大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案

大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。

1.实验材料
剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、0.05% 胰蛋白酶、PBS液、
恒温细胞培养箱、倒青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO
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置相差显微镜、细胞板、小鼠抗大鼠OX42单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒和新生SD大鼠等
2.实验步骤
2.1小胶质细胞的混合培养
取新生SD大鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05% 胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO
恒温细胞培养箱( 37
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度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。

2.2小胶质细胞的分离和纯化
细胞培养18 d~20d左右, 在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞培养物中出现细胞分层现象, 即底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的大细胞(星型胶质细胞) , 而上层细胞明显偏小呈类圆形、折光性强, 附着于星型胶质细胞表面生长(小胶质细胞) ; 倒掉培养液, 用0.05%胰酶2~ 3 mL 消化, 边观察边轻轻晃动培养瓶, 等到贴附在星形胶质细胞上的小胶质细胞脱离下来, 将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入10 mL离心管, 立刻用完全培养基终止消化。

离心管配
平,1000 r/ min, 离心5 min, 弃上清; 加定量完全培养再次吹打成细胞悬液, 接种于预先置有盖玻片的12孔培养板, 置于CO
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恒温细胞培养箱(37度) 培养;生长24h后吸掉培养液, 以去除未贴壁的少突胶质细胞, 加完全培养液继续培养。

2.3小胶质细胞的免疫细胞化学染色鉴定
由于小胶质细胞缺乏特异性的标志物, 故本实验建议选择OX42作为小胶质细胞的标志物, 能同时反映小胶质细胞的激活状态, 小胶质细胞的免疫细胞化学染色鉴定方法采用SABC法。

具体步骤:
(1)待小胶质细胞长成片后, 取出盖玻片, 依次用PBS液清洗3次,每次5 min, 冰丙酮固定15 min, 干燥5 min, PBS漂洗3 次;
(2)0.25% Triton-100室温穿孔20 min, PBS漂洗3 次;
(3)3%H
2O
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室温氧化10 min, 以消除内过氧化物酶活性, PBS漂洗3 次;
(4)滴加A液, 37度孵育10~15 min, 倾去, 勿洗;
(5)滴加OX42单克隆抗体( 稀释度1：100) , 4度过夜, PBS漂洗3次;
(6)滴加B液, 37度30 min, PBS 漂洗3次;
(7)滴加C液, 37度孵育10~15 min, PBS漂洗3 次;
(8)DAB 显色, 复染、脱水, 树脂封片, 镜下观察。

注：SP试剂盒内容：
无色试剂：内源性过氧化物酶阻断剂
试剂A：封闭用正常山羊或兔血清工作液试剂
试剂B：生物素标记二抗工作液，生物素标记羊抗兔IgG试剂
试剂C：辣根酶标记链酶卵白素工作液
注意事项
1、选材注意选取新生大鼠（24h内）。

取材过程尽可能保证无菌，尽量剔除脑膜及血管和海马部分。

2、注意尽可能消除脑组织表面的残血，避免血细胞及某些血清成分对胶质细胞贴壁的影响。

3、胶质细胞分离损伤严重影响胶质细胞的生长，因此应严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。

4、严格控制胶质细胞培养条件。

包括细胞培养用液（培养基，生长因子，血清，抗生素）的质量，浓度。

5、关于培养瓶包被与否，有文献研究显示包被与未包被之间没有特别大的差异。

实验中，可以酌情考虑是否包被。

6、传代培养细胞接种量为1×106个（25 cm2培养瓶），细胞倍增时间为36小时。

细胞传代培养最佳为5-8代，传代次数增加，细胞体积增大，细胞之间间隙增加，细胞贴壁牢固，传代消化时间会有所延长。