2021年杆状病毒介绍
核型多角体病毒侵染及其与宿主免疫系统互作的研究进展
环境昆虫学报2021, 43 (2)： 329 -339Joornal cf Eavironmental Einomologyhttp ： 〃hjkcxb. alfournals. netdoi ： 1023969 Fii s n21674 -08582202120226黄博，朱梦瑶，丘需珊，张若男，张文庆，余小强，卢玉珍•核型多角体病毒侵染及其与宿主免疫系统互作的研究进展[J ].环境昆虫学 报，2021, 43 (2) : 329 -339.核型多角及其与宿主免疫系统互作的研究进展黄 博1,3,朱梦瑶1,丘需珊1,张若男1,张文庆2,余小强1,卢玉珍1(1.华南师范大学生命科学学院，广东省昆虫发育生物学与应用技术重点实验室，广州510631；2.中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广州510275；3.华中师范大学生命科学学院，武430079)摘要：核型多角体病毒(NucmopXyhedavirus , NPV )应用广泛，已被开发成微生物杀虫剂和用于重组蛋白表达 等。
NPV 具有两种病毒颗粒：包埋型病毒粒子(occlusion - derived virus , ODV)和芽生型病毒粒子(budded virus, BV),两的构成和在差异。
病毒包涵体在肠道中溶出ODV 进 感染,子 衣壳通出生BV 引发全身性的次级感染。
病毒感染昆虫引发宿主的免疫反应，同 NPV 病毒已进化出多种策略抑制或逃避宿主的免疫反应，如免疫信号 、黑 和凋亡。
总结鳞翅目特异性NPV 与宿主的 研究，着重介绍NPV 的 制、NPV 与宿疫的研究进展。
关键词： 角体病毒；杆状 毒；包埋型病毒粒子；芽生毒粒子；先天免疫中图分类号：Q965； S476 文献标识码：A文章编号：1674 -0858 (2021) 02 -0329 -11Advance in the researchi of nucleopolyhenrovirus infection and its interaction with host immune systemHUANG Be 1,3, ZHU Meng-YaX , QIU Pei-Shan 1, ZHANG Rue-Nan 1, ZHANG Wen-Qiny 2, YU Xiav- Qiany 1, LU Yu-/hen 1"(1. GuangdongProvincial Key Laboratoy of Insect Developmental Bmioxy andApplied Technomyy , School of Life Sciences , South China Nomiai University , Guangzhou 510631, China ；2. State Key Laboratoy of Biocontai , Sun Yat-sen Universip , Guangzhou 510275, China ；3. School of LifeSciences , Centea4ChinaNoema4Uniieesity , Wuhan 430079, China )Abstraci : Nuteoplyhedavirus ( NPV ) has been widely used as a bioloyicxi control ayent and anexpression system for recombinant proteins. Thera arc tpv viuon phenotypes , occlusion -devved virus(ODV )and the budded virus ( BV ) , that arc distinct in the composition and osembiy during tPvinfection cycle. The pvmaa i nfection occurs when occlusion bodies ( OBs ) arc disassembled tv release ODV viuons inta lumen of Pa midyut. The payeny nucleocapsids arc transported tv the plasma membraneP yenerata BV phenotype. The BV viuons may infect other tissues and cxusa secondary phase of infection. Insects possess efficient innate immune defenses tv viral infection , whereas NPV has evolved vavous 9teategie9to9uppee 9oeaioid ho9timmuneee9pon9e9.Theinteeaction peoce 9e9between NPV and ho9timmune system includa immune siynaliny pohway , melanization and apoptosis. In thu paper , wvsummavav recent studies on the interactions betpeen Lepidopteran-specific nucleopolyhedavirus and their基金项目：国家自然科学基金(31901941)；国家重点研发计划(2019YFD1002100)；中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室开放课题(2018SKLBC-KF03)作者简介：黄博，男，1994年生，湖北省黄冈市人，硕士生，研究方向为昆虫与病原菌的免疫互作，E-mail ： ******************通讯作者Author for correspondence :卢玉珍，女，博士，副研究员，主要研究昆虫病原微生物，E - mail ： luyuzhen2015@ outlook, com收稿日期 Received ： 2020 —08 —19 (接受日期 Accepted ： 2020 -12-22330环境昆虫学扌&Journal eg Environmental Entomology43insect hosts,mainly focus on the mechanisms of infection,and the interaction between NPV and host immunesystem.Key words：Nucleopolyhedmvirus;baculovirus;occlusion-deCved virus;budded virus;innale immunity杆状病毒(baculovirus)是具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，基因组大小为80-180kb,只专一性感染昆虫，主要以鳞翅目、双翅目和膜翅目昆虫为宿主(Lange ei al.,2004;HarCson ei al,2018)。
颗粒病毒(GV)简介
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昆虫病毒的生产
❖ 病毒为专性寄生病原，至今尚未研究出能在 人工培养基上生长，只能在活细胞中增殖。 因此，目前国内外应用于害虫防治的昆虫病 毒制剂主要是通过活虫体增殖和细胞培养法 繁殖。
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在昆虫活体中大量增殖昆虫病毒
3种途径：
❖ 直接在自然种群中繁殖 ❖ 从野外采回大量活虫接种繁殖 ❖ 在室内条件下饲育大量害虫接种繁殖
❖ 6 产品质量检验
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GV在害虫防治上的应用
加拿大研究菜青虫的黄绒茧蜂能在寄主种群中 传播GV。
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利用病毒防治害虫一方面可以起到微生物杀虫 剂的短期防治作用，另一方面使用后有可能 使病毒长期存在于农林生态系中，作为一类 被引入的生态因子而起调节害虫种群密度的 作用。
2021/的生产
❖ 菜粉蝶为世界性重要害虫。其幼虫又名菜青 虫，是我国分布最普遍，为害最严重，经常 成灾的害虫，幼虫偏嗜十字花科蔬菜，幼虫 将叶片咬成孔洞和缺刻，严重发生时可将叶 片全部吃光。
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菜粉蝶GV的生产工艺
❖ 1 人工饲料饲养菜青虫
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GV的感病特征
❖ 染病幼虫常于幼虫期即死，有时也可活至蛹 期或成虫期。从染病到死亡所经时间因虫而 异。一般4～5天，可长至34天，如粘虫。幼 虫龄期、侵染剂量、温度等因素也能影响这 段时期的长短。
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GV的感染途径
❖ 通过口服进入易感虫体，颗粒体在中肠中溶 解，游离的病毒粒子通过肠道柱形细胞的微 绒毛而侵入，在这些细胞核中增殖，新形成 的颗粒体病毒释放于血淋巴中而导致对其他 组织的继发感染。
杆状病毒介绍
杆状病毒介绍杆状病毒关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。
目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。
杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA 复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
杆状病毒资料
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杆状病毒：基本概念与深入研究
01
杆状病毒的基本概念及其特征
杆状病毒的分类与分布
杆状病毒属于病毒科
• 包含多个属，如昆虫杆状病毒属、哺乳动物杆状病毒属等 • 病毒分布广泛，包括昆虫、哺乳动物、鸟类等
昆虫杆状病毒属
• 主要感染昆虫，如果蝇、蚊子、蝴蝶等 • 具有宿主特异性，不同病毒针对不同的昆虫宿主
杆状病毒与宿主免疫系统具有相互影响的关系
• 病毒可通过抑制宿主免疫反应，逃避宿主免疫清除 • 宿主免疫系统可通过识别和清除病毒，抑制病毒复制和扩散
04
杆状病毒的应用与研究进展
杆状病毒在基因治疗中的应用
• 杆状病毒可作为基因载体，将目的基因导入宿主细胞 • 病毒具有宿主范围广、基因容量大等优点，适用于多种基因治 疗策略 • 通过基因编辑技术，改造病毒载体，提高基因导入效率和安全 性
哺乳动物杆状病毒属
• 主要感染哺乳动物，如猴子、松鼠、蝙蝠等 • 部分病毒可引起人类疾病，如出血热、脑炎等
杆状病毒的形态与结 构
• 杆状病毒呈长棒状形态，直径约20-30纳米，长度可达几百纳 米
• 病毒核衣壳由核壳蛋白组成，具有螺旋对称结构 • 病毒基因组为单链DNA或双链RNA，线性或环状 • 病毒基因组两端具有反向重复序列（ITR），有助于病毒复制和 组装 • 杆状病毒具有包膜结构，包膜上含有病毒蛋白，有助于病毒感染 宿主细胞
杆状病毒通过吸附、内吞和解包等过程感染宿主细胞
• 病毒吸附在宿主细胞表面，通过受体结合进入细胞 • 病毒通过内吞作用进入细胞，形成内质网或溶酶体内的病毒颗粒 • 病毒在细胞内解包，释放基因组，开始病毒复制和表达
杆状病毒-课件
杆状病毒杀虫剂的研究
杆状病毒杀虫剂作为农作物、森林害虫防治 的新型安全的生物农药，已经得到了人们的重视。 与传统的化学农药相比，杆状病毒对宿主昆虫具 有高度的病原性，对非靶生物十分安全，能够在 环境中长期存活，对人、畜及其他脊椎动物无害， 不污染环境，能和其他化学农药混合使用，同时 具有防效时间长、使用方便等优点，所以早在 1973年就已被联合国粮农组织和世界卫生组织推 荐作为化学农药的理想替代品。
除了和复制相关的基因以外, 在AcMNPV基因组
中共鉴定出10个基因与晚期基因的转录有关,它们是lef4, lef-5, lef-6, lef-8, lef-9, lef-10, lef-11, lef-12, 39K和p47等 基因。其中4个保守基因( lef-4, lef-8, lef-9和p47)的产物
病毒基因表达
早期基因的表达 早期时相向晚期基因表达的过渡 晚期基因的表达
早期基因的表达
早期基因的转录是由宿主RNA聚合酶Ⅱ 介导的。早期基因迅速表达以满足病毒复制 周期所需条件：
控制宿主细胞的代谢机器 为病毒DNA复制提供必需条件 突破或阻断宿主细胞防御机制 提供下一时相病毒基因表达所需基因产物
HaSNPV ）
杆状病毒的分类
Baculoviridae 杆状病毒科
NPV Nucleopholyhedrovirus 核型多角体病毒属
GV Granulovirus 颗粒体病毒属
MNPV SNPV
Baculoviridae
NPV GV
组I 组 II
AcMNPV OpMNPV BmMNPV
LdMNPV SeMNPV HaSNPV
杆状病毒表达系统简介-9页精选文档
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。
原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。
真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。
昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。
1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m 的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
杆状病毒表达系统00000001
昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白●杆状病毒表达系统介绍●杆状病毒蛋白表达系统的优势●杆状病毒表达载体系统（BEVS）●杆状病毒表达宿主细胞●表达优化条件●翻译后修饰对蛋白表达的影响●高通量表达●总结杆状病毒介绍1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒。
2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态：一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另一种为包含体病毒（Occlusion‐derived virus, OV）。
3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。
4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。
5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclearpolyhedro‐sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。
杆状病毒生命周期●早期（0‐6h PI）•核衣壳迁移到细胞核•病毒DNA释放•开始早期基因表达●晚期（6‐24h PI）•更多DNA复制•新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质•的过程中得到囊膜蛋白•产生新的出芽病毒●极晚期Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia •出芽病毒减少•核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs•MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形成包含体病毒。
多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。
优点缺点大肠杆菌成本低、表达量高。
缺乏蛋白质翻译后加工机制；目的蛋白不可溶，蛋白生物活性低。
酵母表达量高，可以翻译后加工，易实现高密度发酵。
蛋白质量不理想。
哺乳动物细胞重组蛋白生物活性高。
成本高；表达水平低，技术和环境要求高。
昆虫细胞重组蛋白生物学活性高；表达水平高；能同时表达多个基因。
重组蛋白糖基化程度低。
杆状病毒及其持续性感染细胞的研究现状及展望
杆状病毒及其持续性感染细胞的研究现状及展望黄磊（贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳550001）摘要：杆状病毒（Baculovirus）是一类专一性寄生于节肢动物，且具囊膜包被的双链闭环DNA病毒，是一种具有潜力的生物杀虫剂，也是生态系统的一个组成部分，是调节昆虫种群密度大小的重要病原因子。
了解杆状病毒持续性感染细胞的研究现状，对后续研究病毒-宿主关系、杆状病毒的持续感染及激活的机制、利用杆状病毒作为真核表达载体、开发杆状病毒应用于农林业病虫害防治、控制昆虫种群密度等方面具有重要意义。
关键词：杆状病毒；病毒的持续性感染；现状及展望Baculovirus And Baculovirus Persistent Infection Cells Status AndProspectsHuang Lei(School of Life Sciences, Guizhou Normal University, Guiyang 550001, China) Abstract: Baculovirus are a class of specific parasitic arthropods, and capsular bag closed by a double-stranded DNA virus. It is a potential of the bio-pesticides, is an integral part of the ecosystem, also the important etiologic agent to regulation of insect population density size. Understanding Baculovirus persistent infected cells research status, on the follow-up study the relationship of virus-host ,the baculovirus persistent infection and activation mechanisms, use baculovirus as a eukaryotic expression vector, and develop baculovirus to use in pest control of agroforestry, as well as control insect population density and other aspects of great significance. Key words: Baculovirus;Baculovirus persistent infection; research status and prospects 杆状病毒专一性寄生于节肢动物，对人类和环境安全，且昆虫一般不产生抗性，因而在害虫治理中受到极大关注[1]。
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杆状病毒欧阳光明（2021.03.07）关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。
目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。
杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA 分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
该病毒是杆状病毒科Baculoviridae的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA 病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。
其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。
由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。
本文主要介绍AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。
AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。
前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA 合成。
其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。
多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。
1.杆状病毒基因组的结构和功能研究杆状病毒基因组为双链环状 DNA分子。
DNA以超螺旋方式被压缩包装在杆状核衣壳(rod.shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜(envelope)后形成病毒粒子。
核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白和髓核(COle)。
其中衣壳蛋白是杆状病毒粒子的主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子和与其密切相关的碱性蛋白构成。
碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构。
目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角体病毒(BmNPV) 、黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPV)、舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒(LdMNPV) 、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒(SeMNPV)、棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)，以及斜纹夜蛾核型多角体病毒(SphMNPV)。
目前AcMNPV基因组的研究最为深入，它是双链超螺旋大分子环状DNA，其大小为90～160kb，约编码154个基因。
AcMNPV基因组的基因组织(gene organization)较为复杂，基因组的不同区域具有功能分化，基因的分布尚无规律可循，但AcMNPV基因组含有8个同源区，每区含有不等的重复或倒置重复序列，这些重复序列由位于中间的不完整回文序列及其两侧各约20bp的序列构成。
同源区是杆状病毒基因组普通存在的功能域结构，对于基因表达的调节具有增强作用，同时也是 DNA复制的原点。
杆状病毒中现已鉴定的基因近70种，可分为结构蛋白基因和非结构蛋白基因两大类。
结构蛋白基因如 polh、P10、gp64、p6.9、gp41、vp39等基因。
非结构基因中，与DNA复制相关的重要基因有helicase 基因(he1)、dnapol、lef-1、lef-2、lef-3、ie-1、/ie-2、p35、pe-38等；起表达调节作用的基因主要有 ie-1、ie-2、lef类基因、p35、pe38等。
这些代表性基因与其功能的关系见表1。
2．杆状病毒载体表达系统的特点AcNPV病毒用作外源基因的表达载体，通常是通过体内同源重组的方法，用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病毒。
由于多角体基因启动子在感染后18~24h开始转录和翻译，一直持续到70 h。
外源基因置换掉多角体基因后，并不影响后代病毒的感染与复制，意味着重组病毒不需要辅助病毒的功能。
杆状病毒表达系统自从第一次用来表达干扰素以后在许多重组蛋白的表达中得到广泛应用，例如用于表达白介素(IL)一2，3、BMP及多种病毒蛋白等。
相对其他表达系统它具有以下几个方面的特点：①组蛋白具有完整的生物学功能：杆状病毒表达系统可为高表达的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白。
②②能进行翻译后的加工修饰：杆状病毒表达系统具有对蛋白质完整的翻译后加工能力，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等，修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况完全一致：对比实验证明，在昆虫细胞发生的糖基化位点与哺乳动物细胞中完全一致，但修饰的寡糖种类却不完全一样。
这种不一致对不同目的蛋白的活性影响不同，所以昆虫表达系统还可作为一个研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面的理想模型。
③③表达水平高：与其它真核表达系统相比较，此系统最突出的特点就是能获得重组蛋白高水平的表达，最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50％。
④能容纳大分子的插入片段：杆状病毒毒粒可以扩大，并能包装大的基因片段，但目前尚不知杆状病毒所能容纳的外源基因长度的上限。
④⑤能同时表达多个基因：杆状病毒表达系统具有在同一细胞内同时表达多个基因的能力。
既可采用不同的重组病毒同时感染细胞的形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。
另外，昆虫杆状病毒表达系统具有剪切的功能，能表达基因组DNA；还有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等。
最后，杆状病毒对脊椎动物无感染性，现有研究也表明其启动子在N-％动物细胞中没有活性，因此在表达癌基因或有潜在毒性的蛋白时可能优于其它系统。
3．杆状病毒载体的重组与筛选杆状病毒由于基因组庞大，外源基因的克隆不能通过酶切连接的方式直接插入，必须通过转移载体的介导．即将极晚期基因(如多角体基因及其边界区)克隆入细菌的质粒中，消除其编码区和不合适的酶切位点，保留其5’端对高效表达必需的调控区，并在其下游引入合适的酶切位点供外源基因的插入，即得到转移载体。
将要表达的外源基因插入其启动子下游，再与野生型AcNPV DNA共转染昆虫细胞，通过两侧同源边界区在体内发生同源重组，使多角体蛋白基因被外源基因取代。
而将外源基因整合到病毒基因组的相应位置，由于多角体基因被破坏，则不能形成多角体。
这种表型在进行常规空斑测定时，可同野生型具有多角体的病毒空斑区别开来，这就是最初的筛选重组病毒的方式。
但由于重组效率较低(0.1％-1％)，表型差别不显著，应用上有一定的困难。
为此，经过不断探索，在重组杆状病毒的筛选与鉴定方面取得了很大改进，具体方法有以下几种。
3.1．半乳糖苷酶的蓝白筛选1990年，Vialard等在多角体基因的上游，利用pl0基因启动子带动LacZ基因构建了转移载体pJVNheI。
将其共转染sf细胞后，重组病毒可表达B-半乳糖苷酶，通过加入x-gal使之形成蓝色空斑，便可进行重组病毒的筛选。
1990年，Kins提出了线形化技术，其原理是线形化的杆状病毒基因组感染性很低，但仍具有与引入细胞内的同源序列进行同源重组的能力。
如果同源序列位于线形化杆状病毒的两端，则基因组即可环化恢复完整的感染性，使阳性重组率大大提高。
蓝白斑筛选蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。
野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。
有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。
设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。
这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。
用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz'的基因，lacz'中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。
MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。
虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'的质粒后，质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。
操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。