荧光技术
荧光分析技术的原理和方法
荧光分析技术的原理和方法荧光分析技术是一种分析和检测物质的方法，它不仅具有灵敏度高、特异性强等优点，而且还可以使用相对简单、易操作的设备和方法进行分析。
本文将探讨荧光分析技术的原理和方法，以及其在实际应用中的优缺点。
一. 荧光分析技术的原理荧光分析的基本原理是物质吸收能量后，由激发态自发辐射发出荧光。
荧光发射的波长与物质的结构和环境密切相关，因此可以根据荧光发射的波长来分析物质的成分和性质。
二. 荧光分析技术的方法荧光分析技术主要有荧光光谱分析、荧光显微镜、荧光免疫分析等几种。
1. 荧光光谱分析荧光光谱分析是一种利用荧光发射波长来分析物质的方法。
它通过激发样品，测量样品发出的荧光光谱来确定物质的化学成分和性质。
荧光光谱分析在生物医学领域有着非常重要的应用，比如用于检测蛋白质和动物细胞等生物分子。
2. 荧光显微镜荧光显微镜是一种利用荧光物质在显微镜下展现的亮度和颜色来观察样品的方法。
它可以将荧光染料标记在生物样品中，从而实现对生物分子和细胞的可视化。
荧光显微镜已经成为生物医学领域中最重要的观测手段之一，也是生物光学、光子学研究领域的必备工具。
3. 荧光免疫分析荧光免疫分析是一种利用荧光标记的抗体来检测分子的方法。
它通过将荧光标记的抗体与特定的分子结合，在荧光显微镜下观察荧光信号以检测分子。
荧光免疫分析主要用于医学诊断中的分子检测和细胞成像。
三. 荧光分析技术的应用荧光分析技术在许多领域中都有着广泛的应用。
主要涉及到生物医学、环境监测、食品安全检测、工业生产等方面。
1. 生物医学荧光分析在生物医学中的应用较为广泛，包括荧光显微镜观察生物结构、荧光免疫分析检测各种分子等。
2. 环境监测荧光分析技术可以将其应用于环境监测和环境污染控制。
比如用于污染物的快速检测、废水污染的监测、空气污染的监测等。
3. 食品安全检测荧光分析也可以用于食品安全检测，比如寻找食品中有害物质如农药、污染、病原体等。
4. 工业生产荧光分析技术也可以应用于工业生产，如半导体晶片生产、光学元器件制造等。
荧光免疫标记技术
荧光染料的选择与特性
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荧光染料种类
常见的荧光染料包括异荧光染料特性
不同的荧光染料具有不同的激 发波长和发射波长，可选择适 用于不同检测需求的染料。
荧光染料标记方式
荧光染料稳定性
荧光染料可以通过化学键合、 生物素-亲和素系统等方式与抗 体或抗原结合。
反应条件控制
为了确保抗原-抗体反应的顺利进行，需要控制适宜的反应条件， 如温度、pH值和离子强度等。这些条件会影响抗原和抗体的活性 以及它们之间的结合能力。
荧光染料的标记与染色
选择合适的荧光染料
根据实验需求选择具有特定波长的荧光染料，以便在检测时能够产生明显的荧 光信号。荧光染料应具有高灵敏度、低背景干扰和稳定性好的特点。
标记抗原或抗体
将荧光染料与抗原或抗体结合，形成带有荧光的标记物。标记的过程可以通过 化学方法或生物技术实现，确保荧光染料与抗原或抗体牢固结合。
结果观察与数据分析
荧光显微镜观察
通过荧光显微镜观察抗原-抗体复合物的荧光信号，可以定性或定量分析样本中 的抗原含量。观察时需注意控制激发波长和发射波长，以获得最佳的荧光信号。
数据分析
利用相关软件对荧光信号进行定量分析，通过测量荧光强度、荧光分布和荧光色 彩等信息，计算抗原浓度或细胞数量等指标。数据分析有助于提高实验结果的准 确性和可靠性。
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荧光免疫标记技术的优缺点
优点
高灵敏度
荧光免疫标记技术能够检测到低浓度的抗原或抗 体，具有较高的灵敏度。
特异性高
荧光免疫标记技术通常采用特异性的抗体或抗原 ，能够针对特定的目标进行检测，具有较高的特 异性。
流式细胞术
利用荧光免疫标记技术对细胞 表面抗原进行标记，通过流式 细胞仪进行检测和分析，可以 对细胞进行分群、计数和功能 研究。
荧光pcr技术
荧光PCR技术一、引言 1.1 荧光PCR技术的概述 1.2 荧光PCR技术的应用领域二、荧光PCR技术的原理与步骤 2.1 荧光PCR技术的基本原理 2.1.1 定性和定量分析 2.1.2 原位杂交 2.2 荧光PCR的步骤 2.2.1 反应体系的准备 2.2.2 条件设置与PCR扩增 2.2.3 荧光信号的检测与分析三、荧光PCR技术的优势与局限 3.1 优势 3.1.1 高灵敏度与特异性 3.1.2 快速与高效 3.1.3 可靠与准确 3.2 局限 3.2.1 花费较高 3.2.2 风险与误差四、荧光PCR技术在医学与生物学中的应用 4.1 临床诊断 4.1.1 基因突变检测4.1.2 传染病检测 4.2 病原微生物检测 4.2.1 病毒与细菌的检测 4.2.2 食品安全领域的应用 4.3 体外诊断 4.3.1 基因分型 4.3.2 癌症筛查五、荧光PCR技术的发展与前景展望 5.1 技术改进与创新 5.1.1 扩增方法的改良5.1.2 荧光探针的发展 5.2 应用领域的拓展 5.2.1 精准医学的发展 5.2.2 单细胞分析的应用总结引言荧光PCR技术是一种基于聚合酶链反应（PCR）原理的分析技术，通过引入荧光探针来实现对PCR产物的检测与分析。
该技术具有高灵敏度、高特异性、快速、准确等优点，在生物学和医学领域得到广泛应用。
荧光PCR技术的原理与步骤荧光PCR技术的基本原理荧光PCR技术旨在通过PCR反应扩增目标DNA序列，并利用荧光探针结合产物进行信号检测与分析。
荧光探针常用的有荧光染料标记的探针、TaqMan探针和Molecular Beacon等。
荧光PCR的步骤荧光PCR的步骤包括反应体系的准备、条件设置与PCR扩增以及荧光信号的检测与分析。
在反应体系中，需要添加模板DNA、引物、荧光探针等。
PCR扩增过程中，通过设置合适的温度和反应时间，实现目标DNA序列的扩增。
最后，通过荧光检测仪器获取荧光信号，并进行数据分析和结果判读。
量子点荧光技术
量子点荧光技术
量子点荧光技术是一种基于量子点的荧光材料的应用技术。
量子点是一种纳米级尺寸的半导体材料，具有独特的光学性质。
在特定尺寸范围内，量子点的能级结构会发生改变，使得量子点能够发射出特定颜色的光。
量子点荧光技术利用这种特性，将量子点作为荧光标记物应用于生物医学、光电子学、显示技术等领域。
相比传统的荧光标记物，量子点具有更窄的发射光谱、较高的荧光量子产率和较长的发光寿命。
在生物医学领域，量子点荧光技术可以用于细胞成像、荧光探针、分子诊断等应用。
由于量子点的独特性能，可以实现更精确的细胞定位和标记，提高对生物样本的检测和诊断能力。
在光电子学领域，量子点荧光技术可以用于制备高效率的量子点LED、量子点显示器等设备。
由于量子点具有可调控的发射光谱，可以实现更广色域、高亮度和低能耗的显示效果。
总的来说，量子点荧光技术是一种具有广泛应用前景的新兴技术，可以在多个领域实现高性能的光学材料应用。
激光诱导荧光技术介绍
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在荧光产生的过程中，激光与物质相互作用的方式决定了荧光
光谱的特征和强度。
通过控制激光的波长、功率密度和照射时间等参数，可以实现
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对荧光光谱的调控。
03 激光诱导荧光技术的应用
生物医学研究
生物标记物检测
药物筛选
利用激光诱导荧光技术检测生物体内 的标记物，如蛋白质、核酸等，有助 于疾病的早期诊断和治疗监测。
物质吸收特定波长的激光 能量后，电子从基态跃迁 至激发态。
电子跃迁回到基态
激发态的电子通过释放能 量回到基态，以荧光的形 式释放能量。
荧光光谱分析
通过对荧光光谱进行分析， 可以了解物质的性质和组 成。
激光与物质的相互作用
01
激光与物质相互作用时，物质吸收激光能量后会产生热能、光 化学反应或电离等效应。
使用激光器产生的激光束照射样品，激发荧 光。
数据处理与分析
对收集到的荧光数据进行处理和分析，提取 相关信息。
数据处理与分析
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数据预处理
对原始数据进行平滑、滤波等处理， 以消除噪声和异常值。
定量分析
根据荧光光谱数据，对样品中的目 标物进行定量分析。
03
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荧光光谱分析
对荧光光谱进行分析，提取特征峰 和相关信息。
土壤污染监测
通过测量土壤中特定成分的荧光光谱，可以监测 土壤污染状况，为土壤修复和治理提供依据。
化学分析应用实例
有机化合物分析
激光诱导荧光技术可以对有机化合物进行高灵敏度和高选择性的 分析，有助于化合物的定性和定量分析。
无机离子分析
通过测量无机离子与荧光探针结合后的荧光光谱，可以实现无机 离子的高灵敏度分析。
利用激光诱导荧光技术对药物进行筛 选，可以快速、准确地评估药物的疗 效和安全性。
荧光成像技术在细胞学研究中的应用
荧光成像技术在细胞学研究中的应用近年来，随着科学技术的不断发展，荧光成像技术在细胞学研究中得到了广泛应用。
荧光成像技术是一种非常有用的技术，它可以用来研究许多细胞学过程，例如细胞分裂、新陈代谢、蛋白质运输等等。
下面将详细介绍荧光成像技术在细胞学研究中的应用。
一、荧光成像技术简介荧光成像技术是一种通过特定的荧光染料来标记特定分子或细胞器，然后观察它们在细胞内的分布和运动情况的技术。
荧光成像技术包括荧光染料、荧光显微镜和图像分析三个部分。
荧光染料可以使需要研究的物质发出荧光信号，荧光显微镜则可以将荧光信号转换成可见光信号，最后图像分析可用于评估荧光信号的强度和分布情况等。
荧光成像技术的应用非常广泛，它不仅可以用于细胞学研究，还可以用于生物医学、药物开发等众多领域。
二、荧光成像技术在细胞分析中的应用细胞分析是一种研究细胞内机制的技术。
通过荧光成像技术，我们可以观察细胞内分子的运动和分布情况，这对于研究细胞的生命周期、分裂以及肿瘤细胞的形成等方面非常有帮助。
1. 细胞内蛋白质的研究通过给蛋白质标记荧光染料，可以观察蛋白质在细胞内的分布和动态变化。
这可以帮助我们研究蛋白质在细胞内位置的变化，以及蛋白质与其他细胞器之间的相互关系。
2. 细胞内RNA的研究RNA是一种关键的生物分子，它在细胞内发挥着重要的作用，如基因表达和蛋白质合成等方面。
通过给RNA标记荧光染料，我们可以观察RNA在细胞内的行为，了解RNA的运动和分布情况，从而更好地理解RNA在细胞中的功能。
3. 细胞内膜的研究膜是细胞中的重要组成部分，它是细胞内分子交换和信号传递的重要场所。
通过给膜标记荧光染料，我们可以观察膜的分布和运动情况，从而更好地了解细胞膜的结构和功能。
三、荧光成像技术在生物医学中的应用荧光成像技术在生物医学和临床医学中也有着广泛的应用。
在生物医学中，我们可以利用荧光成像技术来研究许多生物过程，包括信号通路、代谢、分化等方面。
下面我们介绍一些具体应用。
荧光技术
u
/technical
• 内源性荧光：生物大分子自身含有荧光团， 如蛋白质中含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨 酸，可利用来研究其结构与性质 • 外源性荧光：共价或非共价结合到生物大 分子上的外来荧光发生团
荧光发射团的结构特征
• 1、具有大的共轭双键（π键）结构。绝大 多数荧光物质含有芳香环或者杂环。
• 荧光激发和发射谱、荧光寿命、量子产率、 荧光强度、偏振度、荧光淬灭、荧光能量 转移、stoke’s位移
荧光技术应用案例1:
Probes for Tubulin
Unlabeled and Fluorescent Tubulin
左图:用tubulin在 Oregon Green溶液里聚合,再稀释 之后的显微照相. 右图: 四甲基罗丹明标记的 tubulin在溶液中聚合后照 相 后者可用来直接观察在细 胞周期中的微管动态过程、 有丝分裂纺锤体形态、神 经细胞中微管运输。
British Journal of Pharmacology (1999) 128, 501 ‐510
背景
• 双链RNA能够通过降解同源mRNA来诱导真 核生物基因沉默，这个过程在动物身上叫 RNA interference（RNAi），植物上叫post‐ transcriptional gene silencing (PTGS)。 • Small synthetic 19–27 nucleotide dsRNAs can act as short interfering RNAs (siRNAs) to mediate gene‐specific silencing in mammalian cells
观察到荧光波长比入射光波长长， 证明荧光是一种光致发光现象， 提出荧光这一术语， 描述了荧光淬灭现象等
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L 板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
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/?p=21977首页专题译述会议展览技术方法教学视频热点话题生命百态研究前沿科研综述电子杂志RSS订阅当前位置: 生命奥秘> 技术方法> 文章正文荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用cyq 发表于2010-02-20 14:48 | 来源：| 阅读随着分子生物学、有机化学以及材料科学等学科的进展，最近我们又获得了好几种新型的荧光蛋白标签，这些标签可以用于细胞生物学成像研究。
本文将对荧光标志物在蛋白质研究中的优势及劣势进行一番详细的介绍，文章中将重点介绍如何使用荧光标志物研究活体细胞（而不是固定细胞）中的靶蛋白。
使用该方法可以对靶蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、活性状态等指标进行研究，还将介绍将荧光显微镜与电子显微镜技术相结合的可行性问题。
小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料，即所谓的“量子点（quantum dots）”材料、自发荧光蛋白、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物，而且将这几种材料“混合”起来是一种非常有前途的荧光标志物研究新思路。
我们使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了，而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。
最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接，来研究各种目的蛋白。
不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时，还需要对细胞进行固定和透化操作。
因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。
在最近这10年里，荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。
使用这种荧光蛋白标志物，我们可以研究目的基因的表达情况，蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。
使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统，我们还可以对蛋白质的寿命进行研究，如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术（rapidphotoinactivation）还可以对蛋白质的定位情况进行研究。
与此同时，半导体纳米晶体材料技术也得到了高度的发展，现在，这种新型的材料在亮度和光稳定性方面都要比传统的荧光标志物好得多，只不过现在这种材料的靶向性还不是很好。
本文中我们将对目前荧光标志物及其相关技术的发展进行介绍，同时还将介绍荧光标志物在蛋白质表达、蛋白质活性以及蛋白质功能研究工作中的作用进行介绍。
荧光标志物小分子有机染料小分子有机染料是指分子量小于1KD的小分子物质，这种小分子有机染料可以通过与生物大分子共价连接的方式对其进行标记，我们现在对这种染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性都有了比较详尽的了解。
利用荧光染料的分子策略包括扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。
现在市面上已经有数百种这类荧光染料的商业化产品可供选择，而且还在不断增加之中。
不过由于这类染料对蛋白质缺乏特异性，因此多与抗体联用（图1A~C）。
荧光蛋白第一批用于细胞生物学的荧光蛋白包括藻胆蛋白（phycobiliproteins）和从蓝藻（cyanobacteria）中提取的触角光合色素（photosynthetic antenna pigments）。
这些生物大分子都含有多种胆汁三烯生色基团（bilin chromophores）。
这些生色基团都包裹在一种基质结构中，这样就能将它们的淬灭作用降至最小，因此这些藻胆蛋白的荧光亮度要比小分子荧光染料的亮度高出两个数量级。
不过这些藻胆蛋白的“个头（分子量高达200KD）”也限制了它们在细胞内的扩散，因此，它们也只能与抗体联用，在流式细胞术试验或ELISA试验中用来检测细胞表面的蛋白质分子。
不过如果能将这些藻胆蛋白在细胞中原位表达，那么它们的用途就会大为扩展，但问题在于胆汁三烯生色基团必须依赖脱辅基蛋白（apoproteins）的作用。
不过令人高兴的是，我们已经在这方面取得了一些成绩。
自从科学家从维多利亚发光水母（jellyfish Aequorea victoria）中发现了绿色荧光蛋白（GFP）之后，生物成像领域就发生了革命性的改变。
单独表达绿色荧光蛋白或与其它蛋白融合表达就可以在细胞内发出绿色荧光了，使用这种方法除了需要氧气O2之外，不再需要任何其它的试剂参与，因为生色基团是通过自发环化作用形成的，需要对深埋在直径约2.4纳米至4纳米的β桶（beta barrel）核心里的三个氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-氨基乙酸）进行氧化才能发出荧光。
绿色荧光蛋白只是荧光蛋白大家族中的一员，这些荧光蛋白大部分都来自海洋腔肠动物，因为各自含有共价结构不同以及非共价环境不同的生色基团，所以可以发出不同颜色的荧光。
在实验室中对这些荧光蛋白进行遗传修饰之后可以进一步的丰富它们的特性，比如增加亮度和折叠效率、减少寡聚体形成等。
突变既可以增加荧光蛋白的光稳定性，还可以赋予荧光蛋白光操控性，比如控制荧光发射与否，或者发出哪种荧光。
这种光操控性既可以是可逆的也可以是不可逆的，可以用于监测蛋白的弥散过程、运输过程和老化过程等。
虽然荧光蛋白在生色基团形成的过程中会生成H2O2，但似乎没有产生太多的活性氧簇（ROS），这一点也并不奇怪，因为荧光蛋白在进化过程中都是暴露在阳光下的。
不过我们也可以对荧光蛋白进行改造使其能够形成ROS。
荧光蛋白发出的荧光一般对它们所处的生化环境都不太敏感，但是酸性环境或变性剂的存在可以淬灭荧光。
不过现在我们已经有了经过改造的、能耐受酸性环境或者能对金属离子、卤化物离子和巯基二硫化物氧化还原剂起反应的荧光蛋白。
量子点（QD）量子点是一种无机纳米结晶体，它可以根据其大小发出特定波长的荧光，它具有非常高的消光系数，其消光系数要比小分子荧光基团和荧光蛋白高出10倍至100倍，同时量子点的量子产率也非常好。
典型的量子点都含有一个硒化镉（CdSe）或碲化镉（CdTe）核心，外面包裹一硫化锌（ZnS）外壳（图1C）。
量子点的吸收波长范围覆盖从非常短的波长至略低于其发射波长的广阔范围，因此一束单波长激发光就可以让量子点达到多重发射。
对于生物学研究领域来说最重大的一项突破是研究出了能让量子点溶于水的包被材料，该材料能避免量子点被水淬灭，同时也能让量子点可以与抗体、抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）等分子相连接（图1B）。
不过这种结合了生物大分子的量子点体积过大（直径约10纳米至30纳米），从而阻碍了它通过细胞膜结构，这种量子点也就只能用于经透化处理的细胞，或者只能对胞外蛋白和可以被细胞内吞的蛋白进行研究。
量子点的光稳定性使其能够反复成像，而其大小和电子密度特性又使得它适合用于电镜研究。
在亲水的树枝状高分子聚合物（hydrophilic dendrimers）中形成的金或银纳米点材料也能发出荧光，同时也具有波长可调性。
这种新型材料在细胞生物学领域的应用前景也是不可估量的。
标记蛋白技术免疫标记法表1中列举了几种免疫标记法以及其它标记蛋白的技术。
在用荧光技术检测内源性蛋白质时最常用的方法就是免疫学方法，即先用特异性抗体（一抗）识别靶蛋白，再用标记有小分子有机染料、藻胆蛋白或量子点的二抗显色（图1A至C）。
或者，也可以直接将荧光标志物或者生物素连接在一抗上，然后再用抗生物素蛋白链菌素检测。
当把抗体直接注入细胞时或者为了对多个蛋白进行检测而使用了多种颜色的荧光时采用这种直接将标志物连接在抗体上的方法非常有效。
但是如果没有高质量的抗体时最好就是将荧光标志物与靶蛋白一起融合表达来检测，尽管这种融合蛋白不能算真正意义上的“内源性蛋白”。
对靶蛋白检测的精确程度取决于一抗的特异性，因此还需要用其它的方法进行佐证。
使用免疫荧光标记法的劣势在于前面所述的，该方法只能用于经透化处理的细胞、胞外蛋白和可以被细胞内吞的蛋白，而且这些抗体标志物的多价性（multivalency）还可能会导致靶蛋白形成寡聚体。
在标准的免疫标记法中，荧光标记的复合体通常来说分子量都会超过200KD，这有可能会影响到蛋白间的相互识别过程。
表1 荧光基团在蛋白质检测中的应用++、+/-、-分别表示“应用范围较广”，“在某些领域内有所应用”，“较少应用”遗传标记法将荧光蛋白与靶蛋白融合在一起的遗传标记法最大的优势就是可以对靶蛋白进行精确的标记（图1C和D）。
用转染技术和转基因技术进行荧光标记要比用荧光染料方便得多。
遗传标记法的缺点在于表达的蛋白不是“内源性”蛋白，荧光蛋白的分子大小会带来影响，融合蛋白可能会影响到目的蛋白的功能，以及荧光蛋白的限制性问题等。
因此，又发展出了好几种“混合系统”，在活细胞内或细胞表面将小分子荧光标志物与目的蛋白进行共价连接，或者通过酶的作用进行连接，甚至于可以自动连接。
不过这些技术中的大部分都太新了，还没有得到足够的实用检验。
这些混合系统中最好的系统应该算四半胱氨酸序列（tetracysteine）-biarsenical染料系统。
该系统用一段由12个氨基酸残基组成的肽段对目的蛋白进行修饰，这段短肽内包含有4个半胱氨酸，这些半胱氨酸能够与可以透过细胞膜的biarsenical染料分子相结合，形成FlAsH或ReAsH，发出绿色或红色荧光，这种结合过程是高亲和力的过程，只需要皮摩尔级的分子就足够了（图1C和E）。
同时使用小分子二巯基化合物解毒剂（dithiol antidotes）可以降低靶蛋白与染料之间的亲和力，同时减少毒性反应。
Tetracysteine基序已经经过了好几轮改良以提高它与biarsenical染料之间的亲和力，这样只需使用很低浓度的biarsenical染料就可以达到目的，而且可以降低背景。
这种小分子Tetracysteine基序对目的蛋白的影响要比荧光蛋白小得多，有人用酵母微管蛋白（tubulin）、G蛋白和细菌致病蛋白等已经证实了这一点。
这种tetracysteine-biarsenical系统还具有其它荧光蛋白不具有的优势，比如可以用于亲和纯化（affinity purification）、荧光蛋白辅助的光灭活作用（fluorophore-assisted light inactivation）、检测蛋白质合成过程、进行脉冲追踪标记（pulse-chase labeling）以及电镜下定位等等。
不过，biarsenical染料会造成背景荧光偏高，因此在这一点上（荧光高对比度）相比荧光蛋白并不具备优势，因此还没有用于转基因动物，而且还不能同时对不同的蛋白标记上不同的颜色。
Tetracysteine序列有时也可以提供一个十六烷酰化位点（palmitoylation site），虽然这种修饰作用有时会被已经存在的原位标签（epitope tag）所阻碍。