平面色谱法

薄层色谱法： 1938年 产生 20世纪60年代 发展和普及 20世纪80年代 仪器化薄层色谱法 (instrumental thin layer chromatography))
第一节 平面色谱法的分类和原理
• 平面色谱法的分类 • 平面色谱法参数
一、平面色谱法的分类
按操作方式分为薄层色谱法、纸色谱法、 薄层电泳法。
分类 正相色谱：流动相的极性比固定相小。 反向色谱：流动相的极性比固定相大。
在正相色谱中，极性大的组分在固定 相中保留时间大，分配系数大，Rf值 小； 在反相色谱中，极性大的组分在固定 相中保留时间短，分配系数小，Rf值 大；
二、吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂
(一)吸附剂 吸附薄层色谱法的固定相(stationary phase)为吸附剂，常用吸附剂有硅胶、 氧化铝和聚酰胺等。
2、氧化铝 氧化铝可分为中性(pH7.5),碱性 (pH9.0)和 酸性(pH4.0)三种。
应用范围： 碱性氧化铝用来分离中性或碱性化合物， 如生物碱、脂溶性维生素等。 中性氧化铝适用于酸性及对碱不稳定的 化合物的分离。 酸性氧化铝可用于酸性化合物的分离。
表19-1 硅胶与氧化铝的活度与含水量的关系
常见化合物的极性由小到大为： 烷烃( CH3, CH2 )＜烯烃( CH CH ) ＜醚( OCH3, OCH2 )＜硝基化合物 ( NO2)＜酯＜酮( C O)＜醛( CHO)
＜胺( NH2)＜醇( OH)＜酚(Ar OH) ＜羧酸( COOH)。
常用溶剂的极性强弱： 水＞酸＞吡啶＞甲醇＞乙醇＞正丙醇
c.硅胶GF254板的制备 取硅胶GF254板5g, 加入15～17mL 4‰ 的CMC-Na，调成糊状。去除气泡后，
＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞二 氯甲烷＞甲苯＞苯＞三氯乙烷＞四氯 化碳＞环己烷＞石油醚
选择原则： 先用单一溶剂展开，根据被分离物质在 薄层上的分离效果，进一步考虑改变展 开剂的极性，即采用二元、三元甚至多 元展开剂。
选择依据见 Stahl设计的 一个简图。
例：某物质用氯仿展开时，⑴Rf值太小， 甚至停留在原点，该如何调整展开剂？ ⑵若Rf值太大，斑点在前沿附近，又 该如何调整展开剂？
(三)面效参数 理论塔板数，塔板高度
1.理论塔板数(number of theoretical plate;n)：反映组分在固定相和流动相中 动力学特性的色谱技术参数，代表色谱 分离效能的指标。
计算公式
n =16(L/W)2 L:原点到斑点中心 的距离， W：组分斑点的纵 向宽度。 若L相等，斑点越集 中，即W越小，n越 大。
R 2d 2 (9.2 6.7) 2.4 W1 W2 0.9 1.2
例2：用薄层扫描法在一氧化铝薄层板 上物测质得半如峰下宽数为据3.6：mLm0;=R1f=0.18的cm物,R质f=半0的峰 宽为9.4mm，试评价该薄层板的板效。
解：SN L0 1 10.8 1 7.3
Rf = L / L0
定时展开, L=ut, L0=u0t, L/L0=u/u0
v=u,u=u0 ; 所以 Rf =R΄
R' 1
1 k
Rf
1 1 k
或
k 1 Rf Rf
1 R'
1 K Vs Vm
则
Rf

1
1 KVs
/ Vm
Rf =1，K=0，k=0,组分不被固定相保留。 Rf =0，K=k=∞，组分停留在原点，完全 被固定相保留。
吸附薄层色谱法 分配薄层色谱法 分子排阻薄层色谱法 胶束薄层色谱法
按分离效能分: 经典薄层色谱法 高效薄层色谱法
(一)吸附薄层色谱法 定义:固定相为吸附剂的薄层色谱法为 吸附薄层色谱法。
分离原理：将A、B两组分的混合溶液 点在薄层板的一端，在密闭的容器中 用适当的溶剂(展开剂，developing solvent,developer)展开。
20cm的硅胶板上，用氯仿-乙醇-庚烷(1:1:1)为 展开剂上行展开。当展开剂前沿距板上沿1.5cm 时停止展开。此时，磺胺嘧啶斑点距板下沿 6.7cm，斑点直径9mm。磺胺噻唑斑点距板下沿 9.2cm，斑点直径12mm。已知样品原点距板下沿
2cm,计算它们的Rf值各为多少？分离度又是多
少？ 解：L0=20-1.5-2=16.5cm L嘧=6.7-2=5.7cm, Rf嘧 =L嘧/L0=5.7/16.5=0.28 L噻=9.2-2=7.2cm, Rf噻=L/L0=7.2/16.5=0.44
2.塔板高度(height of theoretical plate;H) 塔板高度是由理论塔板数及原点到展开 剂前沿的距离(L0)算出的单位理论塔板 的长度。
计算公式： H= L0/n
H与n成反比，n值越大，H值越小。
(四)分离参数 分离度和分离数
1.分离度 (resolution; R): 两相邻斑点中心的 距离与两斑点平均 宽度的比值。 计算公式：R = 2(L2 –L1) /(W1+W2) =2d/(W1+W2)
第十九章 平面色谱法
• 平面色谱法的分类和原理 • 薄层色谱法 • 纸色谱法
平面色谱法(plane chromatography): 在平面上进行分离的一种色谱方法， 主要包括薄层色谱法和纸色谱法。
纸色谱法： 20世纪40年代 产生 应用于生化医药学方面的微(一)定性参数 比移值 ，相对比移值。
1.比移值(retardation factor, Rf) 定义：比移值是溶质移动距离与流动相 移动距离之比。或者说原点到斑点中心 的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。
基本公式：
Rf= L/L0 L:原点(origin)至斑点中心 的距离， L0：原点至溶剂(solent front)前沿的距离。 要求: 0＜Rf ＜1 适宜范围：0.2＜Rf ＜0.8 最佳：0.3＜Rf ＜0.5
解： ⑴Rf值太小，说明流动相极性太 小，应该加大流动相的极性。在氯仿 中加入一定量的甲醇或丙酮。 ⑵若Rf值太大，说明流动相极性太大， 应加入一定量的烷烃或石油醚。
三、薄层色谱操作方法 薄层色谱法一般操作程序可分为制板、 点样、预饱和、展开和显色5个步骤。
（一）薄层板的制备
1.对玻璃板的要求： 表面光滑，清洁。 2.对薄层板的要求： 吸附剂涂铺均匀，表面光滑，厚度一致。 一般厚度为250μm为宜。
硅胶含水量%
0 5 15 25 38
活性级
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
氧化铝含水量%
0 3 6 10 15
含水量越高，活性越弱。
（二）展开剂 展开剂选择是薄层分离成功的重要条 件之一。
选择依据： 根据被分离物质的极性、吸附剂的活性、 展开剂的极性来考虑。 一般的极性大的组分用极性大的展开剂， 极性小的组分用极性小的展开剂，即 “相似相溶原则”。
1.硅胶 吸附特性：硅胶为多孔性无定形粉末， 表面带有硅醇基(silanol, Si OH )呈弱酸 性，通过硅醇基(吸附中心)与极
性基团形成氢键而表现其吸附性能， 由于各组分的极性基团与硅醇基形成 氢键的能力不同，而各组分被分离。
O H·····O H Si O Si
活化：硅胶吸附水分形成水合硅醇基而 失去吸附能力，将硅胶加热至100℃左 右，该水能可逆被除去，而提高活度， 这一过程称为“活化”(activation).
硅胶的类型： 常用的有硅胶H、硅胶G和硅胶GF254。
硅胶H不含黏合剂，铺成硬板需另加粘 合剂。 硅胶G是硅胶和锻石膏混合而成。 硅胶GF254含锻石膏和无机荧光剂，即锰 激活的硅酸锌(Zn2SiO4:Mn),在254nm紫 外光下呈强烈黄绿色荧光背景。
应用范围：
酸性和中性物质的分离。如有机酸、酚 类、醛类等。
2.相对比移值(relative Rf ,Rr) 定义：组分与参考物质在同一条件下
的Rf值(或移行距离)之比。
计算公式
Rf = Rf(i) / Rf(s) = L(i) / L(s) 其中 Rf(i)：组分i的Rf值。 Rf(s)：参考物质的Rf值。
同一条件 下测得。
前沿 S A
l0
原点
ls la
R (L2 L1) 2d (W1 W2 ) / 2 W1 W2
L2 ,L1:分别为原点至两斑点中心的距 离。 d:两斑点中心的距离， W1,W2：斑点的宽度。
2.分离数(separation number; SN) 分离数是衡量平面色谱分离容量的主 要参数，也是面效的评价参数。
A,B两组分 吸附剂
吸附
新的吸附剂
A，B移动
吸附
展开剂溶解 解吸附
展开剂 薄层板上
解吸
吸附，解吸附，再吸附
再解吸，反复多次
A ,B得以分离
KA＞KB, RfA＜RfB
注意：一般极性大的组分移动速度慢， 极性小的组分移动速度快。
(二)分配薄层色谱法 定义：利用试样中各组分在固定相与流 动相之间的分配系数的不同，各组分在 板上迁移速度不同而获得分离的薄层色 谱法。
Rr = Rf(a) / Rf(s) = La / Ls
薄层色谱Rr值的示意图
参考物质可以是加入试样的纯物质，也 可以是试样中的某一已知组分。
Rr的优点： 1）可以消除系统误差，重现性和可比 性都比Rf好。 2） Rr可以大于1，也可以小于1。
(二)相平衡参数
分配系数K 和容量因子k。
1因. K为、k与RRf值' 的v关系 u
3.硬板的制备：
硬板加了粘合剂，常用的粘合剂有羧甲 基纤维素钠(CMC-Na)和锻石膏 (CaSO4·1/2H2O)两种。
a.硅胶-G板制备 商品硅胶-G本身含有13%的锻石膏,制备 时只需取一定量的硅胶-G在研钵中，加 2～3倍量的水，朝同一方向研磨成糊状， 当稠度适宜时，立即铺板。