蔗糖合成酶(分解方向;SS-I)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法
土壤蔗糖酶(Solid-Sucrase,S-SC)试剂盒使用说明
土壤蔗糖酶(Solid-Sucrase,S-SC）试剂盒使用说明分光光度法50管/24样货号：BC0240产品简介：S-SC能够水解蔗糖变成相应的单糖而被机体吸收，其酶促作用产物与土壤中有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度密切关，是评价土壤肥力的重要指标。
S-SC催化蔗糖降解产生还原糖，进一步与3，5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，在540nm有特征光吸收，在一定范围内540nm光吸收增加速率与S-SC活性成正比。
试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰、甲苯（不允许快递）和蒸馏水。
产品内容：试剂一：甲苯5mL×1瓶，4℃保存；（自备）试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存；试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前每瓶加入40mL蒸馏水充分溶解备用；试剂四：液体45mL×1瓶，4℃保存；标准品：粉剂×1支，4℃保存，含10mg无水葡萄糖（干燥失重<0.2%），临用前加入1ml 蒸馏水溶解备用，4℃可保存1周，或者用饱和苯甲酸溶液溶解，可保存更长时间。
标准品准备：将标准品用蒸馏水稀释至0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg/ml。
操作步骤：试剂名称测定管对照管标准管风干土样（g）0.10.1-试剂一（μL）1515-振荡混匀，使土样全部湿润，37℃放置15min-试剂二（μL）250250-试剂三（μL）750--蒸馏水（μL）-750-混匀，放入37℃水浴培养24小时，10000g，4℃，离心5min，取上清液，同时准备标准品上清液或标准品（μL）200200200试剂四（μL）500500500充分混匀，放入沸水浴中煮沸5min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀。
标准曲线的建立：540nm处蒸馏水调零，读标准管吸光值A。
以浓度（y）为纵坐标，吸光度A（x）为横坐标建立标准曲线。
蔗糖合成酶(Sucrose synthase,SS)试剂盒说明书
货号：QS2504 规格：50管/24样蔗糖合成酶（Sucrose synthase，SS）试剂盒说明书可见分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：蔗糖是源（叶片等）光合产物向“库”器官运输的主要形态。
蔗糖合成酶（Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13）是双向反应酶，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是蔗糖代谢的关键酶之一。
研究其合成方向SS-Ⅱ的活性对于植物蔗糖合成具有重要意义。
测定原理：SS-Ⅱ催化游离果糖与葡萄糖供体UDPG反应生成蔗糖，蔗糖与间苯二酚反应可呈现颜色变化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小与颜色的深浅成正比。
自备实验用品及仪器：可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水试剂的组成和配制：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体4mL×1瓶，-20℃保存；试剂二：1000μg/mL蔗糖溶液10mL×1瓶，4℃保存；试剂三：液体3mL×1瓶，4℃保存试剂四：液体40mL×1瓶，4℃保存；试剂五：液体10mL×1瓶，4℃保存；样品测定的准备：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定管需要设一个对照管。
SS-Ⅱ活性计算：第1页，共2页1、按照蛋白浓度计算单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。
SS-Ⅱ活性(μg /min/mg prot)= C标准管×V1×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷(V1×Cpr)÷T=100×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷Cpr2、按照样本鲜重计算单位定义：每g组织每分钟催化产生1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。
酵母蔗糖酶的提取分离纯化及其蛋白质浓和酶活力测定
蛋白总量 = 蛋白浓度×总体积 总酶活 = 酶活×校正体积 比活力（Unit/mg）＝总酶活力/总蛋白 纯化倍数 = 比活力之比 回收率 = 总酶活之比
分实验四：离子交换柱层析纯化蔗糖酶
一、实验目的 学习掌握离子交换柱层析的原理与操作
二 、实验原理
离子交换是指液相中的离子与固相交换 基团中的离子可逆反应。离子交换剂有阳离子 交换剂（如：羧甲基纤维素：CM-纤维素）和阴 离子交换剂（如：二乙氨基乙基纤维素： DEAE-纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经 离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电 荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改 变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来 。
➢在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成葡萄糖和果糖。 ➢葡萄糖、果糖和碱性铜试剂混合加热后被其氧化，二价铜
被还原成棕红色氧化亚铜沉淀。 ➢氧化亚铜与磷钼酸作用生成蓝色溶液，其蓝色深度与还原
糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。
三、试剂
碱性铜试剂 磷钼酸试剂 葡萄糖标准溶液 0.2mol/L蔗糖溶液 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.9
将2-3mL醇级分2用移液管沿着管壁轻轻加到 层析柱中，注意不要扰动柱床，上样后，用大约 30ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，当A280nm 值降低稳定后，可用恒流泵及梯度混合器进行梯度 洗脱 [梯度混合器左侧放入50ml 0.02 mol/L pH值 为7.3的Tris-HCl缓冲液（含1 mol/L NaCl）， 右侧放入等量0.02 mol/LpH值为7.3的Tris-HCl 缓冲液]。
10 ──反应10min
B ──每管加入酶液mL数 原始酶液的酶活力 E = (E′/2)×稀释倍数
分实验三：蔗糖酶各级分的蛋白含量测定 （G-250法）
蔗糖磷酸化酶(Sucrose Phosphorylase, SP)试剂盒说明书
货号：MS2508 规格：100管/96样蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，裂解葡萄糖苷键，催化葡萄糖基转移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等，合成相应的葡萄糖基低聚糖。
此外，SP还能催化氢醌合成熊果苷，具有极强的美白效果，在化妆品工业中具有重要应用。
测定原理：SP能够以磷酸为受体，催化蔗糖产生1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸变位酶催化下变位为6-磷酸葡萄糖，在6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下还原NADP+生成NADPH，导致340nm光吸收值增加。
测定340nm吸光度增加速率，即可计算SP活性。
自备实验用品及仪器：天平、低温离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。
试剂组成和配制：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
缓冲液：液体10mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体5mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体1.5mL×1支，4℃保存。
试剂三：液体1mL×1支，4℃保存。
试剂四：粉剂×1支，-20℃避光保存，临用前加1mL双蒸水溶解。
试剂五：粉剂×1支，-20℃避光保存，临用前加1mL双蒸水溶解。
试剂六：粉剂×1支，-20℃避光保存，临用前加2mL双蒸水溶解。
试剂七：粉剂×1支，-20℃避光保存，临用前加2mL双蒸水溶解。
粗酶液提取：1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心10min，取上清待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
2-蔗糖酶的催化反应及活力测定.
一.实验目的
1.学习掌握3，5-二硝基水杨酸比色定糖的 原理和方法；
2.学习掌握酶的活力测定及其计算方法。
二.实验原理
蔗糖酶活力测定的原理
1.蔗糖 蔗糖酶 D-果糖 + D-葡萄糖
（非还原糖）
（还原糖）
2.酶活力=酶活力单位/ml=U/ml
3.酶活力单位：在本实验条件下，每min释放1mg 还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位
三、试剂和器材
（一）试剂： 1. 蔗糖酶溶液 2. 5%的蔗糖溶液 3. DNS （3,5二硝基水杨酸试剂) 4. 1mol/L的 NaOH溶液 5. 2mg/ml的葡萄糖标准液 （二）器材： 1．移液管、吸耳球 2．试管、血糖管（或刻度试管） 3．秒表 4．沸水浴 5．恒温水浴 6．分光光度计 、比色杯、镜头纸、滤纸
如样液有外溢，先用滤纸条吸干（不许檫）；再用镜头 纸向一个方向檫至透明；
倒出液体后，一定要用洗瓶中的蒸馏水洗净，然后倒置 在滤纸上吸干；
任何情况下都不许把比色杯放在仪器盖上； 自备废液杯（盛废液及废纸块用）
2.蔗糖酶的活力测定
取酶液2ml,按2倍稀释，分装两支试管，每支 试管2ml，一支中加入0.5ml 1mol/L的NaOH， 摇匀，使酶失活（做参比），另一支做测定 管；
②以葡萄糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标， 画出工作曲线。
试号 含糖量 葡萄糖标准 去离子水 3，5-二硝基水 光吸收值
（mg） 液（ml）
（ml） 杨酸试剂（ml）
A540
0
0
0
2.0
3.0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1 0.8
实验一 蔗糖酶活力测定
实验一蔗糖酶活力测定一、目的要求了解蔗糖酶的性质及3,5–二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶活力的实验原理，熟练掌握其测定方法。
二、实验原理蔗糖酶（sucrase, EC 3.2.1.26）又称转化酶，蔗糖在其作用下，水解为D–葡萄糖与D–果糖。
酵母细胞含丰富的蔗糖酶（胞内酶），细胞破壁后释放出来的蔗糖酶可以从果糖末端切开蔗糖的果糖糖苷键，使蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖是还原糖，其含量可通过3,5–二硝基水杨酸比色法测定，从而度量酶活力的大小。
蔗糖酶活力定义为：在35℃实验缓冲液条件下，每3min释放1mg还原糖的酶量为1酶活单位。
由于蔗糖酶在碱性条件下极易失活，所以可用碱终止酶解反应。
3,5–二硝基水杨酸定糖法实验原理：利用3,5–二硝基水杨酸溶液和还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在520nm波长处有最大吸收峰，在一定范围内其吸光度与还原糖含量呈线性关系，可用于还原糖含量测定。
三、试剂和仪器（一）试剂1、3,5–二硝基水杨酸试剂（DNS）。
甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2mL 10%NaOH，并用水稀释至69 mL，在此溶液中加6.9 g NaHSO3。
乙液：称取255 g酒石酸钾钠置于300 mL 10%NaOH中，再加入880 mL 1%3,5–二硝基水杨酸溶液。
将甲、乙两溶液混合即得到颜色呈黄色的使用液，贮于棕色瓶中，室温下放置7–10天后使用。
1、葡萄糖标准使用液（1mg/mL）：称取干燥的葡萄糖0.1000 g，溶于水并定溶至100 mL。
2、5%蔗糖溶液：称取5.00 g蔗糖用pH5.5 0.1mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置成100mL。
3、1mol/L NaOH。
(二)仪器1、电热恒温水浴锅。
2、721分光光度计。
1、秒表或手表。
四、操作方法1、标准曲线制备使用1cm比色皿，在520nm波长条件下，以试剂空白条零，测定各管吸光值。
用坐标纸绘制标准曲线；或用回归法计算求出以A520nm值为自变量，葡萄糖含量(mg)为因变量的直线方程。
蔗糖合成酶的测定方法
蔗糖合成酶的测定方法一、仪器设备冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计二、试剂HEPES-NaOH（50mmol/L，pH7.5）缓冲液，包括50mmol/L MgCI2；2mmol/LEDTA；0.2%(W/V)BSA；2%PVP；0.1%间苯二酚：称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。
30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L 果糖三、操作方法1、粗酶液制备称取0.5g样品（植物叶片去掉主叶脉），洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH 缓冲液，冰浴研磨，10000×g离心10min。
2、酶活性测定依次加入50μL粗酶液，50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5，20μL 50 mmol/LMgCI2，20μL 100mmol/L UDPG，20μL 100mmol/L6-磷酸果糖（20μL 100mmol/L果糖），30℃中反应30min后，加入200μL 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚，摇匀后置于80℃水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。
同时取50μL粗酶液，加入200μL 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。
3、蔗糖标线制作：取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。
4、计算样品中酶活性（μg·g﹣1·h﹣1）=式中C—反应液催化产生的蔗糖总量（μg）；V1—提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）；V2—酶反应时加入的粗酶液体积（ml）淀粉酶活性的测定1方法1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液：0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液：用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制；标准麦芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2mol·L-1 NaOH溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000 mL。
蔗糖酶测定
蔗糖酶测定1.分析意义：蔗糖酶是根据其酶促基质----蔗糖而得名的。
又叫转化酶或β-呋喃果糖苷酶。
它对增加土壤中易溶性营养物质起着重要的作用。
研究证明，蔗糖酶与土壤许多因子有相关性。
如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关。
一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。
它不仅能够表征土壤生物学活性强度，也可以作为评价土壤熟化程度和土壤肥力水平的一个指标。
2 方法选择及原理蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。
蔗糖酶活性的测定方法有用酶学的方法测量所产生的葡萄糖（滴定法或重量法）或是根据蔗糖的非还原性，用生成物（滴定法或重量法）能够还原菲林溶液中的铜，再根据生成的氧化亚铜的量计算出糖的含量。
也可根据蔗糖水解的生成物与某种物质（3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成的有色化合物进行比色测定。
还有一种方法，根据蔗糖液酶促反应前后光偏振面的变化（旋光法）进行测定。
3 比色法3.1试剂配制（1）20%蔗糖。
（2）甲苯。
（3）pH5.5醋酸盐缓冲液：取120ml冰醋酸用水稀释至1L（a），取164g无水CH3COONa 溶于水并稀释至1L（b）。
将（a）与（b）二液按1：8混合再用电位计校正pH。
（4）0.2M Na2HPO4·12H2O。
（5）钼溶液：配制5%钼酸铵水溶液（a），再取200ml浓H2SO4加水800ml（b）。
使用前将两夜按1：1混合。
（6）铜试剂：取50g CuSO4·5H2O溶于500ml水中（a），取25g Na2CO3、25g酒石酸钾钠、20g NaHCO3和200g Na2SO4溶于水并稀释至1L再加几滴甲苯（b）。
使用前将两液混合。
（7）标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50—58 O C条件下真空干燥至恒重。
然后取500mg溶于100ml甲苯酸溶液中（5mg还原糖/ml），即成标准葡萄糖溶液。
再用标准液制成1ml含0.01—0.5mg葡萄糖的工作溶液。
3.2标准曲线绘制：葡萄糖标准溶液稀释成1ml含1mg还原糖工作液。
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蔗糖合成酶（分解方向；SS-I）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号:BC4310
规格:50T/24S
产品内容：
提取液：液体30mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体8mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。
临用前加入2.5mL试剂一充分溶解待用，用不完的试剂建议分装后，-20℃保存，避免反复冻融。
试剂三：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。
标准品：粉剂×1支，20mg果糖；4℃保存。
临用前加入1mL蒸馏水溶解，配成20mg/mL果糖溶液备用。
4℃保存一周。
产品简介：
蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，SS）是植物糖代谢过程的关键酶，负责催化蔗糖分解与合成的可逆反应，其分解活性可以催化蔗糖水解成UDPG与果糖，参与淀粉、纤维素和半纤维素的合成等代谢途径。
分解方向SS-I催化蔗糖和UDP生成果糖与UDPG，果糖与3,5-二硝基水杨酸反应生成在540nm有特征吸收峰的棕红色物质，通过测定540nm处吸光值变化可计算得SS-I活性。
试验中所需的仪器和试剂：
可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。
操作步骤：
一、粗酶液提取：
组织：按照质量（g）:提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，8000g，离心10min，取上清置于冰上待测。
二、测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
2、将20mg/mL标准液用蒸馏水稀释为5、4、
3、2、1mg/mL的标准溶液备用。
3、操作表：(在1.5mL离心管中操作)
试剂名称（µL）对照管测定管标准管空白管样本2020--标准溶液--20-
蒸馏水---20
试剂一808080
试剂二-80--混匀，30℃水浴30min后，95℃水浴10min（盖紧，防止水分散
失）。
试剂三100100100100
混匀，沸水浴5min（盖紧，防止水分散失），冷却至室温。
蒸馏水800800800800
混匀，置于1mL玻璃比色皿中，测定540nm处吸光值A，分别记为A对照管，A测定管，A标准管，A空白管。
计算ΔA=A测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。
每个测定管需设一个对照管，标准曲线只需检测一次。
三、SS-I活性计算
1、标准曲线的绘制：
以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程
y=kx+b，将ΔA带入方程得到x（mg/mL）
2、SS-I活性的计算：
（1）按蛋白浓度计算
酶活定义：每mg蛋白每分钟分解蔗糖产生1µg果糖为1个酶活力单位。
SS-I酶活（U/mg prot）=x×V提取÷（V提取×Cpr）×103÷T=33.33x÷Cpr。
（2）按样本质量计算
酶活定义：每g样品每分钟分解蔗糖产生1µg果糖为1个酶活力单位。
SS-I酶活（U/g鲜重）=x×V提取×103÷W÷T=33.33x÷W。
V提取：提取液体积，1mL；103：单位换算系数，1mg=103µg；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间：30min。
注意事项
1.当A或ΔA超过1时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。
2.95℃水浴时EP管盖紧，防止水分散失，待冷却至室温后，再进行下一步操作，避免液体飞溅烫伤以及
影响试验数据。