酒精酵母扩培工艺
酿酒酵母的活化及扩大培养条件的探究
二、实验内容 （一）酵母活化、培养及生长量的测定
安琪干酵母的活化按使用说明，活化用量为0．1％，活化后。将3 mL活化后 的酵母接人盛有100 ml的液体培养基的250 mL三角瓶中，置于30℃，160 r／min 血的摇床中培养24 h，每2 h取样一次，以液体培养基为参照．于620nm处测吸光
为24~28h。
（二）温度对果酒酵母生长的影响
在不同的温度条件，对酵母生长的实验，结果如 下表：
温度（℃） 吸光度
表2 温度对酵母生长的影响
26
28
30
32
1.745 1.853 1.934
1.814
34 1.534
吸光度
2.5 2
1.5 1
0.5 0 26℃
28℃
30℃ 温度
32℃
图 2 温度对酵母生长的影响
毕业设计
酿酒酵母的活化及扩大培养条件的探究
——食生系绿检XXXX班
指导老师：XXX教授/博士 学生：XXX 学号：XX
一、实验材料与设备
（一）实验材料
干酵母：市售安琪牌果酒酵母。所用试剂均等为分析纯。
（二）培养基
基础培养基：蛋白胨10 g，KH2P04 3 g，MgS04·7H2O 5g。水1000 mL，121℃灭菌20 min。
致谢！
谢谢大家观看！
转速/r/min
图4 摇床转速对酵母生长的影响
由表4和图4得知：在160—200r/min范围内，酵母液 的吸光度基本保持不变，所以酵母的最适转速为160 r/min。
四、 结论
由实验结果知，枣醋中酵母的活化及扩大培养过 程中，酵母生长迅速的最适条件为：生长时间在 24~28h内，温度控制在30℃左右，PH值为5，摇床 转速为160 r/min。
酵母扩培的实验室阶段
酵母扩培的实验室阶段收稿日期：２００8－07－01马林靖（华润雪花啤酒（秦皇岛）有限公司，河北秦皇岛０６６００１）摘要：啤酒酵母的纯种培养在啤酒生产中非常重要，酵母扩培实验室阶段的技术要点：①扩培人员要有强烈的责任感和扎实的工作经验，严格保证扩培过程无菌；②采用普通斜面、４℃冰封保藏菌种；③选择优良的培养基；④保证扩培过程中的充氧量；⑤转接过程中选择适当的温度及合理的扩大比例。
（陶然）关键词：啤酒；酵母扩培；实验室阶段；技术要求；注意事项中图分类号：ＴＳ２６２．５；ＴＳ２６１．１文献标识码：Ｂ文章编号：１００１－９２８６（２００８）１０－００７５－０２Lab Stage of Expanding Culture of Beer YeastＭＡＬｉｎ－ｊｉｎｇ（ＨｕａｒｕｎＳｎｏｗＢｒｅｗｅｒｙＣｏ．Ｌｔｄ．，Ｑｉｎｈｕａｎｇｄａｏ，Ｈｅｂｅｉ０６６００１，Ｃｈｉｎａ）Abstract ：Ｔｈｅｐｕｒｅｓｐｅｃｉｅｓｃｕｌｔｕｒｅｏｆｂｅｅｒｙｅａｓｔｉｓｏｆｖｉｔａｌｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｉｎｂｅｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｔｅｃｈｎｉｃａｌｐｏｉｎｔｓｏｆｅｘｐａｎｄｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅｏｆｂｅｅｒｙｅａｓｔｉｎｌａｂｓｔａｇｅｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：１．ｔｅｃｈｎｉｃｉａｎｓｍｕｓｔｈａｖｅｓｔｒｏｎｇｓｅｎｓｅｏｆｒｅｓｐｏｎｓｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｓｏｌｉｄｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆｗｏｒｋｉｎｇｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ，ａｎｄａｓｅｐｔｉｃｃｕｌ－ｔｕｒｅｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｉｎｅｘｐａｎｄｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅ；２．ｃｏｍｍｏｎｉｎｃｌｉｎｅｄｐｌａｎｅｉｓａｄｏｐｔｅｄ，ａｎｄｉｃｅ－ｓｅａｌｅｄｓｔｏｒａｇｅｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｐｅｃｉｅｓａｔ４℃ｒｅｑｕｉｒｅｄ；３．ｓｅｌｅｃ－ｔｉｏｎｏｆｑｕａｌｉｔｙｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ；４．ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙｓｈｏｕｌｄｂｅｇｕａｒａｎｔｅｅｄｉｎｅｘｐａｎｄｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅｐｒｏｃｅｓｓ；５．ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｒａｔｉｏ－ｎａｌｅｘｐａｎｄｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓｅｌｅｃｔｅｄｄｕｒｉｎｇｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ．（Ｔｒａｎ．ｂｙＹＵＥＹａｎｇ）Key words ：ｂｅｅｒ；ｅｘｐａｎｄｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅｏｆｂｅｅｒｙｅａｓｔ；ｌａｂｓｔａｇｅ；ｔｅｃｈｎｉｃａｌｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ；ｎｏｔｉｃｅａｂｌｅｐｏｉｎｔｓ啤酒发酵是一种非常复杂的生物化学变化过程，而啤酒酵母决定着啤酒的风格、特色以及啤酒产品的质量，啤酒酵母的纯种培养以及活力和活性的保持是啤酒发酵工艺的灵魂。
酒精技术31酒母
能发酵麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、1/3棉子糖， 不发酵乳糖、菊糖、蜜二糖。
耐酒精分数13％以下。
〔5〕南阳混合酵母(1308)
菌落白色，外表光滑、质地湿润、边缘整齐； 培养一周后，色稍暗；细胞呈圆形 (6.6×6.6um)，少数卵圆形。
能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、1/3棉子糖， 不发酵乳糖、菊糖、蜜二糖。
大酒母罐
大酒母罐中糖分消耗45-50%，液面冒出大量 CO2时，培养即成熟，即可送往发酵车间，做发 酵接种用。
② 半连续培养法
半连续培养法也叫循环培养法。它是将卡氏 罐酒母接入小酒母罐，培养成熟后，分割 出三分之二接入大酒母罐进展培养，余下 的三分之一再补加新鲜酒母糖化醪连续培 养，培养成熟后再分割，如此反复以上操 作。大酒母培养成熟那么可全部送发酵车
度〕/醪液原始糖度×100％ 耗糖率一般要求控制在40-50％。
(5) 酒精分：3-4％(容量) ； (6)酸度：不增高。
3.5.6 影响酒母质量主要因素
1、接种量与成熟酒母细胞数的关系 酵母细胞总数与培养基有关，与接种量无
直接关系。 一般以10%为宜。
2．接种量与培养时间的关系
接种量增加，培养时间缩短。 常规接种量在10%左右时，酒母培养时间在10h
殖有害的物质。
② 酒母糖化醪的制作 A、原料蒸煮：原料加水比为 原料︰水＝1 ︰ 4-5，
糖化后的醪液浓度在12-14Bx。 B、酒母蒸煮醪的糖化 加曲量 ：300单位〔液体曲〕／克原料，固体曲为原
料的10％左右。 糖化时间：3-4h。 糖化温度可根据曲霉菌的特性来决定，在使用黑曲那
么可控制在60-65℃。
根据实践，该菌在含单宁原料中酒精发酵能 力比拉斯12号速度快、变形少，产酒精能
酒母的扩大培养
酒精是怎样炼成的酒母的扩大培养干酵母在上期的复水活化中恢复成了常态活性酵母后，随即流入酒母罐的糖化醪可为酵母及时地提供足够的营养物质，酵母开始消耗醪液产生能量合成自身物质，恢复正常的新陈代谢，进入酒母的扩大培养阶段。
33℃左右的糖化醪打入38℃的无菌水后获得稀释，使得刚开始还体弱的酒母不会因为培养基太浓，渗透压过高而难以吸收利用营养物导致死亡。
因此，当罐体体积很大，干酵母投入量少而且无菌水量少时应将糖化醪分批打入酒母罐使酒母逐步扩大培养，这样有利于酒母生长形成种群优势，减少杂菌的生长。
农民在种菜种稻谷的时候为了使种子尽快发芽，播种后会铺上一层稻草来提高播种温度，而后当种子发芽出苗时又将其稻草去掉防止温度过高使秧苗死亡。
一样地，高温活化后的酒母也并不适合在很高的温度中进行下一步的生长，而混合后的酒母培养液如果不冷却那么它仍然会有35~37℃的温度，要是一直维持这样的温度酒母只会因为温度过高而导致细胞老化死亡。
所以在打入糖化醪的同时可打开罐内蛇管的冷却水进行换热降温，使罐温维持在33℃左右来满足酵母生长繁殖所需的温度。
当树苗种在肥沃的土壤里却没有足够的阳光时它仍然没有强大的能量和动力来促进成长，而酒母缺氧就像树苗缺少阳光一样也会因此生长不良，难以繁殖。
所以酒母培养除了要提供良好培养基、维持33℃罐温并保证不染菌状况发生外还要不断地往罐中少量通入无菌压缩空气来补充氧，在这种良好条件下酒母通过出芽生殖方式不断繁殖，10~12小时后酒母数将达到一个很大的数目，每毫升培养液中大约有1~1.2亿个细胞左右，酒母罐中产有大量的气泡，酵母的出芽率也在15~20%，几乎没有死亡细胞，而糖化醪的糖度明显下降，但pH值没有太大的变动，挥发酸低，这时说明酒母生长最旺盛，染菌少，已达到成熟酒母的标准，即可作为酒精发酵的菌种。
此时便完成了酒母的扩大培养，等待送入发酵罐。
附实验一-酵母扩培实验
（2）培养用的培养基，应使用现场加酒花的 麦汁，加热煮沸并加蛋白澄清，利用蒸汽间 歇灭菌后，在25℃保温箱中贮存2～3天，证 明无污染后，方可使用；
（3）每次扩大稀释倍数约10倍以下；
实验室扩大培养的技术要求
（4）每次移植接种后，要镜检酵母细胞的 发育情况；
（5）随着每阶段的扩大培养，培养温度逐 步降低，以适应现场发酵情况；
实验一、酵母扩培实验 啤酒纯种酵母的分离培养方法 1 . 平板分离培养法(稀释分离法)
平板分离培养法
2.划线分离培养法
1,2,3,4—分别表示第1,2,3,4次划线区
3. 林德奈氏单细胞分离培养法
林德奈氏小滴培养法
啤酒酵母的实验室扩培
◇酵母扩培过程
斜面试管（原菌种）→ 富氏瓶或试管培养 → 巴氏 瓶或三角瓶培养 → 卡氏罐培养 → 汉生罐培养 → 酵母扩大培养罐 → 酵母繁殖罐 → 发酵罐
◇扩培工序分段
以上从斜面试管到卡氏罐培养为实验室扩大培养阶 段；汉生罐以后为生产现场扩大培养阶段
◇工序分段原因
麦汁量大时，送输很困难，不能再在实验室进行酵 母扩培。因此，需要在车间的酵母扩培设备中继续 进行扩大培养。 运输设备——卡氏罐
扩培容器容积与接种麦汁量
容器代号 (mL)
1
2
3
(mL) (mL) (mL)
容器体积
10 100
1000
无菌麦汁量
5
50
500
接种量
-
5
55
总量
5
55
555
注意事项 酵母繁殖分几次进行，把处于高泡阶段的培
养液倒入大约10倍的容器中。为保证酵母良好快速的生长 繁殖，一般扩培倍数不超过10倍。
第4章酒母扩培工艺
酒母通风培养，对繁殖酵母极为有利，经过试验证实在有氧条件 下，生产1 g干酵母，只消耗糖分0.35-0.43 g；而在不通气情况下，要耗 糖1.14 g。可见供气培养可以繁殖大量酵母，并且耗糖很少。
2.4.4．培养温度与pH值
酒母培养温度一般为28℃左右，温度高酵母生长繁殖快。
2020/11/26
第4章酒母扩培工艺
•100 0
•800 • 600 • 400
•8 12 16 20
•种龄/h
• 接种量对碱性蛋 白酶产生的影响
2020/11/26
•种龄与碱性蛋白 酶活力之间的关系
•140 0
•120 0
• 1000
•
800
•1
3
6
7
9
•接 种 量
第4章/%酒母扩培工艺
•2.4 影响酒母质量的主要因素
v 2.4.1．酒母的种龄
酒精生产过程中所用的酒母，应选用对数生长期的酒母作为种子。
v 2.4.2．接种量控制
工厂酒母接种量通常为 8%-10%，经过 10-18 h培养，酵母数达0.61亿个／mL以上。
酒精产量大的工厂，一般采用分割培养酒母的方法来弥补设备不足， 达到扩大生产的目的。习惯上以 25%-30%的酒母接种量进行分割接种， 可大大缩短培养时间，经过 6-8 h培养，酒母就成熟了，提高了设备利 用率。
于缩短延滞期，提高设备的利用率； 3）菌种能保持稳定的生产性能，生理状态稳定； 4）无杂菌和噬菌体的污染。
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第4章酒母扩培工艺
•第二节 酒母扩培工艺
2.2 酒母扩培工艺
•砂土管孢 子
•冷冻干燥孢 子
•斜面培养
发酵菌种扩大培养的一般工艺流程
发酵菌种扩大培养的一般工艺流程
发酵菌种扩大培养是生物制药、食品工业和农业等领域中常见的一项技术。
下面是一般的发酵菌种扩大培养的工艺流程。
1. 菌种前处理：选择合适的菌株并进行预处理。
这包括接种菌株到适宜的培养基中，以及优化培养条件，如温度、pH值和培养基成分等。
预处理的目的是为了提高菌种的生长速度和产量。
2. 发酵罐的选择：根据菌种的特性和生产需求选择合适的发酵罐。
常见的发酵罐有批式发酵罐、连续式发酵罐和固定床发酵罐等。
3. 发酵罐装载和接种：将预处理好的菌种接种到发酵罐中。
接种时要注意保持无菌操作，以避免杂菌的污染。
4. 发酵过程的控制：在发酵过程中，需要对温度、pH值、氧气供应、搅拌速度和营养物质等进行控制和调节。
这些参数的控制可以通过自动化系统进行，以保证菌种的最佳生长条件。
5. 发酵罐内的生物反应：菌种在发酵罐中进行生长和代谢活动，产生所需的物质。
不同的菌株和产品需要不同的发酵时间，一般需要几天到几周不等。
6. 产物的回收和纯化：发酵结束后，需要对发酵液进行回收和纯化。
这包括离心、过滤、浓缩和柱层析等步骤，以获得纯度较高的产物。
7. 发酵罐的清洗和消毒：发酵结束后，需要对发酵罐进行清洗和消毒，以准备下一轮的发酵。
以上是发酵菌种扩大培养的一般工艺流程。
在实际应用中，还需要根据具体的菌株和产品进行优化和调整。
发酵菌种扩大培养技术的发展，为生物制药和食品工业的发展提供了强大的支持，也为我们生活带来了更多的便利和好处。
酵母扩培及工艺卫生控制
次活化 ： 冷冻管内的培养基全部转入 ５ Ｌ麦汁试 ｍ 管中， 培养 ７ 小时 ； ２ 第二次活化 ： 用接种针接种三 环液体菌液 到另一支 ５ Ｌ 汁试管 中 ， ｍ 麦 培养 ３ ６ 小时 ； 第三次活化 ： 用接种针接种两 环液体菌 液 到另一支 ｌｍ 麦汁试管 中， ＯＬ 培养 ３ 小 时。真空 ６
冷冻保藏 的菌种要提前置于室温下 ， 样可避免 这 温度的变化造成菌种死亡率 上升。对于液体石
蜡保藏的菌种一般进行 两次活化。第一次活化 ： 用接种针挑取一环液体石蜡保藏的菌苔 ， 于试管 壁触一下 ， 沥去液体石蜡 ， 接种 到一支 ５ Ｌ麦 汁 ｍ 试管中， 培养 ７ 小时 ； ２ 第二次活化 ： 用接种针接种 两环液体 菌液到另一支 ｌｍ 麦 汁试 管 中， ＯＬ 培养
酒精擦洗双手 ， 移入无菌室的用具也都要用 ７ ％ ５
的酒精擦洗或灼 烧。操作完 毕后用 ７ ％酒精擦 ５ 拭工作台面及接种好的容器表面 ， 打开紫外灯杀
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（ 液态，超临界 ）
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真空冷 冻 保 藏 的 菌种 一 般 进 行 三 次 活 化 。第 一
为了保证杀菌麦汁吸氧充分 ， 汁培养基应提前 麦
２ ３ ～ 天杀菌备用 ， 这一点对卡氏罐麦汁准备尤其
重要。另外 ， 培养期 间， 可通过摇动来补充氧气 ，
一
般培养期间每 １ 小时摇 动一次扩培液 ， ２ 每次摇
动１２ ～ 分钟 。 １４ 酵母培养温度控制 ． 培养温度逐 步降低 以适应大生 产要求。前 期培养一般放在生化培 养箱 中 自动 控温。卡氏
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教学内容备注本章主要内容：
4.1 酒精酵母简介
4.2 酵母菌的生长条件
4.3 活性干酵母
4.4 活性干酵母的使用方法
4.5 固定化酵母技术和酵母扩培工艺实例
第4章酒精酵母扩培工艺
糖化醪内加入酵母菌后，糖分被酵母细胞吸收，经过酵母细胞内糖－酒精转化酶系统的作
用，最终生成酒精、CO2和能量，其中一部分能量被酵母细胞用作新陈代谢，余下的能量和酒精
以及CO2一起，通过细胞膜排出细胞外。
酵母菌就是以这样的方式进行糖的酒精发酵，从而生产
酒精的。
4.1 酵母菌的培养
酵母（Saccharomyces cerevisiae），原意为“发酵之母”，就是说，酒精发酵是由酵母菌
的作用引起的。
4.1.1 酵母菌简介
4.1.1.1 酵母菌的大小、形态和结构
图 4-1酵母菌的细胞形态
酵母菌是单细胞真核微生物。
酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、
柠檬形或藕节形等，如图4-1所示。
细胞表面积和其体积之间的比例会影响到细胞和培养基之
间传质的速度，因此，对酵母的生命活动强度也有影响。
酵母菌一般为1~5微米×5~30微米，无鞭毛，不能游动。
酵母菌具有典型的真核细胞结构（如图4-2所示），有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、
液泡、线粒体等，有的还具有微体。
4－2 典型酵母菌的细胞结构
其中，细胞壁，主要分三层：外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，中间夹有一层蛋白质分子。
细胞膜，也是三层结构，主要成分为：蛋白质、类脂、和少量糖类。
细胞膜是由上下两层磷脂分子以及镶嵌在其间的缁醇和蛋白质分子所组成的。
其功能主要有：调节细胞外溶质运送到细胞内的渗透屏障；细胞壁等大分子成分的生物合成和装配基地；部分酶的合成和作用场所。
细胞核，酵母菌具有用多孔核膜包裹起来的定型细胞核—真核。
核膜是一种双层单位膜，其上存在着大量直径为40～70 nm的核孔，用以增大核内外的物质交换。
酵母菌其他细胞结构包括液泡、质粒（“2μm”质粒）、核糖体（沉降系数为80 s）、线粒体（双层膜构成的产能细胞器，能量代谢的场所）。
4.1.1.2 酵母菌的繁殖
用于酒精发酵的酵母是一种单细胞的微生物，属于子囊菌纲。
酵母菌有多种繁殖方式，繁殖方式对于酵母菌的鉴定十分重要。
有人把只进行无性繁殖的酵母菌称作“假酵母”，而把具有有性繁殖的酵母菌称作“真酵母”。
1．酵母菌的无性繁殖
芽殖：酵母菌最常见的无性繁殖方式是芽殖。
芽殖发生在细胞壁的预定点上，此点被称为芽痕，每个酵母细胞最多有一个芽痕。
成熟的酵母细胞长出芽体，母细胞的细胞核分裂成两个子核，一个随母细胞的细胞质进入芽体内，当芽体接近母细胞大小时，自母细胞脱落成为新个体，如此继续出芽。
如果酵母菌生长旺盛，在芽体尚未自母细胞脱落前，即可在芽体上又长出新的芽体，最后形成假菌丝状。
裂殖：是少数酵母菌进行的无性繁殖方式，类似于细菌的裂殖。
其过程是细胞延长，核分裂为二，细胞中央出现隔膜，将细胞横分为两个具有单核的子细胞。
进行裂殖的酵母菌种类很少，例如裂殖酵母属Schizosaccharomycesoctosporus（八孢裂殖酵母）等。
h ，待表面冒出大量的CO 2泡沫时，即为培养成熟。
卡氏罐种子的质量标准为：酵母细胞数0.8～1.0亿个/mL ，出芽率20%～30%，染色率1%以下，无杂菌，耗糖率35%～40%，耗糖率可按下式计算：
2．酒母车间扩大培养
酵母菌经试验阶段扩大培养以后，即转入酒母车间扩大培养。
酒母车间所用的培养基，主要以大生产的原料为主，适当添加一些营养物质。
其流程为：卡氏罐-→小酒母罐-→大酒母罐-→成熟酒母送发酵车间
酒母培养罐：
酒母罐的结构，如图4-3所示，均为铁制圆筒形，其直径与高度之比近1:1，底部为锥形或碟形，底部中央有排出管，罐盖是平的，有的封头也用锥形或碟形，罐体密封。
罐上装有搅拌器，通过传动装置转动，或直接用电机经减速器而带动，搅拌速度为80-100 r ／min ， 因为酒母培养罐的搅拌器利用率不高，因此，有条件的厂如有液体曲车间的工厂就采用通风搅拌罐，以无菌空气代替机械搅拌，其效果一样，不仅简化设备和节省电机与传动装置，还可消除车间噪音。
酒母罐内设有兼作冷却或加热用的蛇管，其冷却面积为醪液容积的2倍左右，大酒母罐体积是小酒母罐体积的10倍，酒母罐的数目，可根据发酵产量来计算。
1-人孔 2-CO 2排出管 3-进醪管 4-视镜 5-温度计 6-冷却水管 7-排醪管
图 4－3酒母培养罐
4.2.3 酒母扩培方法
（1）间歇式培养法 此法是分小酒母罐与大酒母罐两个阶段进行培养。
这种培养方法是先将酒母罐清洗干净，并对罐体和所用管道进行灭菌后，将已制备好的酒母糖化醪或稀糖蜜泵入小酒母罐中，并接人卡氏罐或大三角瓶菌种，通入无菌空气，使卡氏罐酒母与酒母罐的醪液混合均匀，同时提供氧气供酵母菌生长繁殖。
控制酒母醪温度在28～30℃之间进行培养。
待醪液的糖量降低40%～45%、酒精体积分数在3%～4%、液面产生大量的CO 2及酵母细胞数达到0．8亿个/mL 时，酒母即培养成熟，培养时间约20 h 左右。
同样也可将培养成
-%100% 醪液原始糖度酒母成熟醪糖度耗糖率()=醪液原始糖度
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