复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
脾脏单个核细胞的制备
脾脏单个核细胞的制备脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RPMI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白;收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 10 / 300 µl 的浓度。
《流式细胞术检测小鼠脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》单细胞悬液的制备：将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。
加入2 mL RPM I- 1640完全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10%小牛血清的RPM I- 1640 培养液。
台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至5×10 cells /L。
《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》610制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取:手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。
沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。
粗剪成小块, 用注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】A.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。
但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。
因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。
细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。
实验四脾淋巴细胞分离 邵(1)
活细胞 死细胞
自动化细胞计数器Luna™ 韩国Logos Biosystems公司
一块计数板/2组
在5×104 – 1×107 细胞/ml的浓度范围 3-60 µm的细胞直径范围内
注意事项
1. 通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细胞 作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。
阴性实验结果的原因分析？
个性问题 抗原和抗体反放是否会出现结果？
判断抗原的阳性程度？
弧形沉淀及沉淀倾斜的原因分析？
（四）计算细胞活力
1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2% 苔盼兰溶液并混匀；
2. 显微镜下观察：
如果细胞被染成蓝色，旋转显 微镜微调节钮，细胞无反光， 则为死细胞；而细胞不被染色， 晶莹透亮，旋转显微镜调节钮， 细胞明显反光而且有立体感， 为活细胞；
3. 计算细胞活力：计数100个 细胞中活细胞的百分率，一般 活力应在95%以上。
2. 在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他 细胞。
预实验结果
Control
50ul PBS+ 0.5ul Ab
50ul PBS+ 2ul Ab
APC-CD3 T cells
PE-CD19 B cells 分析数据时建议只放一组实验组，各人可自行安排
实验二报告分析
共性问题： 不能结合本组实验进行结果分析
MACS
➢ 磁性微珠是20世纪80年代初以高 分子材料和金属离子（如Fe3O4） 为原料聚合而成的一种以金属离 子为核心、外层均匀地包裹高分 子聚合体的固相微粒。
➢ 以磁性微珠为载体，包被上针对 某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形 式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质 为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光 激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter, FACS）,是分离和鉴 定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过解刨小鼠，提取脾细胞，以便进行后续的免疫学研究。
二、实验材料和仪器
1. 实验材料：小白鼠、生理盐水、70%乙醇、福尔马林、石蜡等。
2. 实验仪器：手术刀、注射器、组织培养皿、显微镜等。
三、实验步骤
1. 解剖小白鼠：将小白鼠放入无菌条件下，用70%乙醇消毒表面。
然后用手术刀在胸部进行切口，打开胸腔，找到心脏，将心脏割断。
接
着将小白鼠向上抬起头部，用手术刀在颈部进行切口，打开颈部皮肤
和肌肉层，在颈动脉两侧夹住气管和食管，并清除周围组织。
最后将
气管和食管割断，并将颈动脉及其分支全部割断。
2. 取出脾脏：用注射器注入生理盐水，将脾脏从周围组织中分离出来，然后将脾脏放入组织培养皿中加入生理盐水洗涤。
3. 细胞处理：将清洗干净的脾脏放入福尔马林中固定30分钟，再用酒精和石蜡等物质进行包埋。
最后用显微镜观察并提取细胞。
四、实验结果
通过本实验，成功地解剖出小白鼠，并提取了脾细胞。
经过显微镜观察，我们可以看到细胞形态正常，并且数量充足。
五、实验注意事项
1. 实验操作要求严格无菌。
2. 解剖小白鼠时要保持手术刀的锋利度。
3. 在取出脾脏时要注意不要损伤其结构。
4. 细胞处理过程中要避免污染。
六、实验结论
通过本实验，我们成功地解剖了小白鼠并提取了脾细胞。
这为后续的免疫学研究奠定了基础。
同时，在操作过程中也需要注意无菌和仪器使用等方面的细节。
最新94 小鼠脾脏胸腺单个核细胞分离ppt课件
• 烂鳃病病原菌平板划线分离： 取病鱼鳃丝一小块，置于滴有无菌水的载玻片
的边缘，10分钟，用接种环蘸水，在胰胨琼脂培养 基上划线。 • 肠炎病病原菌划线分离：
用70%酒精棉球擦拭鱼体，无菌条件下，取病 鱼的肝或脾或肾或心于普通营养琼脂基划线分离。 • 赤皮病病原菌划线分离：
用刀片刮除病灶腐烂部分后用接种环挂取病料， 在普通营养琼脂培养基上平板划线。28℃培养24h。
度法 4. 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 5. 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感
4
T细胞表面标志及其亚群
➢ CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞 （help T cell,Th）
➢ CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）
2. 在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他细胞。
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细菌分离与鉴定方法 —嗜水气单胞菌分离鉴定
分离方法 细菌的生长状况观察 氧化酶试验 AHM鉴别培养 吲哚试验 革兰氏染色法 糖发酵试验 脱脂奶平板试验（酪蛋白胨化试验）
分离方法
用途:
• 在检查含两种或两种以上的待检材料（如肝、脾、肾、 心、肌肉等）中的某种细菌时，须先将待检材料进行 分离培养。常用的分离培养方法是琼脂平皿分区划线 法，是借划线将混杂的细菌在琼脂平皿表面分散开来， 使个别的细菌能固定在某一点，经培养生长繁殖后形 成单个菌落，以达到分离获得纯种细菌的目的。
普通琼脂平板
牛肉膏
3.0g
蛋白胨
10.0g
氯化氯化钠（NaCL）
5.0g
磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.0g
琼脂
15.0g
小鼠脾细胞的制备实验报告
小鼠脾细胞的制备实验报告一、实验目的本实验旨在掌握从小鼠体内分离和制备脾细胞的方法，为后续的免疫学实验和细胞生物学研究提供材料。
二、实验原理脾脏是机体重要的免疫器官，富含各类免疫细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞等。
通过机械破碎和细胞筛过滤的方法，可以将脾组织分散成单细胞悬液，再经过离心、洗涤等步骤，去除杂质和红细胞，从而获得较为纯净的脾细胞。
三、实验材料与设备1、实验动物：健康成年小鼠2、主要试剂：无菌 PBS 缓冲液、红细胞裂解液、胎牛血清、培养基3、实验器材：手术器械（剪刀、镊子）、无菌培养皿、细胞筛、离心机、移液器、显微镜等四、实验步骤1、小鼠的处理提前将小鼠禁食不禁水 12 小时。
采用颈椎脱臼法处死小鼠，将其仰卧固定在解剖板上。
用 75%的酒精消毒小鼠腹部皮肤。
2、脾脏的获取在无菌条件下，沿腹部中线剪开皮肤和腹膜，暴露腹腔。
小心地分离出脾脏，避免损伤周围组织和血管。
将脾脏放入盛有少量无菌 PBS 缓冲液的培养皿中。
3、脾细胞的制备用镊子和剪刀将脾脏剪成小块，置于细胞筛上。
用注射器活塞轻轻研磨脾脏组织，使细胞通过筛网进入下方的离心管中。
加入适量 PBS 缓冲液冲洗细胞筛，收集全部细胞悬液。
4、离心和洗涤将细胞悬液离心（1500rpm，5 分钟），弃上清。
加入红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温静置 5 分钟，以裂解红细胞。
再次离心（1500rpm，5 分钟），弃上清。
用 PBS 缓冲液洗涤细胞 2-3 次，每次离心后弃上清。
5、细胞计数和培养用适量含血清的培养基重悬细胞。
取少量细胞悬液，加入台盼蓝染液，在显微镜下计数活细胞数量。
根据实验需要，将细胞调整至合适的浓度，接种于培养板或培养瓶中，置于培养箱中培养。
五、实验结果1、细胞形态观察在显微镜下观察制备的脾细胞，可见多数细胞呈圆形，大小不一，有细胞核。
细胞形态完整，无明显的破碎和损伤。
2、细胞计数结果经台盼蓝染色后，计数活细胞比例，通常应在 90%以上。
4 脾脏单个核细胞分离及流式细胞术染色(1)(1)
• 3．急性大失血法：用粗针头一次采取大量心脏血液，可使动物致死。 • 4．吸入麻醉致死法：应用乙醚吸入麻醉的方法处死。大、小鼠在20～30秒
3.清洗：加500ulPBS,吹打混匀后， 5000rpm， 4℃，5min
4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul PBS吹打混匀，置于冰上， 流式细胞仪检测
CD3： T cell CD4+ T cell； CD8+ T cell
补充知识
通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细 胞作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。
在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他 细胞。
计数完毕后请立即清洗细胞计数板！
思考题
1.实验过程中注意问题有哪些？
实验小鼠处死方法
• 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
实验四
小鼠脾脏单个核细胞分离及 流式细胞术染色
钱国军 邹本坤 2016-03-31
解剖图
小鼠脾脏位于上腹部左后侧， 体积较大，长条形，属于外 周免疫器官。外周血中淋巴 细胞可经再循环驻入脾脏等 外周免疫器官的特定区域， 所以富含各类免疫细胞。
实验原理
细胞计数
3mm
W1
W2
W3
脾细胞提取实验报告
一、实验目的1. 学习掌握脾细胞提取的基本原理和方法。
2. 熟悉无菌操作流程，提高实验操作技能。
3. 了解脾细胞在免疫学研究中的应用。
二、实验原理脾脏是人体重要的免疫器官，其中含有丰富的免疫细胞，如B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞等。
脾细胞提取实验旨在从脾脏中获取这些免疫细胞，为后续的免疫学研究和实验提供材料。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：成年小鼠、胰蛋白酶、Hanks平衡盐溶液（HBSS）、FBS、离心管、吸管、解剖显微镜、手术刀、镊子、剪刀、无菌操作台等。
2. 实验仪器：细胞培养箱、低温离心机、细胞计数仪、显微镜等。
四、实验步骤1. 小鼠麻醉与解剖- 将小鼠置于解剖显微镜下，用麻醉剂将其麻醉。
- 小心切开小鼠腹部皮肤，暴露脾脏。
- 使用手术刀将脾脏从体内取出。
2. 脾细胞制备- 将脾脏置于Hanks平衡盐溶液中，轻轻漂洗去除杂质。
- 使用剪刀将脾脏剪成小块，放入装有胰蛋白酶的离心管中。
- 将离心管置于37℃水浴中消化10-15分钟，期间轻轻摇动。
- 停止消化后，用吸管将消化后的脾细胞悬液转移至新的离心管中。
- 1000g离心5分钟，弃去上清液。
- 加入适量的FBS，重悬细胞，制成脾细胞悬液。
3. 细胞计数与纯度鉴定- 使用细胞计数仪对脾细胞悬液进行计数，计算细胞总数。
- 取少量脾细胞悬液，进行染色（如台盼蓝染色），在显微镜下观察细胞活力和纯度。
4. 细胞培养- 将脾细胞悬液接种于细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养。
- 定期观察细胞生长情况，记录细胞生长曲线。
五、实验结果1. 脾细胞悬液经离心后，上清液清亮，细胞沉底。
2. 细胞计数仪显示细胞总数为1.5×10^7个。
3. 台盼蓝染色结果显示细胞活力约为90%。
4. 细胞培养过程中，细胞生长良好，呈典型的淋巴细胞形态。
六、实验讨论1. 脾细胞提取实验过程中，无菌操作至关重要，应严格遵循无菌操作规程。
2. 胰蛋白酶消化脾细胞时，消化时间不宜过长，以免损伤细胞。
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小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
实验时间：____________ 实验地点：_____________ 实验人：__________________ 1实验原理
小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各
类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：
1）健康小鼠
2）手术器械（剪刀、镊子）、解剖板
3）70汇醇
4）PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK
5）0.2%台盼蓝
6）细胞计数板、计数器
7）离心机
8）显微镜
3实验方法：
3.1取小鼠脾脏
将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液
将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用
针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min, 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3 计算细胞浓度
稀释十倍，随机选取一个大方格计数
细胞计数为324个，计算细胞浓度为324X 104X 10=3.24 X 107/ml
3.4 计算细胞活力
在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16 个，计算细胞活力为：
324- 16/324 X 100%=95.1%
在理论范围之内
4 实验结果
4.1 研磨脾脏得到细胞悬液
本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。
这些结缔组织在离心后会和细胞绞缠在一起，去除十分麻烦，而且会损失细胞。
应该在离心之前尽早用吸管吹打后小心弃去（这样损失的细胞比较少，造成较小的误差）。
研磨脾脏时的力度、时间、温度都会影响细胞的活性。
所以应置于冰上快速、轻柔地研磨，置于液体中避免干磨。
我们在实验室室温下碾磨，造成细胞破碎较多，影响最终实验结果。
4.2 白细胞计数
在使用血球计数板时，遇到了镜下看不到计数板格子线的问题: 起初，我们小组能够在镜下观察到细胞，但是细胞清晰时无法找到计数板格子线。
后来我们意识到，这可能是因为充池后立即观察，细胞还悬浮在液体中，和方格线不在同一个平面上。
静置2分钟后再调焦观察，只能隐约看到方格线。
在反复调试中发现，减小光圈并降低光源亮度可以增加方格线的清晰度。
另外，一定要注意在充池前对计数板的清洁。
我们小组起初用卫生纸对计数板清洁，在镜下发现残留很多纸纤维，严重影响观察。
改用擦镜纸清理后，就大大减少了杂物对视野的影响。