实验方案gateway
gateway的负载均衡策略
gateway的负载均衡策略Gateway的负载均衡策略引言：在现代网络架构中，负载均衡是一项重要的技术，它能够将网络流量分散到多个服务器上，以提高系统的可用性和性能。
而在网关（Gateway）这个关键的网络设备上，负载均衡策略的选择和配置对于整个网络的稳定和高效运行至关重要。
本文将介绍几种常见的网关负载均衡策略及其特点，以帮助读者更好地理解和应用这些策略。
一、轮询策略轮询策略是最简单且常见的负载均衡策略之一。
它将请求按照顺序依次分发给后端服务器，实现了请求均匀地分配到每个服务器上。
该策略适用于后端服务器性能相近且负载相对平衡的情况。
然而，当某个服务器负载过高或者响应速度较慢时，轮询策略无法根据实际情况进行动态调整，可能导致请求分发不均衡的问题。
二、加权轮询策略为了解决轮询策略的不足，加权轮询策略引入了权重的概念。
每个后端服务器都被赋予一个权重值，权重越高的服务器能够处理的请求越多。
这样可以根据服务器的性能和负载情况，动态地调整权重值，使得负载分配更加合理。
加权轮询策略适用于后端服务器性能不均衡或者负载波动较大的情况。
三、最少连接策略最少连接策略是根据后端服务器的连接数来进行负载均衡的策略。
该策略将请求分发给当前连接数最少的服务器，以确保服务器的负载均衡。
最少连接策略适用于处理长连接请求，能够更好地利用服务器资源。
然而，当服务器的处理能力不均衡时，可能导致某些服务器的连接数过高，从而影响整体的负载均衡效果。
四、IP哈希策略IP哈希策略是根据客户端的IP地址进行负载均衡的策略。
它将相同IP地址的请求分发到同一个后端服务器上，以保证同一客户端的请求都被同一个服务器处理。
这种策略可以确保与特定客户端的会话信息保存在同一个服务器上，适用于需要保持会话一致性的应用场景。
然而，当客户端数量较少或者IP地址分布不均匀时，IP哈希策略可能导致负载不均衡的问题。
五、动态负载策略动态负载策略是根据服务器的实时负载情况进行动态调整的策略。
Gateway
LR反应
第二步：表达克隆载体的构建（LR反应）
• 混合包含目的基因的入门克隆和合适的目 的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表 达载体。目的载体必须含有attR同源序列， 可与含有attL的入门载体进行定点同源重组。
为什么要构建入门载体？
• Entry Clone是作为基因的一个来源克隆以便 较容易地亚克隆到任意目标载体。 • 同时，一旦Entry Clone是测序有效的，就 不需要对多个表达载体进行测序。 • 另外，attB序列相对较小（25bp），这使得 它们更适合加到PCR引物中去（需要在5'端 附加4个G以便进行有效重组）。
用pANIC 7A构建的表达载体，通过基因枪技术导入小麦和柳枝稷中， 观察pporRFP红色荧光蛋白基因的表达。红色荧光蛋白自发荧光率较低 而且红光穿透力更强，最高吸收峰为583nm。
实例二[1]
• 为方便基于植物瞬时表达技术的高通量功 能基因筛选，利用G技术入门载体pDONR222的经过酶 切后连接到植物表达载体pCAMBIA0380的 多克隆位点上，构建Gateway技术兼容的 p1104D植物表达载体。
谢谢听P—λ噬菌 体同源重组 位点 attB—E.coli 染色体上的 同源重组位 点
修饰后的位点信息
Gateway技术只需要两步反应就可完成表 达载体的构建。 反应 反应位点 反应产物 产物结构 BP反应 attB×attP 入门克隆载体 attL1-基因-attL2
LR反应 attL×attR 表达克隆载体 attB1-基因-attB2
第一步：入门载体的构建
有四种方法: A. 限制性内切酶消化目的基因后酶连进入 入门载体 B. PCR克隆，以含attB的特异引物合成目的 基因资源
Gateway载体构建系统
• 基于λ噬菌体位点特异性的重组主要涉及两个成 分： 1、DNA重组序列 即att位点（包括att B 、att P 、 att L 、att R）
λ重组反应就是发生在这些特异的att位点上，重组反 应中交换位点实际上只是发生在两个位点核心的15bp同源 区域，不过核心外围的序列也是不可或缺的，它们含有重 组蛋白的结合位点。
Gateway克隆技术的改进与发展
• Gateway载体引进ccdB基因作为重组克隆的负筛选，有效地避免传统酶切连 接中由于自连载体的转化等因素造成的假阳性现象，大大提高了筛选效率， 但由于ccdB基因是毒性基因，所以限制了其在实验室之外其他领域的应用。 • Invitrogen 公司对 Gateway 克隆系统进行改进, 形成了 N-和 C-端 Gateway 克 隆系统。即利用 PCR 技术分别扩增两个片段, 这两个片段的N-端和C-端分别 含有attB1和attB2位点, 而他们的C-端和N-端含有一段相同的序列。这样当与 含有attP1和attP2的载体混合后, 在attB和attP之间发生位点特异性重组,而在 两个PCR 产物之间发生同源重组。这样就使两个片段与载体构建成一个含有 嵌合基因的质粒。 • 于2004年推出的Rec-Join 专利克隆技术是对 Gateway技术的一个发展。即目 的基因与目的载体的结合处一端采用 Gateway重组的方法：即目的载体一端 保留attR位点; 另一端采用经典克隆的方法，即另一端 attR位点被替换成酶切 位点的序列，克隆的步骤大致为“酶切 － 连接 － 重组”。
其基本过程可以表示为:attBXattP←→attLXattR
BP反应
BP 反应是利用BP 克隆酶混和物催化一个带有 attB 位点的 DNA 片段或表达克隆和一个带有attP 位点的供载体 ( donor vector) 之间的重组反应，把目的片段及其两端部分位点转移 至供载体中，创建一个入门克隆，其结构为 attL1-基因attL2。同时，供载体中的 ccdB 细胞死亡控制基因及其两端 部分位点被置换出来，单独或融合到表达载体中而形成副产物。
教你做Gateway
This distribution of Gateway vectors is supported by the Functional Genomics Division of the Department of Plant Systems Biology (VIB-Ghent University).Vector ElementsHere is a list of the vector elements present in the plasmids. The vector elements have been drawn to scale.Nomenclature of the ConstructsThe following codes are used for naming the different elements of the constructs:∙Gateway attR1, CmR, ccdB, attR2 orientation= GW∙Gateway attR2, ccdB, CmR, attR1 orientation= WG∙Multi site Gateway attR4, ccdB, CmR, attR2 orientation= m42GW∙Multi site Gateway attR2, ccdB, CmR, attR4 orientation= m24GW∙Multi site Gateway attR4, ccdB, CmR, attR3 orientation= m43GW∙Multi site Gateway attR3, ccdB, CmR, attR4 orientation= m34GW∙gus=S∙gfp= F∙cfp= C∙luciferase= L∙yfp= Y∙gfp-gus= FS∙Intron= I∙pPZP200= p∙pnos-kan-tnos= K∙pnos-Hyg-tnos= H∙pnos-Bar-tnos= B∙prolD-gfp-t35S= D∙1-5= Promoterso1=pnoso2=p35So3=o4=o5=6-9= Terminatorso6= tnoso7= t35So8=o9=To indicate the version of a construct, we place a comma after the name with a number thatindicates the version number minus 1. So, for instance, pJCGLOX,0 is the first version of thepJCGLOX vector. The name pJCGLOX,1 would then indicate the second, improved version ofthat construct, and so on. For brevity's sake, this comma and version nummber are omitted whenreferring to most version 1 constructs, or to the collective of the constructs. So, pJCGLOX,0 issimply referred to as pJCGLOXGateway™ vectors Oligo DesignWel The following figures will give you an overview of how to design primers for cfp, gfp and yfp fusion on theGateway ™ vectors of this site.C-terminal fusionDestination ClonesWhat is the bacterial host strain of the vectors?The host strain of all vectors is E. coli DB3.1 from Invitrogen. The vectors contain the bacterial ccdB gene, which encodes an anti-DNA gyrase protein. The E. coli strain DB3.1 contains a mutation in the DNA gyrase gene so that the ccdB protein is unable to bind the mutant DNA Gyrase protein. In this strain the DNA is replicated normally and colonies growWhich antibiotic(s) can we use for growing the constructs?For all binary vectors you should use Spectinomicin at concentration of 50mg/l. For high copy number vectors you should use Ampicillin at a concentration of 100 mg/l.。
gateway注解
gateway注解摘要：1.什么是Gateway 注解2.Gateway 注解的作用3.Gateway 注解的使用场景4.Gateway 注解的实现原理5.总结正文：Gateway 注解是一种在软件开发中用于处理请求和响应的注解。
它可以在不同的服务之间进行请求和响应的转发，从而实现服务的解耦。
Gateway 注解通常用于微服务架构中，它能够简化服务的调用，提高系统的可扩展性和可维护性。
Gateway 注解的主要作用是实现请求和响应的转发。
当客户端发起一个请求时，Gateway 注解会根据请求的URL 和其他信息，判断该请求应该转发到哪个服务上。
然后，Gateway 注解会将请求转发到对应的服务，并等待该服务的响应。
最后，Gateway 注解会将服务返回的响应返回给客户端。
Gateway 注解的使用场景包括但不限于以下几种：1.服务之间的解耦：通过Gateway 注解，不同的服务可以独立开发和部署，只需要关注自己的业务逻辑，而不需要关心服务的调用。
2.请求和响应的统一处理：Gateway 注解可以在请求和响应的转发过程中，对请求和响应进行统一的处理，例如日志记录、限流、熔断等。
3.服务路由：Gateway 注解可以根据请求的URL 和其他信息，实现服务之间的路由，从而提高系统的灵活性和可扩展性。
Gateway 注解的实现原理主要涉及到两个方面：一是注解的解析，二是请求和响应的转发。
首先，Gateway 注解需要通过注解解析器，将注解中的信息提取出来，例如请求的URL、服务的名称等。
然后，Gateway 注解需要根据解析出的信息，调用服务注册中心，获取服务的地址和相关的信息。
最后，Gateway 注解需要根据请求的类型（GET、POST 等）和服务的地址，发起请求，并等待响应。
总结起来，Gateway 注解在软件开发中有着重要的作用，它可以简化服务的调用，提高系统的可扩展性和可维护性。
Gateway
Gateway™技术提供以下可能：∙通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间∙将您的基因转入到多个表达系统∙在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达Gateway™技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。
这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95％或更高。
当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。
Gateway™也有助于进行带不同数目纯化和检测标签的表达。
Gateway™利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。
一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您感兴趣的基因到Gateway™改造过的的各种表达载体（目的载体）。
此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆的测序担心。
在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。
图1-Gateway™技术的灵活性*目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。
一种强大而可靠的技术Gateway™技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。
一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。
Gateway™技术是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。
BP和LR两个反应就构成了Gateway™技术（表1和图2）。
BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。
LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。
LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
Gateway™技术也利用了ccdB选择方法，确保高效率的分离重组克隆。
典型的效率是＞95％。
Gateway_载体构建
Gateway技术特点：
通过去除冗长的亚克隆步骤节省操作时间，同时将目的 基因转移到多个表达系统，在任何选择的表达系统如细菌， 酵母，昆虫，或哺乳动物进行基因的分析表达。
Gateway技术的灵活性：
Gateway技术的原理
Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿 主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的 作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点 可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌 的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。这 是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、 Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和 attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。这一过程的 方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
BP重组装入入门载体
1:添加attB接头的PCR 以携带目的基因质粒为模板 ，加含部分接头的基 因特异性引物,进行第一轮PCR 2 :取第一轮的PCR产物做模板，加入通用引物，进行第二轮 3：PCR产物的纯化
4：BP重组反应
BP重组反应
Components Sample attB-PCR product （>10ng） 1-7ul pENTR vector (150 ng/ul) 1ul 5X BP Clonase Clonase enzyme mix 2ul TE Buffer, pH 8.0 to 10ul
Gateway技术 克隆、表达新方法
Gateway技术
Gateway技术：
一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在 的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆 到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。
Gateway技术操作指南
Gateway技术操作指南Gateway? Cloning ProtocolsThe Basics of Gateway? ReactionBP reaction—to create a Gateway entry cloneLR reaction—to create a Gateway expression cloneOne tube format—to create a Gateway expression c lone from a PCR product Gateway Vector Conversion—converting your favorite cloning vectors to Gat eway? TechnologyTOPO? TA Cloning - To Create a Gateway? Entry CloneStep One - Produce PCR productProduce PCR products using Taq polymerase and your own protocol. End thePCR reaction with a final 7 to 30 minute extension step.Step Two - Perform the TOPO? Cloning Reaction1. Set up one of the following TOPO? Cloning reactions using the reagentsin the order shown. For electroporation, dilute Salt Solution 4-fold to prepare Dilute Salt Solution.Reagent Chemical Txn ElectroporationFresh PCR product 0.5 to 4 µl0.5 to 4 µlSalt Solution 1 µl--Dilute Salt Solution -- 1 µlSterile Water to a final volume of 5 µl t o a final volume of 5 µlTOPO? Vector 1 µl 1 µlTotal volume 6µl6µl2. Mix gently and incubate for 5 minutes at room temperature.3. Place on ice and proceed to transform One Shot? chemically competentE. coli, belowStep Three - Transform One Shot? Chemically Competent E. coli1. For each transformation, thaw one vial of One Shot? E. coli cells onice.2. Add 2 µl of the TOPO? Cloning reaction into a vial of One Shot? chemically competent E. coli and mix gently.3. Incubate on ice for 5 to 30 minutes.4. Heat-shock the cells for 30 seconds at 42°C without shaking. Immediatelytransfer the tube to ice.5. Add 250 µl of room temper ature S.O.C. Medium.6. Incubate at 37°C for 1 hour with shaking.7. Spread 10-50 µl of bacterial culture on a prewarmed LB agar plate containing100 µg/ml spectinomycin, and incubate overnight at 37°C.The Basics of Gateway? ReactionsBP ReactionCreati ng a Gateway? entry clone from an att B-flanked PCR product is an easy 1 hour reaction. See below for an overview of the set-up. For more detailed information, refer to the manual.1.Add the following components to a 1.5 ml tube at room temperatureand mix:attB-PCR product (=10 ng/µl; final amount ~15-150 ng) 1-7 µlDonor vector (150 ng/µl) 1 µlTE buffer, pH 8.0 to 8 µl2.Thaw on ice the BP Clonase? II enzyme mix for about 2 minutes. Vortexthe BP Clonase? II enzyme mix briefly twice (2 seconds each time).3.To each sample (Step 1, above), add 2 µl of BP Clonase? II enzymemix to the reaction and mix well by vortexing briefly twice.Microcentrifuge briefly.4.Return BP Clonase? II enzyme mix to -20°C or -80°C storage.5.Incubate reactions at 25°C for 1 hour.6.Add 1 µl of the Proteinase K solution to each sample to terminatethe reaction. Vortex briefly. Incubate samples at 37°C for 10minutes.Transformation1.Transform 1 µl of each BP reaction into 50 µl of One Shot ? OmniMAX2 T1 Phage-Resistant Cells (Catalog no. C8540-03). Incubate on ice for 30 minutes. Heat-shock cells by incubating at 42°C for 30 seconds. Add 250 µl of S.O.C. Medium and incubate at 37°C for 1 hour with shaking. Plate 20 µl and 100 µl of each transformationonto selective plates. Note: Any competent cells with atransformation efficiency of >1.0 ×10 8 transformants/µg may be used.2.Transform 1 µl of pUC19 DNA (10 ng/ml) into 50 µl of One Shot ?OmniMAX ? 2 T1 Phage-Resistant Cells as described above. Plate 20 µl and 100 µl on LB plates containing 100 µg/ml kanamycin, or the appropriate selection marker for your donor vector.Expected ResultsAn efficient BP recombination reaction will produce >1500 colonies if the entire BP reaction is transformed and plated.LR ReactionTransferring your gene from a Gateway? entry clone to destination vector is an easy 1 hour reaction. See below for an overview of the set-up. For more detailed information, refer to the manual.1.Add the following components to a 1.5 ml tube at room temperatureand mix:Entry clone (50-150 ng) 1-7 µlDestination vector (150 ng/µl) 1 µlTE buffer, pH 8.0 to 8 µl2.Thaw on ice the LR Clonase ? II enzyme mix for about 2 minutes.Vortex the LR Clonase ? II enzyme mix briefly twice (2 seconds each time).3.To each sample (Step 1, above), add 2 µl of LR Clonase ?II enzymemix to the reaction and mix well by vortexing briefly twice.Microcentrifuge briefly.4.Return LR Clonase ? II enzyme mix to -20°C or -80°C storage.5.Incubate reactions at 25°C for 1 hour.6.Add 1 µl of the Proteinase K solution to each sample to terminatethe reaction. Vortex briefly. Incubate samples at 37°C for 10minutes.TransformationFollow the protocol as indicated for the BP reaction, except use the appropriate selection marker for the LB plates suited to your destination vector (typically 100 µg/ml ampicillin).Expected ResultsAn efficient LR recombination reaction will produce >5000 colonies if the entire LR reaction is transformed and plated.One Tube FormatIf you want to transfer your attB-flanked PCR product directly into an expression clone, you can easily combine the BP and LR reactions using the following protocol. This will potentially eliminate the transformation and DNA isolation of the Gateway? entry clone.1.In a 1.5 ml microcentrifuge tube, prepare the following 15 µl BPreaction:attB DNA (50-100 ng) 1.0-5.0 µlattP DNA (pDONR?vector, 150 ng/µl) 1.3 µlBP Clonase?II enzyme mix 3.0 µlTE Buffer, pH 8.0 add to a final volume of 15 µl2.Mix well by vortexing briefly and incubate at 25°C for 4 hours.Note: Depending on your needs, the length of the recombinationreaction can be extended up to 20 hours. An overnight incubation typically yields 5 times more colonies than a 1 hour incubation. Longer incubation times are recommended for large plasmids (=10 kb) and PCR products (=5 kb).3.Remove 5 µl of the reaction to a separate tube and use this aliquotto assess the efficiency of the BP reaction (see below).4.To the remaining 10 µl reaction, add:Destination vector (150 ng/µl) 2.0 µlLR Clonase?II enzyme mix 3.0 µlFinal volume 15 µl5.Mix well by vortexing briefly and incubate at 25°C for 2 hours.Note: Depending on your needs, the length of the recombinationreaction can be extended up to 18 hours.6.Add 2 µl of proteinase K solution. Incubate a t 37°C for 10 minutes.7.Transform 50 µl of the appropriate competent E. coli with 1 µl ofthe reaction.8.Plate on LB plates containing the appropriate antibiotic to selectfor expression clones.Assessing the Efficiency of the BP Reaction1.To the 5µl aliquot obtained from “One-Tube” Protocol, Step 3,above, add 0.5 µl of proteinase K solution. Incubate at 37°C for10 minutes.2.Transform 50 µl of the appropriate competent E. coli with 1 µl ofthe reaction. Plate on LB plates containing the appropriateantibiotic to select for entry clones.Gateway? Vector ConversionConverting your favorite set of cloning vectors to Gateway? Technologyis a fairly straightforward protocol, and will ultimately allow you to streamline your cloning and expression process.To con vert your cloning vector to a Gateway? destination vector, you will:1.Choose the appropriate reading frame cassette to use depending onyour needs.2.Linearize the vector you wish to convert with a restriction enzymeof choice. If you use a restriction enzyme that generates anoverhang, you will need to blunt the ends.3.Remove the 5' phosphates from the vector using calf intestinalalkaline phosphatase.4.Ligate the reading frame cassette into your vector using T4 DNAligase.5.Transform the liga tion reaction into One Shot? ccdB Survival?Competent E. coli and select for transformants.6.Analyze transformants.。
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实验方案Gateway® 反应的基本原理∙BP反应—构建Gatew ay® 入门克隆∙LR 反应—构建Gatew ay® 表达克隆∙一管模式—从PCR 产物构建Gatew ay® 表达克隆∙Gatew ay® 载体转化—将您喜爱的克隆载体转化成Gatew ay® 载体TOPO® TA 克隆- 创建Gateway® 入门克隆∙∙步骤一–制备PCR 产物使用Taq 聚合酶和自己的方案生成PCR 产物。
通过最后7 到30 分钟的延伸步骤，结束PCR 反应。
步骤二- 进行TOPO® 克隆反应1. 按所示顺序使用试剂，以建立以下一种TOPO® 克隆反应。
对于电穿孔，将盐溶液稀释 4 倍以制备稀释盐溶液。
试剂化学转染电穿孔法新鲜的PCR 产物0.5 至 4 µl 0.5 至 4 µl盐溶液 1 µl --稀释盐溶液-- 1 µl无菌水至终体积为 5 µl 至终体积为 5 µlTOPO® 载体 1 µl 1 µl总体积 6 µl 6 µl∙2. 轻轻混合并在室温下孵育 5 分钟。
3. 置于冰上，然后开始转化One Shot® 化学感受态 E. coli，步骤如下步骤三- 转化One Shot® 化学感受态E. coli1. 每次转化时，解冻置于冰上的一小瓶One Shot® E. coli 细胞。
2. 在一小瓶One Shot® 化学感受态E. coli 中加入 2 µl TOPO® 克隆反应液，轻轻混匀。
3. 在冰上孵育 5 至30 分钟。
4. 将细胞置于42°C 下热休克30 秒，不振荡。
立即将试管转移至冰上。
5. 加入250 µl 室温S.O.C. 培养基。
6. 在37°C 下振荡孵育 1 小时。
7. 在预热的LB 琼脂平板上涂布10-50 µl 细菌培养物（琼脂平板含有100 µg/ml 大观霉素），并于37°C 下过夜孵育。
Gateway® 反应的基础知识∙∙∙∙BP 反应从含有att B 侧翼序列的PCR 产物到生成Gatew ay® 入门克隆只需 1 小时的简单反应。
参见下文的实验设置概述。
更多详细信息，请参阅说明书。
1. 在室温下向 1.5 ml 管中加入下述组分并混匀：attB-PCR 产物（=10 ng/µl；最终量~15-150 ng）1-7 µl供体载体(150 ng/µl) 1 µlTE缓冲液，pH 8.0 补充至8 µl2. 将BP Clonase™ II 酶混合物置于冰上约 2 分钟解冻。
对BP Clonase™ II 酶混合物稍微震荡两次（每次 2 秒）。
3. 对于每份样品（上述步骤1），向反应液中加入 2 µl BP Clonase™ II 酶混合物，稍微震荡两次以充分混匀。
进行短暂的低速离心。
4. 将BP Clonase™ II 酶混合物放回-20°C 或-80°C 储存。
5. 反应体系25°C 孵育 1 小时。
6. 向每份样品中加入 1 µl 蛋白酶K 溶液来终止反应。
稍微震荡。
在37°C 下孵育样品10分钟。
转化7. 取 1 µl 的各LR 反应液转化50 µl One Shot® OmniMA X ™ 2 T1 噬菌体抗性细胞（目录号C8540-03).冰上孵育30 分钟。
通过30 秒的42°C 孵育对细胞进行热休克。
加入250 µlS.O.C. 培养基并在37°C 震荡孵育 1 小时。
将20 µl 和100 µl 每种转化液分别涂布于选择性平板上。
注意：任何转化率达>1.0 × 10 8 转化子/µg 的感受态细胞均可以使用。
8. 取 1 µl pUC19 DNA (10 ng/ml) 转化50 µl 上述One Shot ® OmniMAX™ 2 T1 噬菌体抗性细胞。
在含100 µg/ml 卡那霉素或含供体载体的相应选择性标记物的LB 平板上涂布20µl 和100 µl。
预期结果如果转化并涂布全部BP 反应液，则高效的BP 重组反应将产生1500 个以上的菌落。
∙∙LR 反应将基因从Gatew ay® 入门克隆转移至目的载体只需 1 小时的简单反应。
参见下文的实验设置概述。
更多详细信息，请参阅说明书。
1. 在室温下向 1.5 ml 管中加入下述组分并混匀：入门克隆(50-150 ng) 1-7 µl目的载体(150 ng/µl) 1 µlTE缓冲液，pH 8.0 补充至8 µl2. 将LR Clonase™ II 酶混合物置于冰上约 2 分钟解冻。
对LR Clonase™ II 酶混合物进行两次短暂的漩涡震荡（每次 2 秒）。
3. 对于每份样品（上述步骤1），向反应液中加入 2 µl LR Clonase ™II 酶混合物，并通过两次短暂的漩涡震荡将其混合均匀。
进行短暂的低速离心。
4. 将LR Clonase™ II 酶混合物放回至-20°C 或-80°C 储存。
5. 反应体系25°C 孵育 1 小时。
6. 向每份样品中加入 1 µl 蛋白酶K 溶液来终止反应。
稍微震荡。
在37°C 下孵育样品10分钟。
转化按照BP的对应方案操作，不同的是需要在适合目的载体的LB 平板上使用选择性标志物（通常是100 µg/ml 氨苄青霉素）。
预期结果如果转化并涂布全部LR 反应液，则高效的LR 重组反应将产生5000 以上个菌落。
单管形式如果希望将两侧具有attB 位点的PCR 产物直接转移到表达克隆中，可以使用以下方案轻松的将BP和LR 反应结合在一起。
这样就避免了构建Gatew ay® 入门克隆时的转化和DNA 提取过程。
1. 在一个 1.5 ml 的微型离心管中，准备如下的15 µl BP反应体系：attB DNA (50-100 ng) 1.0-5.0 µlattP DNA（pDONR™ 载体，150 ng/µl）1.3 µlBP Clonase™ II 酶混合物 3.0 µlTE缓冲液，pH 8.0，最终体积为15 µl2. 在震荡器上稍微震荡，充分混匀反应混合物，然后于25°C 孵育 4 小时。
注意：根据需要，重组反应的时间也可以延长多达20 小时。
与仅孵育 1 小时相比，过夜孵育通常可多产生 5 倍的菌落。
对于较大的质粒(=10 kb) 和较长的PCR 产物(=5 kb)，推荐采用较长的孵育时间。
3. 从反应体系中取出 5 µl 移到另一管中，用以评估BP反应的效率（见下文）。
4. 向余下的10 µl 反应体系中加入：目标载体(150 ng/µl) 2.0 µlLR Clonase™ II 酶混合物 3.0 µl最终体积为15 µl5. 在震荡器上稍微震荡，充分混匀反应混合物，然后于25°C 孵育 2 小时。
注意：根据需要，重组反应的时间也可以延长多达18 小时。
6. 加入 2 µl 蛋白酶K 溶液。
于37°C 孵育10 分钟。
7. 用 1 µl 反应产物转化50 µl 相应的感受态 E. coli。
8. 然后涂板于含相应抗生素的LB 平板，以便筛选表达克隆。
评估BP 反应的效率1. 向由上述“单管”方案的步骤 3 得到的 5 µl 反应产物中加入0.5 µl 蛋白酶K 溶液。
于37°C 孵育10 分钟。
2. 用 1 µl 反应产物转化50 µl 相应的感受态E. coli。
涂板于含相应抗生素的LB 平板，以便筛选入门克隆。
∙∙Gatew ay® 载体转化(Gatew ay® Vector Conversion)将最爱使用的克隆载体组转化为Gatew ay® 载体是一种相当直观的方案，这种转化最终能简化克隆和表达过程。
如要将克隆载体转化为Gatew ay® 目的载体，需要：1. 根据需要选择合适的阅读框盒。
2. 利用选择的限制性内切酶，使要转化的载体线性化。
0如果使用的限制性内切酶会产生突出末端，则需要把末端补平。
3. 使用小牛肠碱性磷酸酶去除载体中的5' 磷酸。
4. 使用T4 DNA 连接酶将阅读框盒连接入载体中。
5. 用连接反应物转化One Shot® ccdB Survival™ 感受态E. coli，并筛选转化子。
6. 分析转化子。
Gateway技术──基因克隆和表达的新技术作者：文/ Invitrogen 公司时间：2004-06-08 11:15:00 来源: 浏览次数 1789次浏览评论Gateway技术具有以下优点：·去除冗长的亚克隆步骤,节省操作时间；·能同时将基因转移到多个表达系统；·在选择的任何系统──体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物──进行分析表达。
Gateway技术是一项基因克隆和表达的新技术，通过Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。
这项体外技术大大简化了基因克隆和亚克隆的步骤，克隆效率却高于95%。
当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，可以保证正确的方向和阅读框。
此外Gateway技术也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。
Gateway技术利用了位点特异性重组，所以在构建好入门克隆(entry clone)后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。
一旦拥有了一个入门克隆，就可以多次使用，转移目的基因到Gateway兼容的各种表达载体（destination vector）。
由于重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而不必再对新的表达克隆进行测序。
这样，在使用每一种新的表达系统时，将会节省更多时间。
目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。
Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白的表达。