术生物强化技术是指在生物处理体系中投加具有特定功能的微生物来改善原有处理体系的处理效果。
投加的微生物可以来源于原有的处理体系，经过驯化、富集、筛选、培养达到一定数量后投加，也可以是原来不存在的外源微生物。
实际应用中这两种方法都有采用，主要取决于原有处理体系中的微生物组成及所处的环境。
这一技术可以充分发挥微生物的潜力，改善难降解有机物生物处理效果。
Selvaratnam等通过在活性污泥中投加苯酚降解菌Psendomonas Pvotida ATCC11172，提高了苯酚的去除率，系统在40d内一直保持在95％－100％的苯酚去除率，而没有进行生物强化的对照组中苯酚去除率开始很高，但很快降到40％左右。
3、芬顿试剂技术芬顿试剂对有机分子的破坏是非常有效的，其实质是二价铁离子和过氧化氢之间的链反应催化生成·OH自由基，三价铁离子催化剂（称芬顿类试剂）也能激发这个反应，这两个反应生成的·OH自由基能有效地氧化各种有毒的和难处理的有机化合物如苯酚；或者采用紫外灯作为辐射能源放射紫外线进入废水，当过氧化氢被紫外光激活后，反应产物是一个高反应性的·OH自由基，这个·OH基团迅速引发氧化链反应，最终有机化合物被分解为CO2和H2O。