小鼠脾脏细胞原代培养

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数

实验背景：

一、细胞培养的基本条件：

1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素

2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清

3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器

4.细胞保存条件：液氮罐

1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。

3.CO2培养箱：

CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。

使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：

①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。

②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ℃，14 h)。

③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液

蒸发。

三、细胞培养用液的配制：

1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水

2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液

PBS：NaCl 8.0 g

KCl 0.2 g

Na2HPO4.H2O 1.56 g

KH2PO4 0.20

加水至1000 ml

3.消化液：

①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。

②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。

③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是

0.25％。用滤器过滤除菌。

④胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。

⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用

4.培养基：

培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。

①天然培养基：

天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。

优点：营养成分丰富，培养效果好

缺点：来源受限，成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污

染。

②合成培养基：

合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。

合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。

优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。

缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。

③人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。

血清中含有：

A多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）；

B多种金属离子；

C激素；

D促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；

E各种生长因子；

F转移蛋白；

G不明成分。

④一般说来，含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加10％血清．

对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。

在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。

无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。

1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。

无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。

向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。

无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清。

血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。

优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。

血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃，30 分钟

血清的消毒：过滤除菌

⑤抗菌素的使用：

在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定。

⑥完全培养基的组成：

基础培养基80％一95％

血清5％一20％

碳酸氢钠 2.0 g/L

青、链霉素各100单位／毫升

培养基的配制：

RPMI-1640培养粉1袋

碳酸氢钠 2.0 g

青、链霉素各100单位／毫升

加三蒸水至1000ml, 过滤除菌；

调节pH值至7.2；

加血清（终浓度10％）。

主要培养基:

MEM：低限量Eagle培养基

DMEM：Dulbecco’s Modified Eagle Medium，贴壁细胞

IMDM：Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium，密度低、生长困难细胞，杂交瘤细胞

RPMI1640：Moor等研制成功，悬浮、肿瘤、原代、传代等细胞

199、109培养基：Morgan研制成功

Mccoy’s 5A：原代培养、难以培养的细胞

四、培养用品的清洗和消毒灭菌：

1.清洗:

①玻璃器皿：

一般用毛刷和洗涤剂进行清洗，以去除器皿的杂质。要注意两点：一是洗刷时不宜用力过猛，二是不能留有死角，特别要注意瓶角度等部位的洗涤。洗刷后用蒸馏水冲洗三次，去离子水冲洗一次。晾干

②胶塞盖子等杂物:

细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟，晾干备用。

③塑料制品的清洗:

塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。必要时用2% NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。

2.泡酸泡碱

①玻璃器皿:

玻璃器皿一般用由浓硫酸，重铬酸钾及蒸馏水配制而成的清洁液浸泡。清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。泡酸时应将器皿轻轻放入，避免灼伤；还应是器皿内全部充满清洁液不留气泡；一般浸泡过夜。

②胶塞盖子等:

清洗后将用品放入1mo/LNaOH中浸泡6-7h。

3.物理消毒灭菌法：

①热力消毒灭菌法：利用热力作用破坏微生物的蛋白质、核酸、细胞壁、细胞膜，导致其死亡，可分为干热法和湿热法。

A燃烧法：属于干热法，是一种简单、迅速、彻底的灭菌方法。

用途：a无保留价值的污染物品。

b金属器械及搪瓷类物品急用，或无条件消毒时，锐利刀剪除外，以免锋刃变钝。

方法：a金属器械可在火焰上烧20秒。

b搪瓷类容器可倒入少量95%乙醇。

B干烤法：利用特制的烤箱，热力通过空气对流和介质传导进行灭菌，效果可靠。

C煮沸消毒法：属于湿热法，用于耐湿、耐高温的搪瓷、金属、玻璃，橡胶类物品，不能用于外科手术器械的灭菌。从水煮开始计时，5-10分钟可杀灭繁殖体，15分钟可将多数细菌芽胞杀灭，如破伤风杆菌芽胞需煮60分钟才可杀灭，在水中加入碳酸氢钠，配成浓度为1%-2%的溶液时，沸点可达105度，即可增强杀菌作用，又可去除防锈。

注意：a物品需全部侵入在水中，物品盖子打开，轴节打开，空腔导管预先灌水，各种大小及形状相同的容器不能重叠。

b玻璃类物品需用纱布包裹，并在冷水或温水中放入。

c橡胶类物品需用纱布包好，水沸后放入。

d如中途加入其它物品，需等再次水沸后开始计时。

e高原地区气压低，沸点低，需适当延长煮沸时间，一般海拔每增高300m，煮沸时间延长2分钟。

D压力蒸汽灭菌法：属于湿热法，是一种临床上应用最广泛，效果最为可靠的首选灭菌方法

②光照消毒法（又称辐射消毒）主要是通过紫外线的杀菌作用，使菌体蛋白发生光解、变性，导致细菌死亡。

A日光暴晒法：利用日光的热、干燥、紫外线的作用来杀菌，将床垫、毛毯、书籍、衣服等放在阳光下直射，暴晒6小时可达到消毒效果，中间要定时翻动。

B紫外线灯管消毒法：紫外线属于电磁波辐射，常用于空气、物品表面的消毒，杀菌最强的波长范围250-270nm从灯亮5-7分钟开始计时。

注意：a空气消毒：有效距离不超过2m，照射时间20-30分钟。

b物品消毒：有效距离不超过25-60cm，照射时间20-30分钟。

③注意事项：

A保持室内清洁、干燥，室内温度20-40度，相对湿度40%-60%时，紫外线消毒最为宜。

B保持紫外线灯管清洁，一般每2周用无水乙醇擦拭1次，发现有污洉应随时擦拭。

C保护眼睛和皮肤：紫外线对眼睛和皮肤有刺激作用，易引起眼炎、皮炎且臭氧对人体不利，因此一般不在有人的环境中使用，必须使用时应带防护镜，穿防护衣，或用被单遮盖肢体。

D紫外线穿透力较差，消毒时物品应摊开或挂起，且定时翻动及保证各表面均受到直接照射，如需再次开启，应间隔3-4分钟。

E定期检测紫外线灯管照射强度，一般每隔3-6个月1次，或建立登记卡，使用时间超过1000小时应予以更换。

F定期做空气培养检测消毒效果。

④臭氧灭菌消毒法：利用臭氧强大的氧化作用进行杀菌。

A用途：主要用于空气、医院污水、诊疗用水、物品表面的消毒。

B方法:使用时应关闭门窗，人员离开房间，消毒结束后30分钟方可进入。

⑤电离辐射灭菌法(又称冷灭菌)适用于不耐热的物品消毒，如橡胶、塑料、高分子聚合物(一次性注射器、输液输血器等)、紧密医疗仪器、生物医学制品、节育用具及金属等。

⑥微波消毒灭菌法微波可杀灭细菌繁殖体、真菌、病毒、细菌芽胞、真菌孢子等各种微生

物。常用于食品、餐具的处理，化验单据、票证的消毒，医疗药品、耐热非金属材料及器械的消毒灭菌。不能用于金属物品的消毒。

4.化学消毒灭菌法：

化学消毒灭菌法是利用液体或气体的化学药物渗透到菌体内，使菌体蛋白凝固变性，细菌酶失去活性，导致微生物代谢障碍而死亡，或破坏细胞膜结构，改变其通透性，导致细胞膜破裂、溶解，以达到消毒灭菌的目的。

①化学消毒剂的使用原则

A待消毒的物品的物品须先洗净、擦干

B根据不同物品的性能及各种微生物的特性，选择恰当的消毒剂。

C严格掌握消毒剂的有效浓度、使用方法及消毒时间

D消毒液中一般不放置纱布、棉花等物，以免因吸附消毒剂而降低消毒效力。

E消毒物品应全部侵没在消毒液内，器械的轴节应打开，套盖应掀开，管腔挂满消毒液。

F浸泡消毒后的物品使用前应先用无菌生理盐水冲洗，气体消毒后的物品使用前应待气体散发后，以免残留消毒剂刺激组织。

G消毒剂应定期检测，调整浓度，进行更换，易挥发的要加盖。

②化学消毒剂的使用方法

A浸泡法：常用于耐湿、不耐热的物品，如锐利器械、精密器材等的消毒

B擦拭法：常用于桌椅、墙壁、地面等的消毒。

C喷雾法：常用于桌椅、墙壁、地面等物品表面的消毒。

D熏蒸法：常用于空气和不耐湿、不耐高温物品的消毒。

③空气消毒：常用的消毒剂有2%过氧乙酸、纯乳酸、食醋

④物品消毒：常用于甲醛消毒箱进行。

⑤环氧乙烷气体密闭消毒灭菌法：穿透力强，是高效广谱杀菌作用，为灭菌剂

⑥常用的化学消毒剂

A高效类消毒剂能杀灭芽胞

a碘酊：2%碘酊，不能用于粘膜的消毒

b过氧乙酸：使用方法有浸泡法、喷雾法、熏蒸法。0.2%溶液用于手的消毒，浸泡2分钟，5%溶液用于餐具消毒，浸泡30-60分钟；1%-2%溶液用于室内空气消毒；1%溶液由于体表消毒，浸泡30分钟。使用中须注意：现用现配；高浓度有腐蚀性、刺激性；放阴凉处，以免爆炸。c2%戊二醛：用于浸泡器械及内镜等，消毒30-60分钟，灭菌要10h。

d含氯消毒剂有漂白粉。

B中效类消毒剂杀灭杀菌繁殖体、病毒，不能杀灭芽胞

a乙醇：70%乙醇用于皮肤消毒、浸泡器械。不能用于粘膜及创面消毒。

b碘伏：5%碘伏用于皮肤粘膜消毒。

C低效消毒剂不能杀灭芽胞和部分细菌、病毒（如苯扎溴铵）

五、细胞培养技术：

1.复苏：

①把冻存管从液氮中取出来，立即投入42℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后(大概1-2分钟) 。

②把上述细胞悬液吸到恶评EP管或离心管中，1200转离心5分钟。

③把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞完全悬浮。吸到装有培养基的10cm培养皿或培养瓶中前后左右轻轻摇动，使细胞均匀分布。

④标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。

⑤2或3天换一次培养基。

2.传代

①培养皿中的细胞生长率达到80%-90%时要传代。

②把原来的培养基吸掉，加PBS冲洗1到2次，弃掉PBS。

③加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行)，消化1-3分钟。

④待细胞都变圆后加如入含血清的培养基终止消化。

⑤用移液枪吹打细胞，把细胞完全都悬浮起来。

⑥把细胞吸到EP管或离心管中，1200转离心5分钟。

⑦倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞完全都吹起来。

⑧根据细胞种类把细胞传到几个培养皿或培养瓶中。

3.冻存

细胞处理同二步骤中的前6步。第七步用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到冻存管中，写明细胞种类，冻存日期。4℃10min，-20℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。或直接放冻存盒中，再放到-80冰箱。

冻存液的配制：FBS：完全培养基：DMSO=5：4：1

六、补充：

原代细胞的培养法：

①组织培养法：

组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。其方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。

培养方法如下：

A按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。B将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培养瓶（底面积为17.5cm2）可接种20~30小块为宜，小块放置后，轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在37℃温箱内。培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。

②消化培养法：

该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。

某些特殊类型细胞，如内皮细胞、骨细胞等的消化手段和步骤，将在有关章节中叙述。

③悬浮细胞培养法：

对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。

④器官培养：

器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系、并能存活，器官培养的目的和技术均与单

层细胞培养不同，但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察。并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。体外器官培养为临床上的器官移植创造了便利的条件。器官培养的条件与细胞培养不同，要有特殊的要求。

A器官培养的特殊的要求

需要特殊的培养条件因器官离体培养，其营养和氧气仅靠自然渗透来供给，因此，培养时为了确保中心不发生缺乏氧和营养而造成坏死，其厚度或直径不宜超过1mm.器官内部细胞需要有足够的氧气渗入常采用以下两种方法：

a将器官组织块置于培养基气液面以利于气体交换。

b提高培养基中的氧分压，一般需加注纯氧，提高氧分压时仍需保持5% CO2,以维持pH.

器官培养的方法

a将不锈钢网做成的支架，放置于培养皿中，高度为1/2皿高，使其表面铺上0.5mm孔径的滤膜。

b将培养基加入平皿中，使培养液刚刚接触到滤膜，但不要使滤膜浮起。

c将要培养的器官组织平放在滤膜上，一般厚度不要超过200μm,水平面积不超过10mm2,如为肝、肾不能大于1mm2.

d将培养物置于CO2培养箱内，并加注氧气，调整氧分压达90%,培养时注意使液面与膜保持在一致的水平上。

e上述器官培养1~3周（每隔2~3天换液一次）后可用于实验和检测。

七、国内外细胞库：

八、小鼠解剖图：

具体实验

一、实验目的：

1.了解原代培养的基本方法及操作过程。

2.学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制及酸碱度的调节。

3.初步掌握无菌操作方法。

4.学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。

二、实验原理：

1.细胞培养是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。

2.细胞培养的突出优点：

①便于研究各种理化因素对细胞生长发育和分化等的影响。

②细胞培养便于人们对细胞内部结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育过程的观察。

因而是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，但是不可忽略它脱离了生物机体的一些变化。

3.细胞培养分为原代培养和传代培养：

原代培养是指直接从动物体内获得的细胞组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养的条件下，使其不断地生长及繁殖。

4.要细胞能在体外长期生长，必须满足基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。

5.台盘蓝氧化与还原型颜色不同，活细胞由于新陈代谢产生较强还原力，染色后呈无色，死细胞染色后呈蓝色。细胞计数以显微镜计数法进行，即将少量待测样品悬浊液置于特定的具有确定容积的载玻片上（计菌器），于显微镜下直接观察计数。

细胞浓度（个/ml）=4个中等方格内的细胞总数÷4×10000×稀释倍数。

三、实验用品：

1.器材：

彻底清洗、消毒、烤干、包装好的：（解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管）倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板

2.试剂：

PBS缓冲溶液、培养液、台盘蓝

3.用品：

小白鼠

四、实验方法：

1. 细胞的原代培养

①断头法处死小鼠，将血放掉洗净，在酒精中浸泡3min消毒。

②在超净工作台无菌操作，将小鼠背朝下放在解剖板上，用镊子提起腹部皮肤，剪开。沿开口向两侧斜着剪开，翻起皮肤露出腹腔，即可看到白色的胃。提起胃，找到后面条状的脾，用弯头镊子取出脾，将周围的脂肪组织去除。PBS缓冲液清洗1-2次待用。

③在无菌培养皿内加入PBS缓冲液30滴，用L型针头吸取PBS0.2mL注入小鼠脾脏，用针头在脾脏上戳几个小孔，顺脾脏轻轻刮，从小孔挤出分散的细胞。

④将培养皿倾斜，使大块组织充分沉淀，吸取分散的细胞悬液2mL，1000r/min离心5min。

⑤取塑料培养皿一个，用“枪（1mL）”加入细胞培养液2mL，在盖上加标记后待用。用“枪（200μL）”吸取塑料皿中的培养液400μL，加入离心后并弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹散并混匀细胞，然后吸取200μL接种于上述塑料培养皿中，混匀，放入37℃，5%CO2培养箱中培养。

2.原代细胞观察、死活鉴定及计数

①取出培养物，观察培养液的颜色。然后将培养皿置于倒置相差显微镜观察细胞生长状况。

②取0.5mL细胞悬浊液于试管中，加1-2滴台盘蓝染液混合均匀，染色2min。

③将细胞悬液滴在计数器两边V字形槽内。细胞悬液依毛细作用扩散到计数区。在镜下计数。取中间和四个角上的中等方格，计数每个方格内死活细胞的数量。（注意：当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数大方格的上方和右方线上的细胞。）先计数总细胞，再计数死细胞（蓝色）。计算细胞死亡率。

五、实验结果：

1.细胞原代培养形态观察

原代培养后的培养皿呈粉红色，未出现异味，未被污染。在倒置相差显微镜下观察可看到聚集生长的细胞，形态不明显。计数时观察到游离的活细胞膜完整，形态多为近圆形，细胞质均匀。

活细胞浓度（个/mL）=（37+36+38+46) /4*10000*5=1.9625*106

活细胞浓度（个/mL）=（45+42+47+61）/4*10000*5=2.4375*106

活细胞率=活细胞浓度/活细胞浓度*100%=80.5128%

六、分析与总结：

1.取小鼠脾时注意保持其完整，注入缓冲液要慢而准且适量，不要撑破脾脏，保证细胞分散游离出来。

2.培养液PH为7.0~7.4，其中加有酚酞，正常状况细胞生长过程代谢物使PH下降，培养液的颜色改变呈黄色，因此可通过培养液颜色变化初步判断细胞生长状况。

3.生长状况良好的细胞膜和核完整，细胞质透明，而细胞质出现较多颗粒状或空泡证明细胞衰老。除游离期和衰退期外细胞一般贴壁生长。游离期细胞一般圆形，折光率高，而衰退期细胞皱缩，透明度下降，立体感很差，较易区分。

4.倒置显微镜将物镜与载物台间的空间解放，可以允许连同培养皿一同观察。

七、抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法：

①以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物

端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用，端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶，由RNA和蛋白质组成，可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性。因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点。

②应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物

快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的应用非常广泛的体外药物敏感性测定方法，其原理为采用一些特殊的荧光染料，对细胞的特定成份进行染色或标记。或通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料，通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。现在普遍采用一种特殊的荧光染FDAL1u(Fluoreseein diacetate)，在正常情况下它不具有荧光，但当它加人到具有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时，由于细胞分泌的水解酶的作用，FDA水解释放出具有强烈荧光的荧光素。死亡的细胞由于其机能已受到抑制或破坏，FDA水解水平大大降低，这样通过测定培养液中荧光的强度，就能测定活细胞的数量，从而测定出药物对细胞的作用，推测其抗肿瘤的效果。

③应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物

结晶紫染色测定法是由Gillies等于1986年提出来的一种单层细胞培养的体外药物敏感性测定方法。其原理是结晶紫染色可通过细胞的特定摄生法而选择性地被细胞核吸收，死亡的细胞几乎不吸收结晶紫染料。而被核(DNA)吸收的结晶紫又可为有机溶媒提取，通过测定提取液的光密度值(OD)，就可测定活细胞的数量。近几年经过不断改进，结晶紫染色法已能适用于大量抗肿瘤药物的药敏测定，具有灵敏度高、重现性好的特点。

④应用噬菌体筛选抗肿瘤药物

已确证多种病毒能引起动物肿瘤，噬菌体是细菌的病毒，与肿瘤病毒相似，噬菌体的DNA也可整合到细菌染色体上，随细菌DNA复制分裂并传至子代细菌，不引起细菌裂解但可引起细菌部分生物学性状发生改变¨。有些物质可使前噬菌体DNA从溶原性细菌染色体上脱落，复制合成并释放出完整的噬菌体，致使敏感的细菌感染裂解，这种作用称为诱导作用。有些有诱导作用的物质常同时具有抗肿瘤作用，因此在研究肿瘤病毒一肿瘤细胞间关系时，常与溶原性噬菌体一溶原性细菌模型相比拟，同时启发人们用“诱导噬菌体作用”筛选抗肿瘤药物，并且已经取得一定成效。

⑤细胞水平和动物水平相结合筛选具有抗肿瘤作用的中药

我国的传统医药在肿瘤的治疗方面有其独特的理论，天然中药以其疗效广泛、确切、毒性低受到国内外的广泛关注。近年来，从中药中提取抗肿瘤有效成份日益得到人们的重视，因此确立一套筛选抗肿瘤中药有效成份的方法也就越来越有必要了。经过长时间的摸索，除以上所述的几种方法外，对具有抗肿瘤作用中药的筛选己形成了一套具有自身特点的方法，现在一般采取的方法是选取几种肿瘤细胞系，以培养细胞为实验模型，用MTT实验、软琼脂等方法，在细胞水平检测中药提取物或单体的体外抗肿瘤作用，筛选出能够以较低浓度抑制肿瘤细胞生长或增殖的药物。在此基础上，以荷瘤小鼠为实验模型，在动物水平检测其在体抑瘤作用。

八、诱导肿瘤细胞增殖的药物筛选方法：

对照试验，哪个药物能诱导就是。