纸片法抗菌药物敏感实验操作标准
抗菌药物敏感性试
• 在贴条过程中， 90mm 平皿只能贴 2 条，同时不同的试纸条高浓度 的一段应该向背；若贴 2 条含有酶抑制剂的试条应将含有酶抑制剂的 一端贴在同一侧。 • 贴条注意事项：试条事先恢复室温： 10 分钟左右。 • 试条的数量与角度： 4-6 条、 1-2 条。 • 贴条的时间：平皿多余水分已经消失。 • 试条的方向：高浓度端向外。 • 贴条的动作：平稳、流畅、不拖拉。 • 气泡的处理：尽量向一端赶。 • 3.孵育同 K-B 法 • 注意孵育时间、环境温度及酸碱度。 • 读数原则：杀菌剂读清晰的边缘见图 1 ，抑菌剂读大菌落与小菌落的 交界见图 2 。变形杆菌读最小的 MIC 值，后两张为含酶抑制剂抗生 素的测试结果。
抗菌药物敏感性试验规范化 卫生部北京医院 艾效曼
•
学习目标 1 、了解抗菌药物敏感性试验的意义、我国抗菌药物敏感性试验应遵循的规 则。 2 、掌握纸片扩散法和 E 试验原理，牢记试验的操作步骤及各步骤中的注意 事项，在日常工作中进行规范化的操作。
• • • • • •
抗菌药物敏感性试验的意义是什么？我国抗菌药物敏感性试验应遵循哪些规 则？ 一、基本内容 药敏试验的意义： （一） 药敏试验的意义： 1.查出耐药，减少治疗错误，便于医生选择个体化疗方案、节省费用。 2. 进行 耐药监测 ，为医院感染控制部门提供防治依据，为经验用药提供可靠 依据。 3.利用耐药监测结果控制抗菌药物应用，减少耐药菌株的出现，延长新药使 用寿命。 4. 为新药的研究和评估提供有价值的信息。 ）、药物敏感试验规则 （二）、药物敏感试验规则
• • • •
• • • •
目前世界上通用的规则是德国和欧洲标准，而我国主要以临床试验室标准化 委员会（ CLSI ），即美国国家实验室标准委员会 (NCCLS) 的规则为标准， 这个标准主要包括 CLSI 纸片扩散法（ M2 ）和需氧菌稀释法（ M7 ）。 ）、抗菌药物敏感性试验结果参照标准 （三）、抗菌药物敏感性试验结果参照标准 1.标准的正确使用 M100 – 即新表 M100-S17 ，每年更新 1 次；包括 M2 和 M7 文件， M2 – 即 纸片扩散法 (DD) 文件 M2-A9 ， M7 – 即 MIC 文件 M7-A7 。 M2 、 M7 文 件每 3 年更新一次 ；使用文件时应注意文件是否已更新，避免使用旧文件造 成判断结果失误。 2.获得文件的方法 如果购买厂家的纸片可向厂家索取标准，每年国际化会议也会颁发此文件的 中心内容。 表内容： （四）、 CLSIM-100 表内容： CLSIM-100 表主要包括版本中的更新要点、各版本抗菌药物分组、 M2 纸片 扩散法用的表、 M7 MIC 用的表、 M7 MIC 用的表及词汇表等内容。
微生物实验 药物敏感实验
微生物药物敏感实验
⏹一、实验目的
⏹1、熟悉和掌握圆纸片扩散法检测细菌对抗菌药物敏感性的操作程序和结果判断方
法。
⏹2、了解药敏试验在实际生产中的重要意义
二、实验原理
⏹将含有定量抗菌药物的纸片（药敏纸片）贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部
位。
药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，形成了随着离纸片距离加大，琼脂中的药物浓度逐渐减少的梯度浓度。
其纸片周围一定区域琼脂内的药物浓度高于抑制待检菌所需浓度时，则该区域内细胞不能生长，形成透明抑制圈。
抑菌圈的大小可以反映待检对测定药物的敏感程度，抑菌圈愈大，说明该菌对此药物越敏感三、实验器材
⏹1．菌种大肠埃希菌。
⏹2．培养基牛肉膏蛋白胨培养基。
⏹3．试剂无菌生理盐水，抗菌药物纸片：
包括青霉素、氨苄西林、土霉素、链霉素等。
⏹4．其他无菌棉拭子、镊子、毫米尺、接种环。
四、实验方法和步骤
⏹1．菌液制备
菌浓合适，一般为106
⏹2．接种
细菌悬液制备后15min内接种至倒好的牛肉膏蛋白胨培养基平板中，接种量0.1-0.2mL。
涂布均匀。
⏹3．贴药敏纸片
⏹涂布后的平板在室温下干燥3~5min，用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面
并轻压，使纸片与琼脂表面完成接触。
各纸片中心相距应大于24mm，纸片贴上后就不能再移动位置。
⏹4．培养
⏹将平板倒置放入37℃培养箱培养，16~18h读取结果。
五、实验结果
六、思考题
⏹ 1.圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项？
⏹ 2. 试述药敏试验的意义。
K-B 纸片扩散法测定抗生素敏感试验
平板霉素类似物生物活性评价平板霉素对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VREF)等耐药菌具有很好的抑制活性。
抗菌活性的测试主要针对MRSA和VREF进行测定和相比。
最小抑制浓度（MIC）被确定抑制细菌生长的最低浓度。
通过生物活性数据的反馈，进一步指导平板霉素类似物的合成方向，希望获得活性更高、药效活性更好的抗耐药菌抗生素和药物先导化合物。
纸片扩散法测定抗生素敏感试验及MIC：1.原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系,即抑菌圈愈大,MIC愈小。
2.仪器及试剂仪器：纸片、试管、移液枪、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、pH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器、超净工作台试剂：样品溶液、培养基3.菌液的配置从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mL LB肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。
也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。
为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。
因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108CFU/mL。
4.接种平板在超净工作台中，用量筒量取15mL配置好的灭菌培养基，倒在平板中，冷却凝固。
吸取稀释好的菌液500μL于洁净的灭菌试管中，加入4500μL的培养基，冷却到不烫手，摇匀，均匀倾倒置已凝固的平板表面，放置冷却至凝固。
5.粘贴药敏纸片用纸片分配器或无菌镊子取纸片（直径6mm，厚度1mm），贴于平板表面，并用镊子尖轻压一下纸片，使其贴平。
每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm。
纸片扩散法药物敏感试验
纸片扩散法药物敏感试验若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。
而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。
WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。
本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。
无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。
但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分离提纯、鉴定菌种后再做敏感试验。
试验方法：一、试验材料：(一)培养基：Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。
多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基；维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。
此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批次间差异等方面均优于其他培养基。
若检测肺炎链球菌的敏感性时，须在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。
测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和 2.5mg/ml 辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。
制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。
在水平的实验台上倾制。
琼脂厚为4mm，允许误差为土1mm。
琼脂凝固后，应测一下pH。
琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。
若当天不用，用塑料袋密封包装贮藏于冰箱（2-8℃）。
每批平板都应抽样，在30-50℃下培养24h或更长时间检查是否被感染。
MH琼脂培养基配方(1L)：Beef Extract 2.0g Acid Hydrolysis of Casein 17.5gStarch 1.5g Agar 17.0gFinal PH 7.3 at 25℃高压灭菌后立即水浴冷却至45-50℃。
药物敏感性实验
药物敏感性实验●学习内容●药物敏感实验¡ª¡ª纸片法●学习要求●掌握药物敏感实验的原理、方法及注意事项。
●抗菌药物敏感性试验（AST，简称药敏试验）：●用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用。
常用最低抑菌浓度（MIC）表示，即体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度。
通常根据MIC结合常用剂量时体内该药所能达到的血药浓度，划定细菌对各种抗生素敏感或耐药的界限，给出S（敏感）、I（中介）、R（耐药）等定性的结果，方便临床用药。
●检测病原菌对各种抗生素的敏感性，指导临床合理用药。
用于流行病学调查及院内感染的监控，控制和预防耐药菌株的流行。
为经验用药提供参考依据。
●方法：扩散法（纸片法）、稀释法（琼脂稀释法、宏量液体稀释法、微量液体稀释法）●药敏纸片的人工制作●定性滤纸用打孔器打成直径6mm的圆片，每100片放入一小瓶中，160℃干热灭菌1～2小时，或用高压灭菌（6.8kg 30min）后在60℃条件下烘干。
（此应提前做好）●抗菌药物的浓度（指有效药物浓度）青霉素200U/mL 其它抗菌药物1000ug/mL磺胺类药物10mg/mL 中草药制剂1g/mL庆大霉素4万单位/mL，稀释为1000单位/mL。
●（临床上可按照药品使用说明书，如上面标明5g本品可拌50kg饲料，其换算方法为lg本品可拌10kg饲料，也就是1g本品拌l0000g饲料，相当于药品浓度为lg本品加l0000mL蒸馏水。
）●用无菌操作法将欲测的抗菌药物溶液1mL，加入100片纸片中，泡5～10分钟。
●培养皿烘干法：用无菌镊子将浸有抗菌药液的纸片摊平在培养皿中，于37℃的温箱内保持2～3小时即可干燥，或放在无菌室内过夜干燥。
●将制好的各种药物纸片装入无菌小瓶中，置冰箱内保存备用。
●干燥的药敏纸片可保存6个月。
●纸片法●每组约5个平皿（每人1个），每个平皿约20毫升琼脂培养基，即约120mL。
每平皿约5张纸片。
抗菌药物敏感试验实验
无菌试管、刻稀释法
K-B法操作方法
操作注意事项：
菌液应在15分钟内接种完毕 接种后，平板放置时间不要超过5min 注意纸片距离
肉汤稀释法操作方法
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M-H肉汤(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
抗生素(ml) 菌液(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2弃 －
去
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
35℃孵育16~18h，观察结果
实验内容
第二次 1.观察K-B法的结果 2.观察肉汤稀释法的结果
K-B法结果解释
测量抑菌圈直径，参照CLSI的标准解释结果。
20mm
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验结果判断
大肠埃希菌抗菌药物敏感性试验结果判断
实验目的 1.掌握纸片扩散法（K-B法）和肉汤稀释法
的原理、操作方法、结果的判读及其临床 意义。 2.掌握纸片扩散法和肉汤稀释法的质量控制。
实验内容 纸片琼脂扩散法（K-B法） 肉汤稀释法
实验器材
1. 菌种： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 2. 培养基：水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）、MH肉汤 3. 抗菌纸片：青霉素（PEN）、庆大霉素（GEN）、
细菌药敏试验
【试验意义】
2 药敏试验的意义 • 1. 可预测抗菌治疗的效果 • 2. 指导临床选择使用抗生素。 • 3. 提供所选择药物的依据； • 4. 监测耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握
耐药菌感染病的流行病学，控制和预防耐 药菌感染的发生和流行。
【实验材料 】
1.菌种：大肠杆菌肉汤培养物 1 管/组
2.各种药敏片：市售商品药敏片（或自制）1套 （4～5种）/人。
[问题与思考]
• 1.纸片药敏试验操作时应注意哪些事项? • 2.试述纸片扩散法药敏试验的原理及临床
意义。 • 3.纸片药敏试验的步骤及结果判定是什么？
≥18
≤14
15～17
≥18
≤12
13～17
≥18
≤13
13-15
≥18
≤12
13～14
≥15
【注意事项 】
• 影响因素药敏试验结果的因素 1、培养基：培养基质量和pH值。pH过低会导致
氨基糖苷类，大环内酯类失效，而青霉素活 力增强 。 2、药敏纸片的质量，含药量和保存方式 3、接种菌量。 4、试验操作质量：接种细菌后贴片时5～15 分钟； 5、培养时间：不超过24 h 。
细菌药敏试验 （纸片扩散法）
【学习目标】
1.掌握药敏试验的基本原理。 2.掌握药敏试验-纸片法的操作方法及判定。
3.了解药敏试验在实际生产中的指导意义。
【试验原理】
• 1 纸片扩散法原理
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的 琼脂平板上。纸片中所含有的药物吸取琼脂中的水 分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散形成递减的 梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生 长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。 并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关 关系，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
葡萄球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程
葡萄球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程1．目的规范葡萄球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程，确保药敏结果的准确。
2．适用范围本操作规程适用于葡萄球菌属的细菌。
3．选药原则在本规程所列受试抗菌药物主要根据以下因素选择。
3.1现行版本的CLSI M02和M100对葡萄球菌属纸片扩散法药物敏感试验的要求。
3.2本单位处方手册中的抗菌药物名册。
3.3本单位上一年度葡萄球菌属细菌耐药监控数据。
4．质控纸片药敏试验应使用金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠埃希菌ATCC35218（用于β-内酰胺/β-内酰胺抑制剂合剂）进行质量控制，质控菌株可接受的抑菌圈范围参见现行版本的CLSI M100-A19。
5．材料和仪器M-H培养基，无菌生理盐水，药敏纸片，无菌棉签，35℃孵育箱，测量尺。
6．操作步骤根据CLSI M2-A10和M100-S19制定本操作步骤。
6.1菌液制备从孵育了18~24小时的非选择性培养基（如血琼脂）平板上，挑取单个菌落，直接用无菌生理盐水制成悬液作为接种物，将浊度调整至0.5麦氏标准。
应在接种物制备后15分钟内接种M-H琼脂平板。
用无菌棉拭蘸取菌液，在管内壁液面上方旋转紧压，将多余菌液挤去，然后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60°以确保接种菌的均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。
6.2接种好的平板可敞开盖子在室温下干燥3~5分钟（不要超过15分钟），然后用纸片分配器将纸片放入琼脂表面并轻压，使纸片与琼脂表面完全接触。
各纸片中心相距应大于24mm，通常150mm平板至多放置12个纸片，90~100mm平板至多放置6个纸片。
由于某些药物在纸片放入琼脂平板后几乎立即扩散，所以一旦纸片放入后就不能再移动，若要重新放置，可用一个新的纸片放在平板的另一个位置。
6.3应在纸片贴好后15分钟内将平板倒置放入35℃孵箱，若超过15分钟将使纸片中的抗菌药物提早扩散。
非苛养菌的药敏解释性标准是建立在这些菌株在空气中孵育的基础上，一些药物（如氨基糖苷类、大环内酯类和四环素）的抑菌圈直径受CO2的影响有较大的改变，所以本菌属细菌不能孵育在CO2孵箱。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
纸片法抗菌药物敏感实验操作标准4.３标准比浊管用硫酸钡比浊管(０、5麦氏比浊标准),标定接种菌液浓度。
比浊管制备方法如下:(１)0、048mｏl/L BaＣｌ2,(１、175% w／v BaＣｌ2·2H2O)0、５ml,加到99、5ml的０、18 mol/Ｌ(0.3６N)H2SＯ4(1％v/ｖ)溶液中,制成比浊管;(2)用光径为1cｍ的分光光度计测定光吸收来标定比浊管。
0、5麦氏标准比浊管在６25nｍ波长的吸收光度应为0、0８-0、1;(3)选管径与制备菌液试管相同的螺口试管,每管分装4-6ml;(4)将试管帽拧紧,放室温暗处保存;(5)用前,将比浊管在旋转振荡器上混匀。
如出现大颗粒,应更换;(6)每个月更换比浊管或复检比浊管的浊度。
５操作步骤5、1 制备接种菌液5、1、１增菌法步骤如下:(1)选琼脂平板上形态相同的菌落至少4-5个,用接种环挑其顶部,移至4－5ml肉汤或大豆酪蛋白消化液中;(２)置35℃培养至菌液浓度达到或超过比浊管浓度(一般需2－6小时),浓度约1－２×10８CFU/ml;(３)用生理盐水或肉汤校正菌液浓度,与比浊管相同。
可用光电比浊。
目测比浊须在适当光照下以黑色线条为反衬。
5、１、2 直接菌悬液法步骤如下:(1)做常规药敏试验,可直接用过夜培养的菌落(必须用无选择性培养基平板,如普通琼脂培养基)在盐水或肉汤中制备接种菌液。
菌液浓度调至0、5麦氏管;(2)此法适用于在肉汤培养基中生长不好的细菌如嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌与链球菌及葡萄球菌的甲氧苯青霉素或苯唑青霉素的耐药试验;(３)当用此法做复方磺胺药的试验时,从平板上直接挑菌落时会携带相当量的拮抗剂,造成敏感菌株的抑菌环内出现轻微的生长菌膜。
５.2 接种平板步骤如下:(1)校正的菌液须在15分钟内使用。
用一无菌棉试子蘸取菌液并在上端管壁旋转挤压几次,去掉过多的菌液;(2)用试子涂布整个琼脂平板表面,反复涂布几次,每次将平皿旋转60度,保证涂布均匀。
(3)将平皿盖打开3-5分钟,使培养基表面的水份吸收掉。
然后贴药敏纸片;(4)注意:避免用过浓的菌液,禁用未经稀释菌或其她不标准菌液接种平板。
5、３贴纸片 (1)接种平板后,贴上药敏纸片。
用镊子或针尖压一下纸片使其与培养基表面贴牢。
纸片要贴得均匀,纸片与纸片中心距离不得小于24mm。
原则上,直径150ｍm得平板贴１2张纸片,直径100mm平板贴5张纸片。
纸片贴后不应再移动,因为有些药物会立即扩散;(2)贴上纸片15分钟内,须把平板倒放在35℃恒温箱中。
因为抑菌环解释标准就是在普通环境中标定的,所以除嗜血杆菌与淋病奈瑟氏菌外,平板不可放在高CO２的环境中。
ＣO2与某些因素作用可使抑菌环增大。
5、4 读取结果 (１)经16-18小时培养后,观察结果。
菌液浓度适合且涂得好,抑菌环规则,细菌呈融合生长。
如果出现单个菌落,说明接种量小,需重做试验,测量抑菌环直径须包含纸片直径:手持平皿从背面目测检查每块平板,借反射光(黑色无放光背景),用卡尺、普通尺或特制的模板量取抑菌环直径,单位为毫米。
培养基中如果加了血液,须打开平皿盖,借反射光,从正面量抑菌环。
如果就是葡萄球菌或肠球菌,须培养２4小时后,经投射光检查苯唑青霉素与万古霉素的抑菌环内有无耐药菌株的生长。
抑菌环内有任何生长的表现都表明就是耐药菌株。
(２)肉眼见不到细菌明显生长的区域为抑菌环边缘,有很难辨认的细小菌落不算。
如抑菌环内有大量细菌生长,须再移植出来,重新鉴定,重新做药敏试验。
变形菌在某些抗菌药物纸片周围可弥漫生长到抑菌的区域内,当抑菌环边缘清楚,弥漫生长不算。
甲氧苄氨嘧啶与磺胺药的拮抗剂会支持细菌生长,因而测这类药时可忽略轻微生长(80%以上受抑制),以浓密生长的区域作为抑菌环的界限。
用加血的培养基测链球菌,测量抑菌环时不包括溶血环。
(3)参照表2的标准对抑菌环的大小作出解释,以敏感、中介或耐药的形式解释结果。
6 娇嫩细菌Mueller-Hinton培养基只适用于快速生长的细菌,一般不适于测定娇嫩细菌。
娇嫩细菌的药敏试验如果要用纸片法做,培养基、质量控制方法、解释标准都须做修改以适合每种细菌。
以下介绍的纸片方法用于流感嗜血杆菌,淋病奈瑟氏菌与肺炎链球菌等娇嫩细菌,结果就是准确的。
其她细菌须用稀释法测定。
厌氧菌不能用纸片扩散法测定抗菌药物敏感性。
结果解释8、1 抑菌环解释标准抑菌环解释标准见表2、2A、2Ｂ与2Ｃ。
表中所列的敏感类别首先就是经过将抑菌环直径与肉汤或平板稀释法测定的最低抑菌浓度(MIC)进行比较,并且根据已知敏感与抗菌株的抑菌环或MIC的群体分布得出的。
然后再结合MIＣ与抑菌环直径的相关分布,结合药物常用剂量的临床药物代谢动力学关系进行分析。
最终还要结合临床的治疗效果对体外试验与药理的数据做综合评价。
8、２敏感度分级８、２、１敏感表示被测菌株所引起的感染可以用该抗菌药物的常用剂量治疗有效。
禁忌症除外。
8、２、2 中介指MIC接近药物的血液浓度或组织液浓度疗效低于敏感菌。
还表示被测菌株可以通过提高剂量(如β-内酰胺类药物)被抑制,或在药物生理性浓集的部位(如尿液)被抑制。
另外,中介还表示“缓冲域”,以防止由微小的技术因素失控,所导致较大的错误解释(如某菌种极少对某药物敏感或抑菌环完全不会在此测定范围内,或培养基的差异影响了药物,或药物的中毒界限很窄)。
8、2、３耐药被测菌定为耐药就是指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在组织液内或血液中所达到的浓度所抑制,或属于具有特定耐药机理(如β-内酰胺酶),所以临床治疗效果不佳。
8、３与敏感度相关的MIＣ分界点抑菌环直径与用标准方法(一般指肉汤稀释法)测得的MIC呈负相关。
表2,2Ａ,2B与2C列出与抑菌环敏感度分界点相关的MIＣ分界点。
这些与抑菌环直径相对应的MIC分界点就是根据抑菌环与MIC相关性的研究,以及药物代谢动力学与临床疗效的分析,并且与NＣCLS M7标准(Methoｄs for Dilution Aｎtiｍicｒobial Sｕsceｐtｉｂiiｔy Teｓｔs for Bacteria ｔhａt Ｇrow Aerobically)所定的MIC分界点相似得出的。
然而,由于方法学上与原始数据方面的差异,会存在偶然的细小差别。
９质量控制方法9、1 目的质控的目的就是监测以下几个方面:(１)药敏试验操作的精确度与准确度。
(2)试验中试剂的情况。
(３)操作者的工作情况。
使用遗传上稳定的参考菌株即可达到上述目的。
９、2 质控菌株为了控制药敏试验的精确度与准确度,须从可靠来源获得指控菌株。
质控菌株如下:(１)大肠埃希氏菌ATCC 259２2 ,(２)大肠埃希氏菌 ATCＣ 3５218,(３)绿脓假单胞菌ＡＴCC 27８５3,(4)金黄色葡萄球菌 ATCC 25９２3,(5)粪肠球菌AＴＣC 29212,(6)流感嗜血杆菌ATCC 4９2４７(用于表3Ａ的HTM),(7)流感嗜血杆菌 ATCC 4９7６6(用于表3Ａ的HTM),(8)淋病奈瑟氏菌ＡTCC 49226(用于表3Ｂ的GC琼脂),(9)肺炎链球菌 AＴCＣ 49６１9(用于表3C的羊血M-Ｈ琼脂)。
大肠埃希氏菌 AＴＣＣ 35２18仅用于β-内酰胺酶抑制剂合剂的质控。
粪肠球菌ＡTCC ２９212(或ATCＣ 331８6)用于测试培养基中磺胺抑制剂的水平。
粪肠球菌ＡTCC 29212还用于高浓度庆大霉素纸片的质控。
质控菌株测试与保存方法如下:(1)须用与临床分离菌所用相同的抗生素测试质控菌株。
(2)日常用的质控菌株在大豆酪蛋白消化液琼脂(M-H琼脂)上(普通菌株)或强化的巧克力琼脂上(娇嫩细菌)4-8℃保存,每周传代一次,如具备有长期保存的条件最好长期保存。
用适当的保护剂,如50%小牛血清肉汤或脱纤维羊血,在-20℃以下保存。
以上方法都不会改变细菌的抗菌药物敏感性。
(３)日常使用的质控菌株应至少一个月更换一次,由冻干保存菌种移种或购买新菌种。
(4)测定时,先将菌种接种肉汤,孵育４－18小时,然后划种平板,得到单个菌落。
(5)按推荐的方法,挑取菌落,制备接种菌液。
(6)用这种质控菌株测出的抑菌环平均值如未出现明显差异,该菌株就可以继续用来监测准确度与精确度。
如平均直径有明显改变,且该差异不可能就是由方法学造成的,表示质控菌株污染或敏感性发生变异,此时应更换新菌株。
9、3 抑菌环质量控制界限表3,３A,3B与３C列出了一个质控结果允许出现的最大与最小抑菌环直径。
一般情况下,每20个测定结果只允许有一个失控(即,超出列表中所列的准确度控制范围)。
20个连续测定中任何多于一个以上的失控结果都必须对操作进行修正(如,一旦出现第二个失控结果,马上修正)。
另外,如果一个质控结果超过质量控制界限范围中间值上下四个标准差范围时也必须进行修正。
修正后,继续观察连续2０次测定的结果。
注意:本节指的就是失控情况下如何处理,务必不要与在实验条件稳定时所进行的一周一次的质量控制项混淆(见9.43节)。
9、4 质控测定的次数每批新的Ｍ-H琼脂或新的抗菌药物纸片必须用质控菌株检测。
质控菌株每天与常规工作一起测定,来检测整个操作过程。
只有在实验结果合乎要求后,才能减少检测次数。
通过以下几个方面可以判断实验就是否符合要求。
(1)同常规标本一起连续测定质控菌株３０天。
(2)每种药物对每种细菌,30个抑菌环中(如一个药物对一种细菌的连续30天测定结果),超出表３所给的范围的应不多于3个。
注意:本过程就是为了建立稳定的制片扩散法药敏试验的质量控制方法,以达到最终可以进行每周监测一次的目的,务必不要与９、３节中有关失控进行修正的措施相混淆。
达到以上要求,以后每周至少应测一次。
如果试剂有变动,须连续监测。
每周监测一次时,如发现有不符合要求的结果,应立即改为每日监测,寻找原因以便解决。
按下法查找原因:(1)连续5天测定质控菌株。
(2)每种药物对每种细菌,所测的这5个抑菌环不得超出表3的准确度范围。
每种药物对每种细菌,连续测定的这５个抑菌环的范围不应超出表3,3Ａ,3Ｂ与3Ｃ的精确度范围。
如果达不到上述要求(只要有一个抑菌环直径超出准确度范围或抑菌环范围大于精确度所允许的范围),必须连续进行每日监测。
只有在以后连续测定了3０次质控菌株且结果合格后才可以改为每周监测。
9、5 产生误差常见的原因只要有一次质控结果超出表３,3A,3B与3C的允许范围,应从以下诸方面查找原因。
(1)记录质控结果有无笔误;(2)测量抑菌环时就是否读错;(3)质控菌株污染或有其她改变;(4)接种菌液过浓或过淡;(５)比浊管没有混匀;(6)孵育温度或孵育环境不对;(7)M－H琼脂有批间差——每批培养基用前应鉴定;(8)药敏纸片在保存与使用中就是否失效。