实验四动物免疫与佐剂制备
兽用疫苗保护剂和佐剂
兽医生物制品常用的保护剂
1．5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂
蔗糖（或乳糖） 5g，加脱脂乳至 100ml，充分溶解后，110~116℃高压灭菌 30~40 min。
2．明胶蔗糖保护剂
明胶 2%~3%（g/m1）、蔗糖5%（g/m1）、硫脲 1%~2%（g/m1）。先 将 12%~18%明胶液、 30%蔗糖液和 6%~12%硫脲液加热溶解， 116℃高压 灭菌30~40min；
1. 营养液： • 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；
• 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，
增加溶解度 2. 赋形剂： • 防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响 • 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度 3. 抗氧化剂： • 抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存
7．脂质分子类佐剂：脂多糖、Vit A和Vit E等脂溶性维生素
8．其他：霍乱毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破伤风类 毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；维生素B12等。
氢氧化铝胶 (铝胶）
合成方法:
（1）用铝粉加烧碱合成法
2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3· 18H2O
兽用疫苗冻干保护剂 和佐剂
冻干保护剂（稳定剂）
保护剂：又称稳定剂（stabilizer） ，是指一类能防止生 物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫 苗生产、血清制备等） 保护剂用途（不同用途加不同保护剂, 主要针对活的微生 物或细胞） ① 菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂 ② 细胞株保存：常用二甲基亚砜(DMSO) DMSO:二甲基亚砜，一种细胞的保护剂 ③ 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚 砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方） ④ 干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖
兽用疫苗保护剂与佐剂(57页)
• 50＜：运动粘度71112 / 3左右 *紫外吸收八25()-35()＜(). 1 %，紫外消光系数＜12X108； •单环芳烃 与双环芳烃含量低干0.5%，无多环芳烃； •小鼠腹腔注射0+51111或家免皮下注射2.01111^油，观察60山 表现正
常。
乳剂配方与乳化方法
(1) 剂在水屮法： 将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生 成0州乳剂。若欲
得从/0型，可继续加入油，直到发生变型。该 法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅
拌而得到较好的乳ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。
(2) 剂在油屮法：
将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相屮得如水相 直接加入油相，得到〜
/0型，如欲得0/〜，继续加入至变型。该 法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在 0.5^0!左右，比较稳定。
蔗糖76.626、磷酸二氢钾0.528,磷酸氢二钾1.648、谷氨酸钠0.»相、牛血 淸白蛋 白10心 加去离子水至1000111],混合溶解，过滤除菌、
免度佐剎
一、佐剂概念与作用机理
1.佐剂（新概念）：凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物 质称为佐剂。
佐剂（旧概念）：当一种物质先于抗原或与抗原混合或同 时注射于动物 体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗 原的特异性免疫应答，发挥 其辅佐作用的物质.
施汽吹沸熟化10111«»调节卩14 6.9土
6万皁升沸水屮，搅拌均 匀;倒入
0.1，继续熟化3111111»稳定卩?1
硫酸100kg,爆沸至棕 褐色，经30
6.9 十 0+1
〜后，加温 水，边加边搅拌约垔
总踅为 357；升：用前加水稀杼
至 100万品扑，温度约为80°0, 盛
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理抗体是一种能够识别和结合特定抗原的蛋白质，广泛应用于医学诊断、治疗和研究领域。
抗体的制备方法包括动物免疫和体外选择性放大两种主要途径。
以下将详细介绍这两种方法及其原理。
一、动物免疫法制备抗体动物免疫法是制备多种特异性抗体的主要方法，常用的动物包括小鼠、兔子、大鼠等。
制备抗体的主要步骤如下：1.抗原选择：首先需要选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、糖蛋白、核酸等。
抗原应具有免疫原性，能在动物体内引起免疫反应。
2.免疫原免疫：将抗原与适当的佐剂混合后注射到动物体内，佐剂可以增强抗原的免疫原性，如完全弗氏佐剂、佐科克佐剂等。
注射的剂量和时间间隔需根据具体实验目的和动物种类进行优化。
3.收集血清和分离抗体：免疫一定时间后，收集动物的全血或血清，离心分离血清，其中包含了目标抗体。
4.抗体纯化：通常使用亲和层析、凝胶过滤层析等方法将血清或血浆中的抗体纯化出来。
亲和层析是最常用的抗体纯化方法，利用特定配体或抗原结合柱将目标抗体捕获，再洗脱得到纯抗体。
二、体外选择性放大法制备抗体体外选择性放大法是指通过技术手段进行人工放大和筛选特定抗体，主要包括以下步骤：1.生成抗体文库：将来自多个个体免疫系统的B细胞或血浆细胞收集起来，提取RNA或DNA，然后利用逆转录酶合成cDNA或文库，得到抗体基因的cDNA文库。
2.构建抗体显示系统：将抗体基因文库插入适当的表达载体中，如噬菌体、酵母、哺乳动物细胞表达系统等。
3.筛选特异性抗体：利用高通量筛选技术，如细胞表面展示、比对深度测序等，可通过抗原结合的特异性来筛选出具有高亲和力的抗原结合片段或全长抗体。
4.抗体表达和纯化：通过选择后的抗体基因进行表达，再经过蛋白纯化和检验等步骤，最终得到目标抗体。
抗体制备的原理主要是基于免疫系统的免疫应答机制。
当机体受到抗原的刺激后，机体会产生一系列免疫应答，其中包括B细胞的活化和分化。
经过抗原的结合和识别，B细胞会分泌具有高亲和力的抗体。
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
免疫血清的制备实验报告
免疫血清的制备实验报告
《免疫血清的制备实验报告》
实验目的：
本实验旨在通过免疫反应制备免疫血清，以便用于后续的免疫学研究和临床诊断。
实验材料和方法：
1. 实验动物：选择适合的实验动物，如小鼠或兔子，进行免疫原注射。
2. 免疫原制备：根据研究需要选择合适的抗原，并进行纯化和浓缩处理。
3. 免疫程序：将免疫原与适宜的佐剂混合，然后注射到实验动物体内，以激发免疫反应。
4. 血清采集：在免疫原注射后，定期采集实验动物的血清样本，以监测抗体水平。
5. 血清制备：通过离心和沉淀的方法，从血清中分离出免疫球蛋白，得到免疫血清。
实验结果：
经过一系列的免疫程序和血清采集，成功制备得到了免疫血清。
通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹（Western blot）等方法，验证了免疫血清中存在特定的抗体，具有对应的特异性和亲和力。
实验结论：
本实验成功制备了具有特定抗体的免疫血清，为后续的免疫学研究和临床诊断提供了重要的实验材料。
免疫血清的制备过程复杂而精细，需要严格控制各个环节，以确保免疫血清的质量和稳定性。
实验意义：
免疫血清作为一种重要的实验试剂，在免疫学研究和临床诊断中具有广泛的应
用前景。
通过本实验的制备过程，可以更好地理解免疫反应的机制，为疾病的
诊断和治疗提供重要的实验依据。
同时，免疫血清的制备也为相关领域的科研
人员提供了一种重要的实验技术和方法，有助于推动免疫学研究的进展和应用。
动物免疫技术实验报告
动物免疫技术实验报告实验目的：本实验旨在通过动物免疫技术，研究动物体内对特定抗原的免疫应答机制，以及免疫后产生的抗体特性，为进一步的免疫学研究和疫苗开发提供理论基础和实验数据。
实验材料：1. 实验动物：健康成年小鼠，体重20-25g。
2. 抗原：纯化的蛋白质抗原。
3. 佐剂：弗氏佐剂。
4. 免疫试剂：PBS缓冲液、EPPENDORF移液枪、离心管等。
5. 检测试剂：ELISA试剂盒。
实验方法：1. 抗原制备：将蛋白质抗原与弗氏佐剂混合，制备成免疫原。
2. 免疫程序：将小鼠随机分为实验组和对照组。
实验组小鼠在第0天和第14天分别进行皮下注射免疫原，对照组小鼠注射等量的PBS缓冲液。
3. 采血：免疫后第28天，对小鼠进行心脏采血，分离血清。
4. 抗体检测：采用ELISA方法检测血清中特异性抗体的浓度和活性。
实验结果：1. 免疫后小鼠血清中特异性抗体水平显著升高，与对照组相比有显著性差异（P<0.05）。
2. 抗体的亲和力和特异性通过ELISA实验得到了验证，显示出良好的免疫效果。
3. 实验组小鼠在免疫过程中未出现明显的不良反应，说明免疫原的安全性良好。
实验讨论：本实验通过动物免疫技术成功诱导了小鼠产生特异性抗体，为研究免疫应答机制提供了实验依据。
实验中使用的弗氏佐剂作为一种有效的免疫增强剂，显著提高了免疫效果。
此外，通过ELISA方法对抗体的检测，进一步证实了免疫原的有效性和特异性。
结论：动物免疫技术是一种有效的研究免疫应答的方法，本实验成功地诱导了小鼠产生特异性抗体，为免疫学研究和疫苗开发提供了有价值的数据。
未来的研究可以进一步探索不同抗原和佐剂的组合，以及免疫程序的优化，以提高免疫效果和疫苗的保护力。
参考文献：[1] 张三, 李四. 免疫学基础与技术[M]. 北京：科学出版社，2015.[2] 王五, 赵六. 动物免疫技术在疫苗研究中的应用[J]. 中国免疫学杂志，2018, 34(2): 123-128.实验日期：2024年4月21日实验人员：XXX指导老师：XXX[注：以上内容为示例文本，实验数据和参考文献需根据实际实验情况进行调整。
兽医生物制品处理技术—佐剂配制技术
一、实验目的： 掌握白油佐剂的制备方法 二、实验器材： 1.共用：10号白油、Span-80、硬脂酸铝、天平、称量纸等。 2.每组所需：1个电炉（最好有石棉网）、2个玻璃烧杯、1个 玻璃捧、1个100ml量筒、1个10ml量筒等。
白油佐剂制备
三、实验方法： 1.按10号白油94ml，硬脂酸铝2g，Span-80 6ml的比例混合。 2.将白油和Span-80在电炉上微加热混合至透明。 3.然后取少量混合液加入硬脂酸铝，加热使其完全熔化。 4.再放入全量混合液中，充分混合。 5.高压蒸汽灭菌，110℃加热30min，冷却至50℃左右，再用力 振摇至透明均质状，即为白油佐剂（油相）。
➢ 例：破伤风明矾沉降类毒素 气肿疽明矾菌苗
钾明矾
常用的兽医免疫佐剂
➢ 明矾佐剂苗制备方法 取精制钾明矾配成10%溶液，高压灭菌后冷却至25℃以下， 按1%-2%加入pH8.0±0.2的灭活菌液中，充分振摇即为明矾 佐剂苗。
常用的兽医免疫佐剂
3.弗氏佐剂 ➢ 由匈牙利细菌学家Freund(1935年)
白油佐剂制备
四、注意事项： 油相制备时，温度和时间要掌握好，要使Span-80和硬脂酸 铝充分溶解。
常用的兽医免疫佐剂
1.氢氧化铝胶佐剂 2.明矾佐剂 3.弗氏佐剂 4.油乳佐剂 5.蜂胶佐.氢氧化铝胶佐剂
氢氧化铝胶又称铝胶，其佐剂活 性与质量密切相关。质优的铝胶 分子细腻，胶体状态良好、稳定 ，吸附力强，含Al（OH）3约2% （AlO3为1.3%），保存2年以上 吸附力不变。
树脂，并混入蜜蜂上颚分泌物，以及蜂蜡、花粉及其他一 些有机与无机物的一种天然物质。 蜂胶是一种蜂产品,含有多种氨基酸、酶、多糖、脂肪酸 、维生素及化学元素，是一种优良的天然药物。
佐剂及灭活疫苗的制作
氢氧化钠合成法。其中，用铝粉加烧碱合成法最为常用，其基本原理为：
2Al(OH)3 十 12H2O 十 3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O。 Al2(SO4)3·18H2O 十 6NaOH→2Al(OH)3 十 2Na2SO4 十 18H2O。 用三氯化铝与氢氧化钠合成，此法合成的铝胶含量低，透明无沉淀，目前广泛用于制备人用生物
二、实验内容
1、配制白油佐剂； 2、配制氢氧化铝胶佐剂； 3、配制蜂胶佐剂。
三、实验原理
油佐剂、氢氧化铝胶和蜂胶常用于兽用灭活疫苗。佐剂活性与质量密切相关，优质佐剂应具备分子
细腻、胶体性良好、稳定和吸附力强等特点。 （一）油佐剂由矿物油和乳化剂组成。矿物油应不含多环芳烃化合物、粘度低、无色、无味和无毒性。
六、注意事项
1、灭活要彻底，以免影响疫苗的安全性。 2、水相制备时，使抗原与 Tween-80 充分混匀。 3、乳化时，注意将油相冷却后再乳化，以防油温过高使抗原性降低。 4、注意先加入油相后再加入水相，充分搅拌。
七、实验结果记录
八、实验总结
——本资料由王印整理，难免错误——
6
《动物生物制品学》实验课程
实验三、兔病毒性出血症组织灭活疫苗的制备
专业：
姓名：
学号：
成绩：
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一、实验目的
1、了解并掌握兔病毒性出血症组织灭活疫苗的制备程序。
二、实验内容
1、兔病毒性出血症病毒增殖和组织灭活疫苗的制备。
三、实验原理
兔病毒性出血症病毒可引起兔严重疾病，病毒培养困难，现仍然没有发现适应病毒体外培养的细胞
六、注意事项
1、硫酸有很强的腐蚀性，应放在耐酸搪瓷缸配置，操作要十分小心，防止爆沸时溅出，造成伤害。 2、氢氧化铝具有较强的吸附力，所以制胶过程中一般用软化水或去离子水洗涤。 3、氢氧化铝胶为两性化合物，过酸或过碱都会失去胶态，故要掌握好化合时的 pH。 4、油相制备时，温度和时间要掌握好，要使 Span-80 和硬脂酸铝充分溶解。
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上海师范大学
实验报告
专业、年级生物科学班级姓名学号
课程名称免疫学实验名称动物免疫与佐剂制备实验日期2011年10月4日
一、实验原理
以抗原免疫动物，机体会产生免疫应答，经多次增强免疫后，动物体内出现明显的应答证据和产物。
在形态方面，免疫注射部位的引流淋巴结可因免疫应答反应而明显肿大。
在解剖动物淋巴结切片中，可观察到初级淋巴结滤泡转化成次级淋巴滤泡，有生发中心形成。
若将淋巴结内细胞涂成涂片，染色后可观察到淋巴母细胞的存在。
在机能方面，可以发现细胞因子水平的变化，并检验出高浓度和高效价的特异性抗体。
免疫应答在有佐剂参与的情况下可大幅度增强。
目前常用的佐剂为福氏佐剂。
一般常用的免疫注射途径有皮内、皮下、腹腔与静脉4种方法。
二、实验用品
（一）器材
1、研钵，显微镜，高压灭菌锅。
2、小烧杯，平皿，卡介苗注射器，载玻片。
3、动物解剖板，眼科镊子，眼科剪刀。
（二）试剂
福氏完全佐剂、人免疫球蛋白、瑞氏染液、含福氏完全佐剂的抗原（1mg/mL）
（三）材料
未免疫的小白鼠
三、实验程序
（一）操作方法
1、免疫动物：取小白鼠固定，将含福氏完全佐剂的抗原（1mg/mL）吸入卡介苗注射器，
鼠背部右下侧注射40~50微升。
2、免疫后动物引流淋巴结观察：
（1）淋巴结标本的采集，取免疫1周后的小白鼠处死，固定在动物解剖板上。
从腹正中剪开小白鼠皮肤，固定于两侧，寻找肿大的腹股沟淋巴结，取出置平皿中。
将髂窝处皮肤剪开，在髂窝软组织中寻找肿大的淋巴结，取出置平皿中，带开腹腔将内脏推向上方，在腹主动脉两侧寻找腹腔淋巴结，取出置平皿中。
（2）可做一组对照，及未免疫小白鼠的淋巴结标本。
（3）淋巴结大小、形态的观察：将淋巴结剪成两半，用小镊子在干净载玻片上作涂片。
待涂片干燥后，用瑞氏染液染色后在显微镜下观察，未免疫的标本做对照。
（二）注意事项
1、免疫小鼠时应注意回抽注射器，以确保未将免疫原注入血管。
2、取出腹主动脉两侧淋巴结时，应注意避免损伤血管，影响手术视野。
实验结果和讨论。