基因工程课件
合集下载
高中生物基因工程课件
毒性和提高免疫原性。
基因工程疫苗的应用
03
预防传染病，如乙型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗等，降低人
群发病率。
基因工程抗体
基因工程抗体的种类
包括单克隆抗体、双特异性抗体、人源化抗体等。
基因工程抗体的制备
通过基因工程技术克隆和表达抗体的重链和轻链可变区基因，与适 当的恒定区基因融合，在哺乳动物细胞中表达。
公众参与与透明度
加强公众参与和透明度，促进利益相关方的对话 和协商，共同制定符合各方利益的决策。
3
国际合作与协调
加强国际合作与协调，共同制定国际性的伦理准 则和法律法规，促进全球范围内的公平和平等。
谢谢
THANKS
生物固氮
通过基因工程技术将固氮基因转入植物，提高植 物的固氮能力，减少化肥使用。
生物农药
通过基因工程技术生产具有杀虫、杀菌作用的生 物农药，减少化学农药的使用。
基因编辑技术
利用基因编辑技术如CRISPR-Cas9等对作物进行 精确的基因改造，提高作物的抗逆性和产量。
05 基因工程与环境保护
CHAPTER
生物的遗传性状。
基因工程原理
基因工程基于分子生物学和遗传学 原理，通过改变生物体的基因组， 实现对生物性状的遗传改良。
基因工程操作步骤
基因工程的操作步骤包括基因克隆 、载体构建、受体细胞转化、基因 表达和产物分离纯化等。
基因工程的历史与发展
基因工程的起源
基因工程的未来发展
基因工程起源于20世纪70年代，当时 科学家发现了限制性内切酶和DNA连 接酶，为基因操作提供了工具。
基因工程在土壤修复中的应用
土壤修复是指通过各种手段改善土壤质量，降低土壤污染 对环境和人体健康的影响。基因工程技术可以帮助我们培 育出具有特定功能的植物，用于土壤修复。
高中生物基因工程pt课件
• 大肠杆菌的质粒：
最常用的质粒是大 肠杆菌的质粒;其中常 含有抗药基因;如四环 素的标记基因 质粒的 存在与否对宿主细胞生 存没有决定性作用;但 复制只能在宿主细胞内 成
原核细胞的基因结构补充内容
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
非编码区 编码区下游
终止子
与RNA聚合酶结合位点
原核 细胞 的 基因 结构
工的 在基因操作的基本步骤中;不进行碱基
互补配对的步骤是
C
A 人工合成目的基因
B 目的基因与运载体结合
C 将目的基因导入受体细胞
D 目的基因的检测和表达
B 限制性内切酶用于目的基因的获得
C 目的基因须由运载体导入受体细胞
D 人工合成目的基因不用限制性内切酶
练习
4有关基因工程的叙述正确的是
D
A 限制酶只在获得目的基因时才用
B 重组质粒的形成在细胞内完成
C 质粒都可作为运载体
D 蛋白质的结构可为合成目的基因提供资 料
练习
5基因工程是在DNA分子水平上进行设计施
基因
结构 非编码区 ：有调控作用;上游有启动子;下
游有终止子
非编码序列： 包括非编码区和内含子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
不同点 相同点
原核细胞
真核细胞
编码区是 _连__续__的
编码区是间隔的 __不__连_的续
都由能够编码蛋白质的_编__码__区_和具 有调控作用的非__编__码__区组成的
④利用PCR技术扩增目的基因
PCR——聚合酶链式反应
是一项生物体外复制特定DNA片 段的核酸合成技术 通过此技术;可获取 大量的目的基因
DNA序列自动测序仪： 对提取出来的
《基因工程说课》课件
《基因工程说课》ppt课 件
CATALOGUE
目 录
• 基因工程简介 • 基因工程的基本技术 • 基因工程实验操作流程 • 基因工程的安全与伦理问题 • 未来展望
01
CATALOGUE
基因工程简介
基因工程的定义
基因工程是指通过人工操作将外源基因导入细胞或生物体内，以改变其遗传物质， 从而达到改良生物性状、生产生物制品或治疗遗传性疾病目的的技术。
基因工程是生物工程的一个重要分支，它利用分子生物学和分子遗传学的原理和技 术，对生物体的遗传物质进行操作和改造。
基因工程的基本操作包括基因克隆、基因转移、基因表达和基因沉默等，这些技术 为人类提供了强大的工具来探索和利用生命系统的奥秘。
基因工程的历史与发展
基因工程的起源可以追溯到20世纪70 年代初期，当时科学家们开始探索限制 性内切酶和DNA连接酶等基本工具，
健康风险
基因工程可能对人类健康产生负面 影响，如基因治疗中的副作用。
安全风险
基因工程可能被用于制造生物武器 或生物恐怖主义。
基因工程的伦理问题
人类基因编辑
基因资源与知识产权
基因工程应用于人类胚胎编辑可能引 发一系列伦理问题，如设计婴儿等。
基因资源属于全人类共享的遗产，涉 及知识产权和利益分配问题。
为基因操作奠定了基础。
1973年，美国科学家斯坦利·柯恩和赫 伯特·博耶利用限制性内切酶和DNA连 接酶，成功地将SV40病毒的DNA切割 并重新连接，从而实现了第一个重组
DNA分子。
自此以后，基因工程技术不断发展，逐 渐形成了完整的理论体系和技术体系， 并在医学、农业、工业和基础研究中得
到了广泛应用。
基因歧视
基因信息可能被用于歧视某些人群， 如保险、就业等方面。
CATALOGUE
目 录
• 基因工程简介 • 基因工程的基本技术 • 基因工程实验操作流程 • 基因工程的安全与伦理问题 • 未来展望
01
CATALOGUE
基因工程简介
基因工程的定义
基因工程是指通过人工操作将外源基因导入细胞或生物体内，以改变其遗传物质， 从而达到改良生物性状、生产生物制品或治疗遗传性疾病目的的技术。
基因工程是生物工程的一个重要分支，它利用分子生物学和分子遗传学的原理和技 术，对生物体的遗传物质进行操作和改造。
基因工程的基本操作包括基因克隆、基因转移、基因表达和基因沉默等，这些技术 为人类提供了强大的工具来探索和利用生命系统的奥秘。
基因工程的历史与发展
基因工程的起源可以追溯到20世纪70 年代初期，当时科学家们开始探索限制 性内切酶和DNA连接酶等基本工具，
健康风险
基因工程可能对人类健康产生负面 影响，如基因治疗中的副作用。
安全风险
基因工程可能被用于制造生物武器 或生物恐怖主义。
基因工程的伦理问题
人类基因编辑
基因资源与知识产权
基因工程应用于人类胚胎编辑可能引 发一系列伦理问题，如设计婴儿等。
基因资源属于全人类共享的遗产，涉 及知识产权和利益分配问题。
为基因操作奠定了基础。
1973年，美国科学家斯坦利·柯恩和赫 伯特·博耶利用限制性内切酶和DNA连 接酶，成功地将SV40病毒的DNA切割 并重新连接，从而实现了第一个重组
DNA分子。
自此以后，基因工程技术不断发展，逐 渐形成了完整的理论体系和技术体系， 并在医学、农业、工业和基础研究中得
到了广泛应用。
基因歧视
基因信息可能被用于歧视某些人群， 如保险、就业等方面。
基因工程-课件ppt
(7)用于载体的质粒 DNA 分子上至少含一个限制酶识别位点(√ )
(8)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在
并表达
(√)
在日常生 活中， 随处都 可以看 到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
2．载体需具备的条件及其作用(连线)
对点落实
返回
1．(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个 DNA 片段上依次表示出了
EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和 Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列
与 切 割 位 点 ， 图 (b) 为 某 种 表 达 载 体 的 示 意 图 ( 载 体 上 的
EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
↓
↓
↓
——GAATTC—— ——GGATCC—— ——GATC——
返回
(2)写出产生的末端的种类：①产生的是黏性末端；②产生的 是 平末端 。 (3)EcoRⅠ限制酶和 SmaⅠ限制酶识别的碱基序列 不同，切割 位点不同 (填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性 。
在日常生 活中， 随处都 可以看 到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
图(b)
图(c)
(3)DNA 连接酶是将两个 DNA 片段连接起来的酶，常见的
有__E_·_c_o_l_i__D_NA_连__接__酶_和____T_4D_N_A_连___接__酶___，其中既能连接黏 性末端又能连接平末端的是__T_4D_N_A__连__接__酶___。
解析
在日常生 活中， 随处都 可以看 到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
《基因工程专题》课件
通过基因工程改造细胞和微生物，可 以用于药物生产、疾病治疗和疫苗研 发，提高治疗效果和降低成本。
人类社会面临的挑战和机遇
伦理和安全问题
基因工程技术的发展和应用涉及到伦理和安全问题，如基因编辑 技术的滥用、基因歧视和生态风险等。
法律和监管问题
随着基因工程技术的广泛应用，相关的法律和监管体系需要进行调 整和完善，以确保技术的合理应用和发展。
04
基因工程的伦理和社会问题
基因工程的伦理问题
基因工程的道德地位
基因工程涉及到对生命本质的干预，因此引发了关于其道 德地位的讨论。一些人认为这是对自然的一种干预，而另 一些人则认为这是科技进步的必然结果。
基因歧视
由于基因信息可能揭示个人健康、行为等方面的信息，因 此存在基因歧视的风险。这可能导致保险、就业等方面的 歧视。
03
基因工程的应用实例
农业基因工程
抗虫作物
通过基因工程技术，将抗虫基 因导入作物，使其具有抗虫能
力，减少农药使用。
抗病作物
通过基因工程技术，增强作物 的抗病能力，降低作物病害的 发生率。
高产作物
通过基因工程技术，提高作物 的产量和品质，满足不断增长 的食物需求。
转基因动物
通过基因工程技术，培育出具 有优良性状的转基因动物，如
基因工程专
contents
目录
• 基因工程概述 • 基因工程的基本技术 • 基因工程的应用实例 • 基因工程的伦理和社会问题 • 未来展望
01
基因工程概述
基因工程概述
基因工程是指通过人工操作对 生物体的基因进行修饰、改造 和重组的技术。
它利用现代分子生物学技术， 在分子水平上对基因进行操作 ，从而实现对生物性状的改变 。
基因工程第1讲概论课件
为基因工程技术的诞生典定了理论基础。
理论上的可行性。
41
二、分子遗传学新方法是基因工程的 技术基础（六大技术）
首当其冲的是要解决: ① 如何自如地得到目的基因； ② 如何在体外改造基因，得到重 组体； ③ 如何在体外转移重组基因；
直到20世纪70年代中期，相继出现了 几项关键性技术，梦想成真。
42
实际上的可操作性 材料、实验条件、时空条件、
经济条件和政策。 基础方面的基本条件（可能性+ 可行性+ 可操作性）具备, 尚需人的科学创新 思维+ 艰苦的实践。才能得到创新的发明、 发现
49
1970年, MIT 的 科学家率先提出在体 外把不同来源的遗传 物质进行重组的设想, 但遭到反对, 不予支
50
办
不
不
到
到
的
的
22
第一节 基因工程的 发生与发展
23
一、基因工程诞生的理论基础
2生物遗传的物质基础是 DNA 肺炎链球菌光滑型和粗糙型的转化 试验
24
● 1944年, 美 国微生物学家 Avery证明基 因就是DNA分 子, 提出 DNA 是遗传信息的 载体。
32
遗 传 密 码 表
目 录33
mRNA分子上从5 至3 的方向,每3个核 苷酸构建一个密码子, 编码某一特定氨基酸或 作为蛋白质合成的起始、终止信号, 称为三联 体密码(triplet codon), 也称遗传密码子(genetic codon)。
解决了信息语言的对应关系。
34
•密码: 43 = 64
14
（4）利用重组DNA技术可以在体外大 量扩增、纯化人们感兴趣的基因, 研 究其结构、功能及调控机制, 从而拓 宽了分子生物学的研究领域。
理论上的可行性。
41
二、分子遗传学新方法是基因工程的 技术基础（六大技术）
首当其冲的是要解决: ① 如何自如地得到目的基因； ② 如何在体外改造基因，得到重 组体； ③ 如何在体外转移重组基因；
直到20世纪70年代中期，相继出现了 几项关键性技术，梦想成真。
42
实际上的可操作性 材料、实验条件、时空条件、
经济条件和政策。 基础方面的基本条件（可能性+ 可行性+ 可操作性）具备, 尚需人的科学创新 思维+ 艰苦的实践。才能得到创新的发明、 发现
49
1970年, MIT 的 科学家率先提出在体 外把不同来源的遗传 物质进行重组的设想, 但遭到反对, 不予支
50
办
不
不
到
到
的
的
22
第一节 基因工程的 发生与发展
23
一、基因工程诞生的理论基础
2生物遗传的物质基础是 DNA 肺炎链球菌光滑型和粗糙型的转化 试验
24
● 1944年, 美 国微生物学家 Avery证明基 因就是DNA分 子, 提出 DNA 是遗传信息的 载体。
32
遗 传 密 码 表
目 录33
mRNA分子上从5 至3 的方向,每3个核 苷酸构建一个密码子, 编码某一特定氨基酸或 作为蛋白质合成的起始、终止信号, 称为三联 体密码(triplet codon), 也称遗传密码子(genetic codon)。
解决了信息语言的对应关系。
34
•密码: 43 = 64
14
（4）利用重组DNA技术可以在体外大 量扩增、纯化人们感兴趣的基因, 研 究其结构、功能及调控机制, 从而拓 宽了分子生物学的研究领域。
《基因工程简介》课件
前沿的学科，将对医学、农业、环境和能源等领域带来深刻的变革和进步。了解基因工程的基本概 念、应用和挑战，是我们迎接未来科技发展的重要一步。
基因转导
将外源基因导入目标细胞，实 现基因功能的调控和表达。
基因编辑
利用CRISPR-Cas9等技术，对基 因组中的特定位置进行精确编 辑和改造。
基因工程的伦理和风险问题
1 伦理问题
基因工程涉及对生命和基因的控制，引发伦理和道德层面的反思和讨论。
2 风险问题
基因工程可能带来环境风险和基因突变等潜在问题，需要严格的安全评估和监管。
《基因工程简介》PPT课 件
基因工程是一门研究控制和改变生物基因组的学科。通过改变生物体基因组 的结构和组织，可以产生改善农作物、生产药物、治疗疾病等社会需求的生 物。
基因工程的定义
基因工程是一种重要的生物技术，利用现代分子遗传学和基因组学知识，设 计和操作基因的技术，以改变生物体的特征，实现对生命过程和物质转化的 控制。
农业生产
基因工程可以改良农作物，提高产 量和耐性，解决粮食安全和环境问 题，为农业生产带来巨大变革。
基因编辑
通过基因编辑技术，可以精确修改 和调整生物基因组，开辟了新的治 疗疾病和改良物种的途径。
基因工程的主要技术方法
基因克隆
将感兴趣的基因从一个物种转 移到另一个物种，以实现基因 的功能研究和应用。
3 社会问题
基因工程引发公众关注和争议，涉及科技发展与社会责任之间的平衡问题。
基因工程的未来发展趋势
精准医学
基因工程将深化个体基因组研究， 实现个体化治疗和预防，推动精 准医学的发展。
生物能源
基因工程技术有望提升生物能源 的生产效率，推动可再生能源的 发展和应用。
基因转导
将外源基因导入目标细胞，实 现基因功能的调控和表达。
基因编辑
利用CRISPR-Cas9等技术，对基 因组中的特定位置进行精确编 辑和改造。
基因工程的伦理和风险问题
1 伦理问题
基因工程涉及对生命和基因的控制，引发伦理和道德层面的反思和讨论。
2 风险问题
基因工程可能带来环境风险和基因突变等潜在问题，需要严格的安全评估和监管。
《基因工程简介》PPT课 件
基因工程是一门研究控制和改变生物基因组的学科。通过改变生物体基因组 的结构和组织，可以产生改善农作物、生产药物、治疗疾病等社会需求的生 物。
基因工程的定义
基因工程是一种重要的生物技术，利用现代分子遗传学和基因组学知识，设 计和操作基因的技术，以改变生物体的特征，实现对生命过程和物质转化的 控制。
农业生产
基因工程可以改良农作物，提高产 量和耐性，解决粮食安全和环境问 题，为农业生产带来巨大变革。
基因编辑
通过基因编辑技术，可以精确修改 和调整生物基因组，开辟了新的治 疗疾病和改良物种的途径。
基因工程的主要技术方法
基因克隆
将感兴趣的基因从一个物种转 移到另一个物种，以实现基因 的功能研究和应用。
3 社会问题
基因工程引发公众关注和争议，涉及科技发展与社会责任之间的平衡问题。
基因工程的未来发展趋势
精准医学
基因工程将深化个体基因组研究， 实现个体化治疗和预防，推动精 准医学的发展。
生物能源
基因工程技术有望提升生物能源 的生产效率，推动可再生能源的 发展和应用。
基因工程技术ppt课件
是指目的基因在受体细胞内表达，研究功能。
3
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
应用：
• 克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。 • 转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成,生产多肽
产品。 • 转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调
载体：
• 载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目 的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。
• 种类： 按来源分： 质粒载体(plasmid vector)、噬菌体载体(phage vector)、 柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector ). 按作用分： 克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、 穿梭载体(shuttle vector)
四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏 抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组 和非重组分子。 • 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停 止时，它仍能继续复制。
16
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
17
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
18
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程TA 源自隆AA19
3
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
应用：
• 克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。 • 转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成,生产多肽
产品。 • 转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调
载体：
• 载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目 的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。
• 种类： 按来源分： 质粒载体(plasmid vector)、噬菌体载体(phage vector)、 柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector ). 按作用分： 克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、 穿梭载体(shuttle vector)
四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏 抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组 和非重组分子。 • 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停 止时，它仍能继续复制。
16
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
17
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
18
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程TA 源自隆AA19
基因工程研究PPT课件
基因工程研究
体外 操作 与细 胞内 表达
(基因工程技术包括下列过程)
分─获取目的基因和载体 接─目的基因与载体的连接 转─重组DNA导入宿主细胞 筛─重组DNA的筛选 鉴─重组DNA的鉴定
可用以上五个字表示
(一)目的基因的分离(分)
目的基因:是指所要研究或应用的基因,也是需要克隆或表达 的基因。 (一) 目的基因的分离 1、基因分离的策略
同 源 多 聚 尾 连 接 法
三、将重组体导入受体细胞 (转)
根据受体生物,可将重组体导入受体细胞的方法主要分为大肠杆 菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法及动物细胞转化法
(一) 大肠杆菌转化法 1、氯化钙转化法(狭义的转化)或转染 感受态细胞(Competent Cell)的制备:用特殊方法处理,使细胞膜通透 性增加,从而具有摄取外源DNA的能力。 转化流程:感受态细胞和重组DNA混合,使DNA与钙离子形成复合物, 吸附于细胞表面,经42℃短暂(90s)的热处理,促进外源DNA进入感受态 细胞。
(三) 植物细胞转化法
1、农杆菌质粒介导法 农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。
它是利用根癌农杆菌的Ti (Tumor induce)质粒和发根农杆 菌的Ri (Root induce)质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染 植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并插 入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性, 可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整 合到受体染色体而获得稳定的表达。
4、同源多聚尾连接法
也称作人工接尾连接法 当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断,无 法得到相同得粘性末端时,可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平,再在末端核 苷酸转移酶的催化下,将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的 基因的3'-端,如载体上添加一段polyG,则可在目的基因上添 加一段polyC,故二者即可通过碱基互补进行粘合,再由DNA连 接酶连接。
体外 操作 与细 胞内 表达
(基因工程技术包括下列过程)
分─获取目的基因和载体 接─目的基因与载体的连接 转─重组DNA导入宿主细胞 筛─重组DNA的筛选 鉴─重组DNA的鉴定
可用以上五个字表示
(一)目的基因的分离(分)
目的基因:是指所要研究或应用的基因,也是需要克隆或表达 的基因。 (一) 目的基因的分离 1、基因分离的策略
同 源 多 聚 尾 连 接 法
三、将重组体导入受体细胞 (转)
根据受体生物,可将重组体导入受体细胞的方法主要分为大肠杆 菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法及动物细胞转化法
(一) 大肠杆菌转化法 1、氯化钙转化法(狭义的转化)或转染 感受态细胞(Competent Cell)的制备:用特殊方法处理,使细胞膜通透 性增加,从而具有摄取外源DNA的能力。 转化流程:感受态细胞和重组DNA混合,使DNA与钙离子形成复合物, 吸附于细胞表面,经42℃短暂(90s)的热处理,促进外源DNA进入感受态 细胞。
(三) 植物细胞转化法
1、农杆菌质粒介导法 农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。
它是利用根癌农杆菌的Ti (Tumor induce)质粒和发根农杆 菌的Ri (Root induce)质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染 植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并插 入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性, 可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整 合到受体染色体而获得稳定的表达。
4、同源多聚尾连接法
也称作人工接尾连接法 当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断,无 法得到相同得粘性末端时,可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平,再在末端核 苷酸转移酶的催化下,将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的 基因的3'-端,如载体上添加一段polyG,则可在目的基因上添 加一段polyC,故二者即可通过碱基互补进行粘合,再由DNA连 接酶连接。
分子生物学原理--基因工程ppt课件
分子生物学原理
整合
• 整合： 噬菌体感染大肠杆菌的第一步
噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。 此 DNA可与细菌染色 体重组，成为细菌染色体的一部分。
• 溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。
• 裂解： 噬菌体感染大肠杆菌的第二步
DNA利用菌体的酶系统，复制自身及 外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并将 细菌涨破。
第十四章 基因重组与基因工程
10/28/2024
分子生物学原理
基因重组：genomic recombination 重组DNA：recombinant DNA
10/28/2024
分子生物学原理
第一节、自然界的基因重组
• 转化：transformation • 整合：integration • 转导：transduction • 转位：transposition
10/28/2024
分子生物学原理
转位
• 转位：一个或一组基因从一处转到基因 组的另一个位置。
• 这些游动的基因称为转位子(transposon)。
10/28/2024
分子生物学原理
转 位
10/28/2024
分子生物学原理
第二节、基因工程
• 基因工程：是用分离纯化或人工合成的 DNA在体外与载体DNA结合，成为重组 DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重 组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩 增，成为克隆。也叫基因克隆或重组 DNA技术。
切割后与原来载体比较。
• 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：用目 的基因作探针监测宿主DNA是否重组体。
10/28/2024
分子生物学原理
DNA重组体的筛选与鉴定
•灭 活法筛 选重组 体。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
EcoR I 5’-GAATTC-3’ EcoR V 5’-GATATC-3’
3’-CTTAAG-5’
3’-CTATAG-5’
Pst I 5’-CTGCAG-3’
3’-GACGTC-5’
产生平齐末端
产生粘性末端
（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。
2. DNA的甲基化程度
大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：
dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。
基因工程中必须使用甲基化酶 失活突变的菌株。
3. 温度
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。 大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。
酶 Apa I Bcl I Mae II Taq I
Tris-HCl：
维持pH；
二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；
牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；
五、限制性内切酶对DNA的消化
1. 内切酶与识别序列的结合模式
1986年J.A. McClarin等通过X射线 晶体衍射发现II类限制酶是以同型 二聚体的形式与靶序列结合。
GAATTC CTTAAG
最适温度oC 酶
30
Apy I
50
BstE II
50
Mae III
65
最适温度oC 酶
30
Ban I
60
Mae I
55
Sma I
最适温度oC 50 45 25
4. 缓冲液(Buffer) 是影响限制酶活性的重要因素。
商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。 （1）缓冲液的化学组成
MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度；
4. 限制酶前面要带上R（Restriction)， 修饰酶前面要带上M（Modification）。 （现已省略）。
四、影响限制性内切酶活性的因素
1. DNA的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、 SDS、EDTA等都会影响酶的活性。
一般采取
①纯化DNA ②加大酶的用量 ③延长保温时间 ④ 扩大反应体积（ >20l）
② 不完全同裂酶： 识别位点相同，但切点不同。
如Xma I 和 Sma I。
Xma I Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
（6）同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。 如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等
③ 补平成平齐末端
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成 平齐末端。
（5）同裂酶（Isoschizomers) 识别位点的序列相同的限制性内切酶。
① 完全同裂酶：
识别位点和切点完全相同。
如Hind Ⅲ 和Hsu I。
Hind Ⅲ Hsu I
5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
① Dam甲基化酶 GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基
② Dcm甲基化酶
CCAGG或CCTGG序列在第二 个C上C5位置上引入甲基
二、限制性内切酶的类型 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。 I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶
1. I型限制性内切酶
首先由M. Meselson和R. Yuan在1968 年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。
5. 几种常用限制酶识别位点
6. 限制性内切酶识别序列的交叉列表
**** ****
**** **** A****T A****T
A****T A****T A****T
AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG
MaeII Alu I
HpaⅡc MspIc
ApoI
HindⅢ
Nla Ⅲ Afl III
2. 完全消化 内切酶在DNA上的所有识别位点都 被切开。 1 23 4
12 3 4
3. 局部消化 只有有限数量的酶切位点被切开。 1 23 4
1
?4
通过缩短保温时间、降低反应温度或减 少酶的用量可达到局部消化的目的。
4. 限制酶酶切反应的终止
大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。 或用乙醇沉淀DNA。
SmaI
NgoMI BsrFI
G****C G****C G****C G****C
AATT
ACGT BseHI
AatII
T****A T****A T****A
T****A T****A
SnaBI BsaAI
AGCT
Ecl136II
SacI BanII HgiAI Bsp1286
ATAT CATG CCGG
AgeI BsrFI
SspI
A****T C****G
AATT
ACGT AGCT
ATAT
C****G C****G
C****G C****G G****C
EcoRI ApoI
Pml I BsaAI
PvuII NspBII
NdeI
CATG CCGG Nsp7524
NcoI StyI Dsa I
XmaI AvaI
Hga I 5’ GACGCNNNNN 3’ CTGCGNNNNNNNNNN
3. III类限制性内切酶
在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要 ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG
在基因工程操作中用途不大。
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用 Hin表示。
2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或
型。如Ecok, EcoR（现在都写成平行，
如EcoRI）。 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种 不同的限制与修复系统，用罗马字 母表示。如EcoR I，EcoR V。
A 用于核酸操作的工具酶
Enzymes
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 核酸外切酶 单链DNA内切酶
第一节 限制性核酸内切酶
一、限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease）
是一类能够识别双链DNA分子中的某 种特定核苷酸序列（4—8bp），并由 此处切割DNA双链的核酸内切酶。
EcoRV
NaeI
SphI Nsp7524
BspHI BspMII
****
**** **** **** A****T A****T
A****T A****T A****T
CGCG BstUI
CTAG BfaI
GATC GCGC MboIc Sau3AIc
HinpI
DpnI
HhaI
GGCC HaeIII
2. II类限制性内切酶 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在 1970年从流感嗜血菌中分离出来。 分离的第一个酶是Hind Ⅱ
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的双链DNA上的特殊 靶序列（多数是回文序列）。
与DNA的来源无关。
（2）切割位点ຫໍສະໝຸດ 识别位点处。切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：
MluI Afl III
SpeI
Bgl II BstYI
Eco47III StuI
A****T C****G
C****G C****G C****G C****G G****C
CGCG DsaI
NspBII SacII BssHII
CTAG AvrII StyI
NheI
GATC HaeII
GCGC GGCC
分两种类型： ① 5’端凸出（如EcoR I切点）
5’-
GAATTC
-3’
3’-
CTTAAG
-5’
5’-
G AATTC
-3’
3’-
CTTAA G
-5’
② 3’端凸出（如Pst I切点）
5’-
CTGCAG
-3’
3’-
GACGTC
-5’
5’-
CTGCA
G
-3’
3’-
G
ACGTC
-5’
（4）粘性末端的意义 ①连接便利
EagI EaeI GdiII
2种不同的亚基
Mg2+
ATP、 Mg2+和SAM
回文序列 （IIs型除外）
EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG
切割位点
在距离识别位点 至少1000
bp处随机切开一 条单链。
酶催转换
不能
DNA易位作用
能
甲基化作用的位点
寄主特异性位点
识别未甲基化的序列进 能 行切割
序列特异的切割
不是
基因工程中的用途
无用
位于寄主特异性 距寄主特异性位 位点或其附近 点3‘端24—
26bp处
能
能
不能
不能
寄主特异性位点 寄主特异性位点
能
能
是
是
十分有用
三、限制性内切酶的命名
1973年H.O Smith和D. Nathans提议 的命名系统，命名原则如下：
1.用属名的第一个字母和种名的头两个字 母组成3个字母的略语表示寄主菌的物 种名。
BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
Bgl Ⅱ